非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是一种影响家猪和野猪的急性出血性疾病，由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起，以高发病率和高致死率为特征^[1-2]。ASF于1921年在肯尼亚首次被报道，之后不断蔓延到欧洲和亚洲的其他国家，迄今为止，还没有公认有效的商业疫苗可用于ASF，对全球养猪业造成了毁灭性打击^[3-4]。ASFV是一种大型的双链DNA病毒，是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员，亦是唯一已知的DNA虫媒病毒，可以编码150~200种蛋白质，其中被预测和确定的解旋酶有5种，分别命名为A859L、B962L、D1133L、Q706L、Qp509L^[5-8]，但对它们的研究仍较少。

D1133L是ASFV编码的非结构蛋白，其基因位于病毒基因组的中央区域，属于晚期表达基因，高度保守^[9-10]。D1133L类似于牛痘病毒的D6R蛋白，含有表征超家族Ⅱ解旋酶的氨基酸序列，因此推测其属于超家族Ⅱ解旋酶^[11]，在ASFV复制中发挥着重要作用^[12-14]。单克隆抗体在诊断和治疗方面发挥着重要的作用，在前期的研究中，针对D1133L制备的单克隆抗体7D12具有良好的特异性，但是其功能活性还未被验证。在本研究中，作者探讨了D1133L单克隆抗体对ASFV复制的影响，以期对ASFV靶向药物和疫苗的研发提供一定的参考依据。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 细胞与病毒 　　猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)由本实验室参考文献[15]分离制备，ASFV野生病毒(ASFV-CN/GS/2018)及ASFV-GFP重组病毒(在ASFV-CN/GS/2018分离株中重组插入GFP标签)均由中国农业科学院兰州兽医研究所非洲猪瘟区域实验室提供。

1.1.2 试剂与抗体 　　胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培养基均购自美国Gibco公司；PBS缓冲液购自北京索莱宝公司；β-actin小鼠单克隆抗体购自Proteintech公司；HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗购自Abbkine公司；小鼠IgG购于碧云天有限公司，RNA抽提试剂Trizol购自美国Invitrogen公司；TB Green^TM Premix Ex Taq、PrimeScript^TM RT Master Mix、2×Pro Taq HS Probe Premix购自TaKaRa公司；D1133 L单克隆抗体^[16]和p72多克隆抗体均由本实验室提供。

1.2 细胞总RNA的提取及反转录

采用Trizol法提取细胞总RNA，并将RNA反转录为cDNA，反转录体系20 μL：5×PrimeScript^TM RT Master Mix 4 μL，RNA模板10 μL，DEPC水6 μL。反转录程序：37 ℃反转扩增15 min；85 ℃变性5 s，获得cDNA，于-20 ℃保存备用。

1.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

相对定量：将反转录成的cDNA，以ASFV p72基因为靶点进行PCR，引物序列见表 1。反应体系(20 μL)：TB Green^TM Premix Ex Taq 10 μL，10 μmol·L^-1上、下游引物各0.4 μL，DEPC水5.4 μL，cDNA3 μL。反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，共40个循环，利用2^-ΔΔCt方法对其进行分析。

绝对定量：反应体系(25 μL)：12.5 μL 2×Pro Taq HS Probe Premix，1 μL上下游引物，1 μL探针，3 μL DNA，6.5 μL DEPC水。反应条件：95 ℃预热2 min；95 ℃预热7 s，60 ℃预热12 s，4次循环；95 ℃预热6 s，58 ℃预热11 s，40次循环。引物和探针序列见表 1。

1.4 红细胞吸附试验(HAD₅₀)

采取健康猪抗凝血清，用10倍体积的含有3%双抗的PBS(pH=7.4)清洗至上清无色透明，最后使用PBS配成体积分数为1%的猪红细胞。将PAMs铺入96孔板，加入1%的红细胞悬液20 μL和倍比稀释(10^-1~10^-8)的样品100 μL，设置8个重复，连续培养7 d，每天观察红细胞吸附现象。按照Reed-Muench法计算HAD₅₀。

1.5 蛋白质印迹(Western blot)

在收取的细胞中加入1×loading buffer，100 ℃变性10 min，12 000 r·min^-1离心5 min，进行SDS-PAGE和转移至NC膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗于4 ℃摇床孵育过夜，二抗室温孵育2 h，最后，加入Western Bright ECL化学发光显色，使用化学发光成像分析系统曝光。

1.6 病毒生长曲线

在PAMs上分别接种MOI=0.1的ASFV和ASFV-GFP重组病毒，在感染后指定时间将感染细胞与培养上清一起收集，反复冻融3次后，采用QIAamp DNA Mini Kits试剂盒提取样品DNA，通过绝对定量PCR测定ASFV拷贝数。

1.7 荧光显微镜观察荧光数量

在荧光显微镜下观察荧光数量及强弱的变化，并选取多个视野进行拍照记录，并使用Image J软件对选取的视野里的绿色荧光数量进行定量分析。

1.8 数据分析

用GraphPad Prism软件进行统计学分析，用t检验进行显著性分析(*.P＜0.05；**.P＜0.01；***.P＜0.001)。

2 结果 2.1 D1133 L单克隆抗体抑制ASFV的基因转录水平和病毒效价

PAMs同时接种ASFV(MOI=0.1)和不同浓度的单克隆抗体，分别培养12、24和36 h，分别通过RT-qPCR和HAD₅₀测定ASFV的转录水平和病毒效价。结果显示，加入不同浓度的单克隆抗体后，ASFV p72的转录水平(图 1A)和病毒效价(图 1B)均显著降低，并且呈剂量依赖性。

2.2 D1133 L单克隆抗体抑制ASFV的蛋白表达

PAMs同时接种ASFV(MOI=0.1)和不同浓度的单克隆抗体，分别培养12、24和36 h，用Western blot测定ASFV D1133 L和p72蛋白的表达水平。结果显示，加入不同浓度的单克隆抗体后，ASFV D1133 L和p72蛋白的表达水平均显著降低，并呈剂量依赖性(图 2)。

2.3 D1133 L单克隆抗体抑制ASFV-GFP荧光蛋白的表达

为了通过ASFV-GFP重组病毒产生的绿色荧光蛋白的表达水平来验证D1133 L单克隆抗体对ASFV复制的影响，首先在PAMs上接种了ASFV和ASFV-GFP重组病毒，比较两种毒株的生长曲线，结果表明，两种毒株的生物学特性没有差异(图 3A)。接着在PAMs同时接种ASFV-GFP重组病毒(MOI=0.1)和不同浓度的单克隆抗体，分别培养24、36和48 h，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。结果表明，加入不同浓度的单抗后，绿色荧光蛋白的表达水平明显降低，并且呈明显的剂量依赖性(图 3B、C)。

以上结果表明，D1133 L单克隆抗体可以抑制ASFV的复制，且抗体浓度越弱，其抑制作用越弱。

3 讨论

关于ASFV单克隆抗体的研究中，一方面，结构蛋白p30、p54和p72因其很好的抗原性，基于其制备的单克隆抗体的ASFV检测方法被陆续地研发和报道^[17-20]，在ASFV的诊断中发挥作用。另一方面，针对非结构蛋白MGF360-9 L制备的多克隆抗体被证明可以显著抑制ASFV的复制^[21]；ASFV E165R基因编码的dUTPase，作为病毒复制的关键酶，针对其制备的单克隆抗体可以抑制E165R本身的酶活性，可能因而影响ASFV的复制^[22]。ASFV pB602 L基因在ASFV组装中发挥重要作用，针对其制备的单克隆抗体可能会通过抑制pB602 L的功能，从而干扰病毒颗粒的产生^[23]，在调控ASFV复制方面发挥作用。前期制备的D1133 L单克隆抗体具有良好的特异性，因此在本研究中，作者探索了单克隆抗体对ASFV复制的影响，以期探究D1133 L蛋白在病毒复制过程中的作用。

在PAMs上同时接种不同浓度的D1133 L单克隆抗体和ASFV(MOI=0.1)，发现不同浓度的抗体在不同的感染时间均能抑制ASFV在PAMs中的复制，并且随着抗体的浓度降低，抑制作用减弱。推测D1133 L单克隆抗体可能影响D1133 L的功能，起到抑制ASFV复制的作用，但想要精确验证的抑制功能，还需要在体内评估其抗病毒功效。因此D1133 L单抗发挥其抑制作用的机制仍需要进一步探究。

4 结论

本研究明确了D1133 L单克隆抗体在体外对ASFV复制的抑制作用，但是单克隆抗体发挥抑制作用的机制暂不清楚，还需进一步探索。本研究有助于进一步探究D1133 L在ASFV复制过程中发挥的作用，在ASF疫苗开发和抗病毒药物靶点的选择上提供一定的参考。