畜牧兽医学报  2024, Vol. 55 Issue (2): 860-866. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.02.042    PDF    
引用本文
张靖鹏, 陈翠腾, 林琳, 付环茹, 李兆龙, 江斌, 黄瑜, 万春和. 鸽微RNA病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 畜牧兽医学报, 2024, 55(2): 860-866.  
ZHANG Jinpeng, CHEN Cuiteng, LIN Lin, FU Huanru, LI Zhaolong, JIANG Bin, HUANG Yu, WAN Chunhe. Establishment of a Real-time Fluorescent RT-PCR Assay for Detection of Pigeon Megrivirus[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2024, 55(2): 860-866.  
鸽微RNA病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立
张靖鹏, 陈翠腾, 林琳, 付环茹, 李兆龙, 江斌, 黄瑜, 万春和     
福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省禽病防治重点实验室/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心, 福州 350013
收稿日期：2023-04-06
基金项目：福建省公益类项目(2021R1026001;2021R1026006;2023R1076;2023R1077);福建省自然科学基金项目(2020J06029);现代农业产业体系项目(CARS-42);福建省农业科学院科技计划项目(CXPT202108;CXTD2021005;YCZX202412;DWHZ2024-13)
作者简介：张靖鹏(1988-), 男, 福建屏南人, 助理研究员, 硕士, 主要从事动物传染病研究, E-mail: 870063543@qq.com.
通信作者：万春和, 主要从事家禽新发传染病防控技术研究, E-mail: chunhewan@126.com.
摘要：旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus, PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物, 从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株), 并对其3C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析, 明确其基因特征后, 设计特异性实时荧光定量RT-PCR检测(RT-qPCR)引物组, 建立检测PiMeV的RT-qPCR方法。结果显示: PiMeV-CHN001株3C基因全长为591 bp, 编码197个氨基酸, 和其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)核苷酸相似性分别为89.5%和92.0%。建立的检测PiMeV的RT-qPCR方法的标准曲线Y轴截距为37.93, 斜率为-3.335, 相关系数为1.00, 扩增效率为99.4%。特异性强, 仅PiMeV出现特异性扩增信号和特异性峰值[Tm值为(81.69±0.22)℃], 对鸽源禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)、鸽源禽I型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type I, PPMV-1)、鸽输血传播病毒(pigeon torque teno virus, PTTV)、鸽腺病毒(pigeon adenovirus, PiAd)及鸽圆环病毒(pigeon circovirus, PiCV)检测均未见特异性扩增信号; 敏感性优, 最低检测限为54.0拷贝·μL-1; 重复性好, 批内和批间变异系数均低于1.5%。用建立的检测方法对42份信鸽粪便样品进行检测, 发现2份阳性样品(阳性率为4.76%)。本研究首次证实我国大陆地区信鸽中存在PiMeV, 丰富了PiMeV宿主谱信息; 建立的RT-qPCR方法为后续开展PiMeV流行病学研究提供支撑。
关键词：信鸽    鸽微RNA病毒    3C基因    序列分析    实时荧光定量RT-PCR方法    
Establishment of a Real-time Fluorescent RT-PCR Assay for Detection of Pigeon Megrivirus
ZHANG Jinpeng, CHEN Cuiteng, LIN Lin, FU Huanru, LI Zhaolong, JIANG Bin, HUANG Yu, WAN Chunhe     
Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine/Fujian Key Laboratory for Avian Diseases Control and Prevention/Fujian Animal Diseases Control Technology Development Center, Fuzhou 350013, China
Corresponding author: WAN Chunhe, E-mail: chunhewan@126.com.
Abstract: The present study aimed to establish a novel real-time fluorescent RT-PCR assay for detection of pigeon megrivirus (PiMeV). Specific primers were designed based on PiMeVs sequences download from the GenBank, and positive fragments (designated as PiMeV-CHN001 strain) were amplified from racing pigeon feces. Then the 3C gene of PiMeV-CHN001 strain was obtained and analyzed. Based on the 3C molecular characterization, a real-time fluorescent RT-PCR method (RT-qPCR) was developed using the specific primers. The results demonstrated the 3C gene of PiMeV-CHN001 strain had 591 bp (coding 197 amino acids), with the nucleic acid sequence homology with other wild urban pigeons (Columba livia) (MeV-B1 strain and MeV-B2 strain) was 89.5% and 92.0%, respectively. The RT-qPCR assay standard curve had the axial intercept of standard curve was 37.93 and the slope was -3.335, with a linear correlation (R2) of 1.00 and efficiency of 99.4%. The methods were specificity, no-cross amplification signal was found from other pigeon viruses (such as avian influenza virus, pigeon paramyxovirus type I, pigeon torque teno virus, pigeon adenovirus, and pigeon circovirus). Only one specific peaked with a melting temperature (Tm) was (81.69±0.22) ℃ form PiMeV-CHN001, with no primer-dimers peak represent. The lowest limit of detection concentration was 54.0 copies/μL. The intra-and inter-assay were less than 1.5% according to the repeatability test. The developed qPCR was used for PiMeV detection of 42 racing pigeon feces. 2 positive (positive rate was 4.76%) signals were found. In conclusion, we firstly confirmed the presence of PiMeV in racing pigeons in Mainland China, and the data can enrich Megrivirus host spectrum. Moreover, the developed RT-qPCR assay also lays good foundation for further PiMeV epidemiological investigation.
Key words: racing pigeon    pigeon megrivirus    3C gene    sequence analysis    real-time fluorescent quantitative RT-PCR assay    

根据国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)[1]的分类，微RNA病毒属(Megrivirus)属于小核糖核酸病毒科Kodimesavirinae亚科，微RNA病毒属有5个病毒种(Species)，分别为微RNA病毒A型、微RNA病毒B型、微RNA病毒C型、微RNA病毒D型和微RNA病毒E型。

Megrivirus在一些患病的禽类中被鉴定，如在患火鸡病毒性肝炎的火鸡肝、肠道和泄殖腔拭子中均检测到Megrivirus[2]，但其对宿主是否致病及致病力如何尚未见相关报道。2013年，Phan等[3]在匈牙利与中国香港地区的野鸽粪便中均发现存在Megrivirus，将其命名为鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus，PiMeV)(MeV-B1株和MeV-B2株)，ICTV根据其基因特点将其划入微RNA病毒B型，但未见进一步研究报道。

微RNA病毒是一类单股正链RNA病毒，无囊膜、呈球形、直径20~30 nm。病毒基因组大小为6 000~9 700 bp[4]，多数含有一个大的开放阅读框(open reading frame，ORF)，编码一个大的多聚蛋白(polyprotein)。多聚蛋白一般由结构蛋白P1和2个非结构蛋白(P2和P3)组成。结构蛋白P1在蛋白酶的作用下分解为4种衣壳蛋白：VP1、VP2、VP3和VP4。P2和P3分解为7种非结构蛋白：2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D[5]。本研究根据GenBank中PiMeV代表株(MeV-B1株和MeV-B2株)序列特征设计检测引物，从1例腹泻综合征信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株)，为中国大陆地区信鸽群中首次发现该病。随后基于3C基因特征，建立检测PiMeV的实时荧光定量RT-qPCR方法，为后续开展PiMeV流行病学调查奠定了基础。

1 材料与方法 1.1 毒株和菌株

鸽源禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)、鸽源禽I型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type I，PPMV-1)、鸽输血传播病毒(pigeon torque teno virus，PTTV)、鸽腺病毒(pigeon adenovirus，PiAd)及鸽圆环病毒(pigeon circovirus，PiCV)[6-8]均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定并保存。

1.2 主要试剂与耗材

实时荧光定量试剂盒qPCR SuperMix Universal购自赛默飞(Thermo Fisher)公司；病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit、脱氧核糖核酸酶I(DNase I)、反转录试剂盒Reverse Transcriptase、PCR扩增试剂盒2×TransTaq-T PCR SuperMix和T克隆载体试剂盒pEASY-T1 Simple Cloning Kit、胶回收试剂盒Quick Gel Extraction Kit和质粒小量提取试剂盒Plasmid MiniPrep Kit均购自北京全式金生物技术有限公司；荧光定量八排管(PCR-0208-C)购自爱思进(Axygen)公司；其他常规化学试剂和耗材，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 目的基因的克隆

1.3.1 序列扩增 　　参考GenBank上登录的PiMeV代表株3C基因保守序列特征设计特异性检测引物组(PiMeVF1和PiMeVR1，引物序列：PiMeVF1:5′-GAGCRACCTTYCTTGGCTTTATC-3′, PiMeVR1:5′-TTCAAGTTCTTTCCAKGCYTTCTG-3′)，预期扩增片段长度974 bp。

向信鸽粪便中加入灭菌PBS(体积比为1∶3)混匀，反复冻融3次，4 000 r·min-1离心20 min，吸取上清液，利用EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取病毒总RNA后将其反转录为cDNA，对其进行目的基因扩增，对RT-PCR产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定后克隆测序。

1.3.2 序列分析 　　将3C基因测序结果在NCBI上进行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析，并和数据库中的其他微RNA病毒进行分析比较，并绘制其遗传进化关系[9]。本研究使用的毒株信息见表 1。

表 1 本研究涉及到的毒株信息 Table 1 Information of megriviruses used in this study
1.4 实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

1.4.1 引物设计 　　根据“1.3”中3C基因设计特异性的RT-qPCR的引物，引物序列：Mes2-1F：5′-CCCACTTCTGTCCCTGAATAAG-3′；Mes2-1R：5′-CCAGGGCAAGGTCTTCTTTAT-3′，预期片段大小为110 bp。

1.4.2 标准曲线的建立 　　以“1.3”中含有3C基因的阳性质粒(命名为T-3C)为本研究的阳性标准品。利用微量核酸测定仪测定其浓度后，换算成拷贝数(5.4×1010拷贝·μL-1)，进行10连续倍比稀释后备用。按照荧光定量试剂盒说明书配制20 μL的实时荧光定量RT-PCR反应体系，在不同引物终浓度(0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 μmol·L-1)对退火温度(56、58、60和62 ℃)进行反应条件优化。反应结束后，用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数(5.4×101~5.4×106拷贝·μL-1)的常用对数(log quantity)为横坐标，以循环数阈值(cycle threshold，Ct值)为纵坐标，绘制出RT-qPCR反应的标准线性回归方程(标准曲线)。

1.4.3 特异性、敏感性和重复性试验 　　用优化后的RT-qPCR反应条件分别对鸽常见的病原(如AIV、PPMV-1、PTTV、PiAd和PiCV)进行检测，评价建立方法的特异性。以连续倍比稀释的质粒标准品为模板，进行RT-qPCR反应，确定最小检测限。用建立的实时荧光定量RT-PCR方法分别对标准品质粒(含量为5.4×102、5.4×104、5.4×106拷贝·μL-1)进行检测，每种标准品含量重复3次，计算批内(intra-group)变异系数。分别将上述标准品分装后置于-20 ℃保存，每隔7 d取出，共检测3次，计算批间(inter-group)变异系数。

1.5 临床样品检测

对临床收集的42份信鸽粪便，按照“1.3.1”进行处理后，用本研究建立的RT-qPCR检测方法和常规RT-PCR方法平行检测，验证两种检测方法之间的符合率。

2 结果 2.1 3C基因序列分析

使用特异性引物对(PiMeV1/ PIMeVR1)扩增出约974 bp的目的条带，含有完整3C基因编码区，其中3C基因全长为591 bp，编码197个氨基酸。通过序列检索发现PiMeV存在半胱氨酸蛋白酶((cysteine protease)的特征基序为GFCG。核苷酸相似性分析可见，PiMeV-CHN001株与GenBank中其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)核苷酸同源率分别为89.5%和92.0%，氨基酸相似性分别为97.5%和99.5%。与Megrivirus属的其余成员的核酸相似性为52.7~57.4%，与Picornaviridae科中部分感染禽类的病毒的相似性均低于46.9%。遗传进化分析结果(见图 1)显示，PiMeV-CHN001株与GenBank中其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)处于同一遗传进化分支(Megrivirus B型分支)，均属于Megrivirus属分支。

图 1 3C基因遗传进化分析 Fig. 1 Phylogenetic analysis based on the 3C gene of PiMeV
2.2 实时荧光定量RT-PCR条件

优化后的反应体系：SYBR Green I Master Mix 10 μL，上/下游引物各0.8 μL，模板2 μL，加去离子水至20 μL。最佳反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃ 10 s，56 ℃ 15 s，72 ℃延伸15 s，40个循环。标准曲线结果所示：该方法的标准曲线在5.4×101~5.4×106拷贝·μL-1有良好的线性关系，相关系数(R2)为1.00，斜率-3.335，Y值37.93，扩增效率通过公式E=10-1/斜率-1换算结果为99.4%，说明该方法有较好的扩增效率。

2.3 敏感性、特异性和重复性分析

敏感性分析发现，建立的RT-qPCR方法最低检测限为54拷贝·μL-1(5.4×101拷贝·μL-1)。特异性分析(图 2A)结果所示，扩增曲线图显示该方法仅能扩增出PiMeV，而与AIV、PPMV-1、PTTV、PiAd和PiCV无交叉反应，未见特征性荧光信号。熔解曲线(图 2B)结果显示，仅有PiMeV出现特征性单一溶解曲线峰值，Tm值为(81.69±0.22)℃，表明建立的RT-qPCR方法特异性强。重复性试验表明，建立的RT-qPCR方法其批内变异系数(0.22%~0.45%)和批间变异系数(0.11%~0.80%)均小于1.00%。上述结果表明，建立的RT-qPCR方法敏感性高、特异性强、重复性好。

A. 扩增曲线；B. 熔解曲线；1. 鸽源微RNA病毒；2. 鸽源禽流感病毒；3. 鸽源禽I型副黏病毒；4. 鸽输血传播病毒；5. 鸽腺病毒；6. 鸽圆环病毒；7. ddH2O A. Amplification curve; B. Melting curves; 1. PiMeV; 2. AIV; 3. PPMV-1; 4. PTTV; 5. PiAd, 6. PiCV; 7. ddH2O 图 2 实时荧光定量RT-PCR方法的扩增试验的特异性分析 Fig. 2 The specificity test for the RT-qPCR method
2.4 临床样品的检测

用本研究建立的RT-qPCR进行检测，结果阳性样品2份，阳性率为4.7%。同时以常规RT-PCR检测，检测出阳性样品1份，阳性率为2.35%，常规RT-PCR检出的阳性样品在RT-qPCR的检测结果中同样为阳性，符合率为100%。将常规RT-PCR阳性经克隆测序分析可见，其3C基因和PiMeV-CHN001株核苷酸相似性为100%。

3 讨论

小核糖核酸病毒科的病毒感染宿主范围广泛，在多种哺乳动物和禽类中被发现，其中至少有13个属源自禽类[19]；有2种重要的禽类疾病与Picornaviruses有关，分别是禽脑脊髓炎(avian Encephalomyelitis, AE)[20]和鸭病毒性肝炎(duck viral hepatitis，DVH)[21]，目前发现的Megrivirus属病毒的成员均来源于家禽和野禽，除了可能与火鸡病毒性肝炎(Turkey viral hepaitis，TVH)[2]有关以外、还被认为与鸡吸收功能障碍综合征(malabsorption syndrome，MAS)[17]和鸡传染性腺胃炎(transmissible viral proventriculitis，TVP)相关[22]，但目前均缺乏确切的证据，其主要原因是目前无法对该属的病毒进行体外有效分离培养。本研究前期尝试通过SPF鸡胚分离PiMeV病毒，同样无法分离到该病毒。

Picornaviruses科病毒的非结构蛋白基因1B、1C、1D、2C、3C和3D都是保守的[1]。本研究通过对已发布的PiMeV的序列进行比对，在3C基因片段处设计了一对PCR引物，并首次于轻度腹泻的信鸽粪便中扩增出目的片段，证实了在信鸽中存在PiMeV。3C基因表达的3C蛋白酶(3CPro)通过氢键网络将具有催化活性的氨基酸Cys、His、Asp或Glu连接形成活性催化基团(catalytic triad)的三联体，参与了小核糖核酸病毒的多聚蛋白加工，具有明显的病毒种属特异性。近年来, 对于Picornaviruses科病毒3C蛋白的研究表明，该蛋白参与病毒前体蛋白的剪切，与促进病毒复制、调控细胞凋亡以及逃避免疫应答等[23]密切相关。本研究扩增了PiMeV中的3C基因并进行克隆测序，通过比对发现其与另外2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)处于同一遗传进化分支(Megrivirus B型分支)，均属于Megrivirus属分支。其与MeV-B2株核苷酸相似性为92.0%，氨基酸相似性高达99.5%，仅为19处的His突变为Try，说明该基因的突变多为密码子的同义替换；3C蛋白具有半胱氨酸酶的特征催化基序Gly-X-Cys-Gly[24]，通过氨基酸序列的比对与检索，在PiMeV中，该基序为GFCG，与同为Megrivirus属的其他种均不相同；MeV-B2与MeV-B1被认为是鸽源Megrivirus的两种类型[2]，序列比对的结果说明MeV-CHN001与MeV-B1也有较高的相似性，核酸的相似性分别为89.5%，氨基酸序列的相似性为97.5%，显示3C基因有较高的保守性。同源比对结果显示，MeV-CHN001与来自于匈牙利的MeV-B2毒株的相似性较来自于中国香港的MeV-B1毒株高，没有表现出地理相关性，限于目前公布的PiMeV的基因较少，该结果还需要更多的毒株序列进行佐证。

实时荧光定量PCR具有快速、特异、灵敏的特点，适用于与临床检测，但尚未见相关检测技术应用PiMeV检测的报道。本研究以PiMeV的3C基因片段设计了一对特异性引物，通过条件优化建立了检测PiMeV的RT-qPCR方法，该方法有较强的特异性，仅对PiMeV检测出现阳性荧光信号，而与AIV、PPMV-1、PTTV、PiAd和PiCV等鸽源病毒无交叉反应；该方法有较高的灵敏度高，最低检测限为54拷贝·μL-1；重复性好，批内和批间的重复试验结果显示变异系数均较低。

4 结论

本研究明确福建源PiMeV与GenBank中其他2株野鸽源PiMeV处于同一遗传进化分支，均属于Megrivirus属分支。同时，本研究基于3C基因建立了PiMeV的RT-qPCR检测方法，特异性强、灵敏度高、重复性好等优点，为开展PiMeV的流行病学调查奠定基础。

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(编辑   白永平)