2. 西南大学中兽医研究所, 重庆 402460
2. Institute of Chinese Veterinary Medicine, Southwest University, Chongqing 402460, China
便秘是一种以便次减少、排便困难、粪便干结等为主症的临床常见肠道疾病[1]，在家畜中比较常见[2]。有30%~50%的母猪在妊娠后期及产后会发生便秘[3]，肠道内容物长时间聚集，内部菌群过度发酵，产生大量热量和气体导致胀肚，同时产生大量毒素，引发子宫炎、乳房炎、阴道炎等[4]。除此之外，便秘还会延长母猪分娩时间导致产出活仔猪数下降，粪便压迫产道导致流产、难产[5]。动物常用治疗便秘的药物有硫酸镁等容积性泻药、大黄等刺激性泻药、液体石蜡等润滑性泻药和毛果芸香碱等神经性泻药[6]。其中，中药副作用较小、疗效突出，成本相对较低，应用广泛。白术具有健脾益气、燥湿利水功效[7]，还可以改善胃肠道功能和调节免疫[8]。肉苁蓉有补肾阳、益精血和润肠通便等功效[9]。治疗便秘常用的药物组合中，白术-肉苁蓉为同现频次较高的药对[10]。网络药理学通过整合生物信息学、系统生物学相关内容，以数据库技术、建模及分析技术和试验技术为基础，阐释疾病的发生发展过程，分析药物的作用机制。本研究通过运用网络药理学构建成分-靶点-疾病作用网络，探讨白术-肉苁蓉有效成分治疗便秘的作用机制，再通过动物试验验证白术-肉苁蓉治疗慢传输型便秘的效果，为今后开发相关中药治疗便秘提供思路及方向。
1 材料与方法 1.1 网络药理学资料与方法1.1.1 白术-肉苁蓉化学成分及靶点预测 借助TCMSP数据库——中药系统药理学数据库和分析平台，在“Herb name”先后输入“baizhu”、“roucongrong”进行检索；所得结果按口服生物利用度OB≥30%、类药性DL≥0.18筛选，获得相关中药成分。然后在“Related Targets”下的“targets infomation”查询成分对应的靶点蛋白，导入UniProt数据库查询蛋白的基因名称，并将基因名标准化。
1.1.2 便秘相关靶点的获取及药物成分-疾病靶点网络图绘制 分别在GeneCards数据库、OMIM数据库、PharmGKB数据库、TTD数据库中以关键词“constipation”检索，收集便秘相关的靶点基因，整理后导入UniProt数据库将基因名标准化；利用Excel中的删除重复项功能对白术和肉苁蓉的有效成分作用靶点及便秘相关靶点去重，然后将所得靶点导入Venny 2.1.0，构建“白术与便秘靶点”、“肉苁蓉与便秘靶点”以及“白术-肉苁蓉与便秘靶点”的韦恩图。选择“白术-肉苁蓉与便秘靶点”的韦恩图中交叉部分，通过“Results”中获得的交集靶点及有效成分靶点的Mol ID建立network和tape文件，导入Cytoscape 3.7.2软件构建白术-肉苁蓉有效成分与便秘的靶点网络。
1.1.3 药物成分-疾病靶点PPI网络构建 将成分-疾病交集靶点导入STRING数据库的“Multiple proteins”，之后，“Organisms”选择“Homo sapiens”，进行蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)分析。“Settings”最低要求交互得分设为0.4，同时选择隐藏网络中已断开的节点，Clusters中集群的数量设为3，得到PPI网络。将TSV格式数据文件导入Cytoscape3.7.2软件，利用CentiScaPe 2.2插件对靶点蛋白互作网络进行分析，通过度中心性(degree)、接近中心性(closeness)和中介中心性(betweenness)三个参数筛选大于阈值的数据，得到靶点核心网络图。
1.1.4 生物信息学GO分析及KEGG信号通路富集分析 将白术-肉苁蓉与便秘的公共靶点导入DAVID数据库，利用“Shortcut to DAVID Tools”中的“Functional Annotation”进行GO(Gene Ontology)的生物学过程(biological process，BP)、细胞组成(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)富集分析以及KEGG信号通路分析。其中，“Select Identifier”选择“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，“Select species”选择“human”，“List Type”选择“Gene List”。导出结果筛选P＜0.05的数据，降序排序后通过在线作图平台——微生信将KEGG前20位制作成富集气泡图，GO前10位制作成BP、CC、MF带颜色富集条形图。实现富集分析结果可视化，综合预测白术-肉苁蓉治疗便秘的作用机制。
1.1.5 分子对接 为验证核心靶点的准确性，选择部分核心靶点与潜在靶点较多的成分进行分子对接。在TCMSP数据库下载有效成分的3D结构，从PDB数据库筛选下载蛋白结构并用PyMOL软件删除蛋白的配体和水分子。利用AutoDockTools软件对蛋白和小分子进一步处理后进行分子对接，选择结合较好的部分结果用PyMOL软件进行可视化处理。
1.2 动物模型试验验证材料与方法1.2.1 试验动物 40只SPF级雄性KM小鼠，体质量18~22 g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0010。试验动物的利用遵照了西南大学伦理委员会的规定，伦理审查号：IACUC-20230213-01。
1.2.2 试剂与仪器 盐酸洛哌丁胺、阿拉伯树胶，上海麦克林生化科技有限公司，批号：C14425224、C14049325；枸橼酸莫沙必利，大连美仑生物技术有限公司，批号：J0618B；白术、肉苁蓉饮片购自重庆荣昌西城大药行；电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，型号：BSA224 S-CW；定时恒温磁力搅拌器，上海沪西分析仪器厂有限公司，型号：90-2；智能恒温电热套，天津工兴实验室仪器有限公司，型号：ZNHW；活性炭、1 mL注射器、灌胃针和手术器械等为本实验室保存。
1.2.3 试验分组及给药 适应性喂养1周后，将小鼠随机分为空白组(6只)和盐酸洛哌丁胺组(34只)。空白组蒸馏水灌胃，盐酸洛哌丁胺组以10.0 mg·kg-1灌胃给药，前3 d每日1次，第4天开始每日早晚各1次。7 d造模成功后，将30只便秘小鼠随机均分为模型组、阳性对照组和高、中、低剂量药物组。晚第二次灌胃蒸馏水和盐酸洛哌丁胺1 h后，空白组和模型组蒸馏水灌胃，阳性对照组10.0 mg·kg-1枸橼酸莫沙必利灌胃，高、中、低剂量药物组分别灌胃4.8，2.4，1.2 g·kg-1的白术-肉苁蓉混悬液，连续7 d，每日1次。灌胃体积均为0.1 mL·10 g-1。给药剂量参考人和动物间药物等效剂量比值计算。
1.2.4 排便试验 第7天末次给药治疗后小鼠禁食不禁水饲养24 h，灌胃蒸馏水和盐酸洛哌丁胺，1 h后空白组、模型组、阳性对照组与高、中、低剂量药物组灌胃相应溶液。再间隔30 min给各组小鼠灌胃0.3 mL活性炭混悬液，正常饮食饮水，记录首粒黑便时间和12 h内排便粒数。
1.2.5 小肠运动试验 排便试验结束后小鼠禁食不禁水饲养24 h，各组分别予以上述同样方法灌胃，30 min后全部小鼠灌胃0.3 mL活性炭混悬液，再间隔30 min处死小鼠。打开腹腔剪取幽门至盲肠的小肠，将其轻拉成直线测量小肠总长度及幽门到活性炭混悬液前沿的推进长度，计算小肠推进率=(小肠内碳末推进距离/小肠总长度)×100%。
1.2.6 统计学分析 应用SPSS 22.0统计分析软件处理，组间比较选用单因素ANOVA检验，结果以“平均值±标准差”形式表示，P＜0.05时表示差异显著，有统计学意义。
2 结果 2.1 网络药理学研究2.1.1 “白术”、“肉苁蓉”化学成分及靶点的筛选 通过TCMSP数据库检索出白术-肉苁蓉所含化合物共130个，其中白术55个，肉苁蓉75个。以DL≥0.18，OB≥30%进一步筛选得到白术7个，包括12-十七酰基-2E，8E，10E-苍术三醇、α-氨基比林、3β-乙酰氧基苍术酮、8β-乙氧基白术内酯Ⅲ等，肉苁蓉6个，包括β-谷甾醇、槲皮素、花生四烯酸、细胞因子等，见表 1。除去重复项及未查询到的基因，白术有效成分作用靶点18个，肉苁蓉有效成分作用靶点158个，将二者合并、除去重复项后共得到158个靶点。
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表 1 白术-肉苁蓉有效成分 Table 1 Active ingredients of Atractylodes Macrocephala and Cistanche Deserticola |
2.1.2 便秘靶点筛选及药物-成分-靶点相互作用网络的构建与分析 以关键词“constipation”在各数据库检索，共收集相关靶点基因1 156个，其中GeneCards数据库1 133个(Relevance score＞1筛选)、OMIM数据库7个、PharmGKB数据库5个、TTD数据库11个，汇总并删除重复项后共1 140个。疾病靶点分别与白术、肉苁蓉及白术-肉苁蓉药物成分靶点取交集获得共同靶点，韦恩图见图 1。将白术-肉苁蓉与疾病的交集靶点信息导入Cytoscape 3.7.2软件构建药物-有效成分-靶点网络，含86个节点和112条边。其中，红色菱形节点代表药物名称，蓝色椭圆形节点代表有效成分的Mol ID，绿色方形节点代表有效成分与疾病共有靶点，灰色直线表示节点间的相互关系，具体见图 2。其中，PTGS2与9种有效成分连接，为连接度最高的靶点基因，白术-肉苁蓉治疗便秘可能通过调节PTGS2起作用。有效成分中，槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、3β-乙酰氧基苍术酮(3β-acetoxyatractylone)、苏齐内酯(suchilactone)和丁香树脂二甲醚(Yangambin) degree较高，潜在靶点多。
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图 1 “药物成分-便秘”靶点韦恩图 Fig. 1 Venn diagram of target of "Pharmaceutical Ingredients-Constipation" |
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图 2 “白术-肉苁蓉有效成分-便秘”靶点网络 Fig. 2 Target network of "Active Ingredient of Atractylodes Macrocephala and Cistanche Deserticola-Constipation" |
2.1.3 蛋白质互作(PPI)网络的构建 将白术-肉苁蓉有效成分与疾病的71个共同靶点导入STRING数据库得到PPI网络，得到靶点核心网络图，节点代表靶蛋白，边代表靶蛋白之间的相互作用。其中，边数为993，平均节点度为28，平均局部聚类系数为0.724。节点分为相互作用较多的红色、蓝色、绿色三组，见图 3。继而将TSV格式数据文件导入Cytoscape 3.7.2软件，数据按Degree＞28.371、Closeness＞0.009、Betweenness＞46.343(保留三位小数)筛选，Degree降序排列后得到19个核心靶点，包括Degree值较高的RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1)、白细胞介素-6(Interleukin-6，IL6)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)、细胞肿瘤抗原p53(Cellular tumor antigen p53，TP53)等，可能是白术-肉苁蓉治疗便秘的关键靶点，具体结果见表 2。构建19个核心靶点的PPI网络，见图 4。
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图 3 “白术-肉苁蓉有效成分-便秘”靶点PPI网络图 Fig. 3 PPI network diagram of the target of "Active Ingredient of Atractylodes Macrocephala and Cistanche Deserticola-Constipation" |
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表 2 白术-肉苁蓉治疗便秘的核心靶点 Table 2 Core targets of Atractylodes Macrocephala and Cistanche Deserticola in the treatment of constipation |
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图 4 核心靶点PPI网络 Fig. 4 Core Target PPI Network |
2.1.4 基因功能和通路富集分析 借助DAVID数据库，将白术-肉苁蓉作用于便秘的71个靶蛋白进行GO注释分析和KEGG通路分析。结果表明，共涉及BP 26个、CC 50个、MF 72个、KEGG 24个。按P＜0.05筛选，降序排序后将前10位的GO注释结果以及前20位的KEGG通路相关数据导入微生信制图。其中，BP主要调节对过氧化氢的反应、RNA聚合酶II启动子转录的正调控及脂质储存负调控等生物过程；CC主要对孔复合体、受体复合物及高尔基体等细胞组分有显著作用；MF主要对氧化还原酶活性，结合分子氧作用于单个供体，结合两个氧原子、蛋白酪氨酸激酶激活剂活性及ATP酶结合等分子功能方面作用显著。KEGG富集潜在靶基因较多的通路有脂质和动脉粥样硬化和乙型肝炎、癌症中的蛋白聚糖和卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染等，白术-肉苁蓉可能通过这些信号通路治疗便秘。具体结果见图 5。
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MF中“oxidoreductase activity…”全称为“oxidoreductase activity, acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, incorporation of two atoms of oxygen” The full name for the "oxidoreductase activity…"in MF is "oxidoreductase activity, acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, incorporation of two atoms of oxygen" 图 5 白术-肉苁蓉治疗便秘靶点的GO分析(top10)和KEGG富集分析(top20) Fig. 5 GO analysis (top10) and KEGG enrichment analysis (top20) of Atractylodes Macrocephala and Cistanche Deserticola for constipation targets |
2.1.5 分子对接验证 选择AKT1、TNF、IL-6和PTGS2基因对应的靶点蛋白与槲皮素、β-谷甾醇和3β-乙酰氧基苍术酮3个成分进行对接，结果见表 3。结合能越低分子间结合越稳固，结合能＜-5 kJ·mol-1时对接结果良好。用PyMOL对部分对接活性较好的结果可视化处理，见图 6。
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表 3 分子对接结合能 Table 3 Molecular docking binding energy kJ·mol-1 |
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a. AKT1-槲皮素；b. AKT1-β-谷甾醇；c. TNF-β-谷甾醇；d. IL6-β-谷甾醇；e. IL6-3β-乙酰氧基苍术酮；f. PTGS2-β-谷甾醇 a. AKT1-quercetin; b. AKT1-beta-sitosterol; c. TNF-beta-sitosterol; d. IL6-beta-sitosterol; e. IL6-3β-acetoxyatractylone; f. PTGS2-beta-sitosterol 图 6 主要活性成分与关键靶点分子对接结果 Fig. 6 The results of molecular docking of main active ingredients with key targets |
2.2.1 白术-肉苁蓉对便秘小鼠排便情况的影响 由表 4可知，与空白组相比，模型组小鼠首粒黑便时间显著延长(P＜0.01)，12 h排便量显著减少(P＜0.05)，表明便秘小鼠造模成功。与模型组首粒黑便时间相比，高剂量药物组和阳性对照组极显著缩短(P＜0.01)，中剂量药物组显著缩短(P＜0.05)，低剂量药物组差异不显著(P＞0.05)。与模型组相比，各剂量药物组与阳性对照组12 h排便量差异均不显著(P＞0.05)。表明中、高剂量白术-肉苁蓉混悬液对小鼠慢传输型便秘有改善作用。
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表 4 白术-肉苁蓉对小鼠排便及小肠运动情况的影响 Table 4 Effects of Atractylodes Macrocephala and Cistanche Deserticola on defecation and small intestine movement in mice |
2.2.2 白术-肉苁蓉对便秘小鼠小肠运动情况的影响 由表 4可知，与空白组相比，模型组小肠推进率显著降低(P＜0.01)，表明肠道蠕动减弱，盐酸洛哌丁胺造模成功。与模型组相比，中、高剂量药物组小肠推进率显著增高(P＜0.01)，差异极显著，低剂量药物组与阳性对照组小肠推进率均无明显变化，差异无统计学意义(P＞0.05)。
3 讨论便秘症首见于《黄帝内经》，基本病机为大肠通降不利，传导失司[11]，是大家畜经常出现的一种病例，患病率较高[12]。有关中药治疗便秘的用药规律分析表明，便秘的基本治则为润肠通便，调畅气机促进大肠传导之力，白术、肉苁蓉等是用于虚证的药物组合[13]。由八珍散改制的颗粒剂治疗产后便秘猪群有良好效果[14]，由肉苁蓉等10味中草药配伍而成的复方制剂可以明显减轻母猪便秘[15]。王文革等[16]对慢传输型便秘大鼠进行研究，结果表明大剂量生白术可能通过促进结肠组织c-kit mRNA表达，修复结肠ICC治疗便秘。范亚楠等[17]研究发现，肉苁蓉可以使便秘大鼠粪便粒数增加，小肠推进度提高，有效治疗便秘。本研究对白术-肉苁蓉治疗慢传输型便秘的效果进行验证，数据表明，中、高剂量白术-肉苁蓉可使洛哌丁胺诱导的便秘小鼠首粒黑便时间显著缩短，小肠推进率显著增高，证明白术-肉苁蓉可以促进肠道运动，对慢传输型便秘有明显改善作用。中医认为慢传输型便秘以本虚标实为主，多以气虚型为主要证候，虚者补之是主要治则。本文试验仅验证了白术-肉苁蓉对此种便秘证型有治疗效果，对于诸如热秘、冷秘、阳虚秘、阴虚秘等其他型便秘的治疗效果，本文未作探究，后续可设计相关试验进行验证。为验证白术-肉苁蓉中有效成分治疗便秘的准确性，也可设计单纯化合物的治疗组开展试验。白术-肉苁蓉药作为治疗便秘同现频次较高的药对，治疗便秘的机制尚不明确。因此，本研究基于网络药理学和试验进一步对白术-肉苁蓉治疗便秘的机制进行探讨。
白术、肉苁蓉治疗便秘与其成分相关。白术含有内酯类、挥发油和多糖等成分，苍术酮可以通过胆碱能受体促进胃肠运动，白术内酯I能增强唾液淀粉酶活性和调节肠道功能[18]。肉苁蓉含有苯乙醇苷类和多糖等成分，总寡糖和半乳糖醇是通便的药效物质[19]。“白术-肉苁蓉有效成分-便秘”靶点网络结果表明，槲皮素、β-谷甾醇、3β-乙酰氧基苍术酮、苏齐内酯和丁香树脂二甲醚等成分潜在靶点较多，其中可能有白术-肉苁蓉治疗便秘的有效成分。有研究表明，槲皮素可以上调SIRT 1表达，使NLRP3促炎反应活化受到抑制，提高M2型巨噬细胞作用，改善结肠炎性损伤[20]；还可以保护肠黏膜，恢复肠道功能，缓解便秘症状[21]。研究表明，β-谷甾醇有免疫调节、抗菌、抗炎和润肠通便等作用[22-23]，能降低结肠炎小鼠肠道TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，增加肠上皮细胞抗菌肽表达，减轻炎症对肠道环境干扰[24]。3β-乙酰氧基苍术酮是白术挥发油中的一种成分。白术经炮制后苍术酮含量减少，同时一部分转化为白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ[25]。白术中的挥发油成分没有产生“燥性”导致机体津液受损而加重便秘症状，可能因为白术治疗便秘多为汤剂，其燥性部位挥发油有一定损失，因此在病理情况下白术仍以发挥通便作用为主[26]。
由本研究的靶点分析结果可知，多种有效成分均作用于PTGS2，而AKT1、IL-6和TNF等可能是核心靶点，在治疗中发挥主要作用。AKT作为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能促进细胞增殖和抑制细胞凋亡[27]，可通过PI3K/AKT信号通路调控eNOS和NO的合成与分泌，从而调控肠道功能，治疗慢传输型便秘[28]。前列腺素内过氧化物合酶(PTGS)又称正环氧化酶(COX)，有PTGS1(cox-1)和PTGS2(cox-2)两种异构酶。COX-2/PGE2是导致梗阻后肠运动障碍的重要机制[29]。TNF-α是主要促炎因子，可以引起肠道炎性损伤[30]。IL-6与肿瘤的发生发展关系密切，是导致便秘的相关炎症因子[31]。TNF-α和IL-6能促进MMP-2和MMP-9的表达，从而降解细胞外基质，破坏基膜，加重炎性反应[32]。
4 结论白术-肉苁蓉治疗便秘的主要作用机制可能为多种活性成分通过PTGS2、AKT1、TNF和IL-6等靶点对脂质和动脉粥样硬化、乙型肝炎等信号通路进行调控，从而影响对过氧化氢的反应、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、脂质储存负调控等过程。
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(编辑 范子娟)