2. 北京农学院 北京市中兽药工程技术研究中心, 北京 102206;
3. 北京市畜牧兽医总站, 北京 100029;
4. 北京优帝鸽业有限公司, 北京 100188
, WU Shihai1,2, YANG Fulin1,2, YU Chenyun1,2, SUN Zhigang1,2, LIU Xinyuan1, XU Yuanyuan1, LIANG Bingbing1, LI Fuhuang3, SUN Hong4, LIU Xiaoye1,2
, DONG Hong1,2
2. Beijing Engineering Research Center of Veterinary Medicine, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China;
3. Beijing General Station of Animal Husbandry, Beijing 100029, China;
4. Beijing Youdi Pigeon Industry Co., Ltd., Beijing 100188, China
鸽毛滴虫病是鸽养殖场广泛流行的寄生虫病，常发于夏秋两季，闷热潮湿环境更有利于鸽毛滴虫病的发展[1]，该病导致鸽采食量下降，严重影响了肉鸽的生长速度，给肉鸽养殖业带来了巨大的经济损失。近年来，肉鸽养殖场内鸽毛滴虫带虫率居高不下，幼鸽的毛滴虫阳性率可高达90%，乳鸽死亡率可达30%~80%[2-3]。鸽毛滴虫病除形成黏膜溃疡或结节病变外，侵入肝可形成干酪样损伤，引发肝肿大及充血，并在肝表面形成特征性圆形或球状黄色病灶。若脐部感染鸽毛滴虫，则会引起鸽脐部组织肿大及皮下炎症，或发育不良为僵鸽[4]。目前, 我国鸽养殖业的抗鸽毛滴虫病主要是利用化药甲硝唑，甲硝唑具有良好的抗禽毛滴虫病作用，是鸽源禽毛滴虫病临床最常用药物，但其具有一定药物残留和毒副作用。此外，由于甲硝唑的长期使用，禽毛滴虫出现了耐药寄生虫株，为鸽源禽毛滴虫病的临床用药带来困难[5-8]。故我国肉鸽养殖业迫切需要寻找一种能替代甲硝唑的鸽毛滴虫病治疗手段。
在畜禽养殖业中，传统中药的应用越来越广泛。中药材来源丰富且种植规模日渐加大，中药制剂成分多样，在疾病的治疗中具有多靶点多功效的优势，且中药具有天然、无残留及低毒性，因此在畜禽疫病防治中，中药的应用得到了学者们较大的关注[9]。我国传统中兽医对鸽毛滴虫病的辨证为湿热外邪侵犯机体，阻滞气机而郁结于肝胆的湿热内蕴证。
龙胆草，又称矮脚金龙胆草、鱼胆草等，是龙胆科植物干燥根及根茎。始载于《神农百草经》《药鉴》及梁代陶弘景《名医别录》也都有记载[10]。主要分布在中国、俄罗斯、日本和朝鲜，在海拔400~1 700 m的地区生长，多生于土山、荒坡、高山路旁灌木杂草丛中。本品性寒，味苦，具有清肝胆实火，泻下焦湿热, 健脾消食，舒筋止痛的功效[11-15]。研究表明，其抗菌消炎能力突出[16]，但少见在畜禽养殖中应用龙胆草治疗的相关报道。因此本试验通过在患病肉鸽日粮中添加不同浓度的龙胆草水提物，用实验室方法对采集的样品进行相关指标检测，观察其抗鸽毛滴虫药效，旨在为龙胆草水提液在肉鸽养殖业中提供数据支持和参考依据。
1 材料与方法 1.1 试剂龙胆草(北京同仁堂大栅栏店)；甲硝唑(广州康牧药业有限公司)；胎牛血清(美国GiBco公司，货号：10099-141)；PBS缓冲液(Aladdin，货号：P301565-500 mL)；青霉素/链霉素双抗(美仑生物，货号：MA0110)；无酶无菌水(Solarbio, 货号：R1600)；D2000 plus DNA Ladder(Solarbio，货号：M1070)；台盼蓝(Merck，货号：V900876-25 G)；EasyPure® Genomic DNA Kit(北京全式金生物，货号：EE121-16)；DMEM高糖培养基(美国GiBco公司，货号：H2387)；鸽白细胞介素-6 ELISA试剂盒(江苏酶免实业有限公司，货号：MM-92583902)；鸽白细胞介素-1β ELISA试剂盒(江苏酶免实业有限公司，货号：MM-92582101)；鸽主要组织相容性复合体Ⅱ类ELISA试剂盒(江苏酶免实业有限公司，货号：MM-92581202)；鸽转化生长因子-β ELISA试剂盒(江苏酶免实业有限公司，货号：MM-92584201)
1.2 主要仪器超纯水仪(艾肯水精灵，型号：AK-RO-C2)；CO2恒温培养箱(日本Sanyo公司，型号：MCO-17AC)；精密电子天平(德国哥廷根赛多利斯，型号：BS124 S)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂，型号：RE-3000)；奥林巴斯荧光倒置显微镜(日本Olympus公司，型号：IX71)；电热恒温干燥箱(太仓市试验设备厂，型号：HZQ-F160)；常温常压煎药机(长沙市卓威医疗器械有限公司，型号：YJD20)；自动细胞技术仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型号：C100-SE)；小型电子秤(永康市龙蓓工贸有限公司，型号：I2000)
1.3 试验材料鸽毛滴虫分离自北京市顺义区优帝鸽业病鸽口腔，经纯化、鉴定、可稳定传代后用于本试验。称取龙胆草40 g，置于800 mL超纯水中，浸制120 min后先用武火煮沸，后转为文火煮沸30 min，4层纱布过滤获得滤液，剩下的药渣再加入400 mL超纯水，以同样的方法煮沸30 min，滤出药液，与第1次收集的药液混合，4层纱布过滤除去残渣，并加热浓缩至40 mL。离心(3 000 r ·min-1，10 min)，取上清药液烘干，得到粗制备的水提物并称重，使用灭菌蒸馏水将各中药水提物配成提取物浓度为0.1 g ·mL-1的中药原液。使用0.22 μm过滤器过滤除菌，得到单味中药水提物，4 ℃保存备用。
1.4 鸽毛滴虫分离鉴定使用灭菌棉签在病鸽咽喉部采样后，放入1.5 mL灭菌离心管中保存并带回实验室。将1 mL DMEM培养基(含0.5% 200 IU ·mL-1青霉素、0.5% 200 IU ·mL-1链霉素和10% 胎牛血清)加入含有样品的离心管中，37 ℃恒温培养箱静置培养24 h后将培养物均匀混合，在室温下滴一滴，制成压片，用光学显微镜进行观察，若发现呈卵圆形，含1~3根鞭毛，具有移动性的虫体，则可初步判定为鸽毛滴虫。
取对数生长期的鸽毛滴虫株悬浮液，加入1.5 mL离心管中，用DNA提取试剂盒按说明书提取其基因组DNA，4 ℃保存备用。ITS1/5.8 S/ITS2基因被认为是鸽毛滴虫的标志基因，根据其在NCBI GenBank中的序列(登录号: KP900042)设计引物，用正向引物(5′-TGCTTCAGCTCAGCGGG-TCTTCC-3′)及反向引物(5′-CGGTAGGTGAACCTGCCGTTGG-3′)对其进行扩增[17]。PCR在50 μL的反应体系中进行，2×Taq PCR MasterMix 25 μL，引物各1.5 μL，DNA模板4 μL，加无酶无菌水补至50 μL。阴性对照使用相同体积的无酶无菌。PCR程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，58.7 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；72 ℃延伸8 min。PCR阳性产物送至生工生物工程股份有限公司测序，并将每个序列利用NCBI Blast在GenBank中搜索出匹配度最高的序列，下载作为参考序列并采用MEGA 10.0软件构建其系统进化树。
1.5 龙胆草水提物体外抗鸽毛滴虫活性测定龙胆草水提物终浓度设为25、50、100 mg ·mL-1。计算毛滴虫虫体数量，基于其大小及生长速度，制备密度为1×106个·mL-1的活虫体悬液，将250 μL虫体悬液与250 μL中药水提物混匀，加入1.5 mL离心管中，同时设培养基代替药物作为空白对照组，每个浓度设3个重复。将鸽毛滴虫置于37 ℃温箱中培养，分别于12、24、48 h用倒置显微镜观察虫体状态，并用无菌吸头将培养液轻轻吹打均匀，吸取一定悬液计数活虫体数量，计算药物对鸽毛滴虫的相对生长抑制率。为确保结果准确，虫体全部死亡的组，剩余部分正常转种，继续培养24 h，确定无活虫体，方可判定该浓度可杀灭全部虫体。
1.6 龙胆草水提物体内抗鸽毛滴虫活性测定分别于试验第0、7、15、23和31天采集鸽嗉囊分泌物于生理盐水中，在3 000 r ·min-1条件下离心5 min，弃上清液，取1 mL生理盐水将沉淀物重悬并吹打均匀，取9 μL悬浊液与1 μL台盼蓝染色液混合均匀后将混合液吸取至一次性细胞计数板中，使用细胞计数仪对鸽毛滴虫进行计数并计算各组的鸽毛滴虫死亡率。
| $ \text { 鸽毛滴虫死亡率 }=(T 1-T 0) / T_0 \times 100 \% $ |
T1：治疗后受试鸽嗉囊分泌物内的鸽毛滴虫数量；T0：治疗前受试鸽嗉囊分泌物内的鸽毛滴虫数量
1.7 虫体死亡判断标准将不运动、边缘不整、内含大量颗粒的圆形虫体判定为死亡毛滴虫。活毛滴虫呈无色透明状，虫体运动时鞭毛或波动膜不停波动；经台盼蓝染色后，死亡毛滴虫被染成明显的蓝色，虫体变圆、结构模糊、虫体内颗粒化、失去原有的透明度、鞭毛/波动膜停止运动、甚至破裂。
1.8 分组与给药选用90只体重相近，自然发病成年肉鸽，随机分为中药高剂量组(1 000 mg ·只-1)、中药中剂量组(500 mg ·只-1)、中药低剂量组(200 mg ·只-1)、阳性对照组(甲硝唑50 mg ·只-1)和阴性对照组(表 1)。以上各组每组6只，各设3个重复组，共计90只。注意确保试验动物体况相似，免疫程序一致。其中药物组将不同剂量浓度的龙胆草水提物加入基础日粮中，阳性对照组加入甲硝唑，阴性对照组仅给与基础日粮，疗程3 d。
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表 1 分组及给药方法 Table 1 Grouping and administration method |
使用SPSS 19.0软件采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，最小显著差异法(LSD)法进行多重比较，试验数据以“x±s”表示，P值< 0.05被认为差异具有统计学意义(*.P < 0.05，**.P < 0.01，***.P < 0.001)。
2 结果 2.1 鸽毛滴虫的分离、鉴定、纯化采样时，发现鸽口腔黏液增多、变黄, 并污染了颈部羽毛。口腔、喙缘和喉咙处有针尖大小，干酪样沉着物(图 1A)疑似鸽毛滴虫感染。咽拭子直接涂片镜检表明，存在大量梨形或椭圆形移动虫体。大多数虫体可以看到1~3根鞭毛，部分虫体鞭毛模糊，但可以继续移动(图 1B，红色标注)。
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A.病鸽口腔临床症状；B.咽拭子涂片 A. Oral clinical symptoms of sick pigeon; B. Throat swab smear 图 1 鸽毛滴虫病的病理变化及口腔涂片 Fig. 1 Pathology changes and oral smears of Trichomonas gallinae |
通过测序，得到的基因片段长度为343 bp。在NCBI数据库中进行BLAST比对，测序结果与鸽毛滴虫ITS1/5.8 S/ITS2基因具有98.01%的一致性(表 2)；测序结果(T1)与鸽毛滴虫KX844990一致性最高(图 2)。
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表 2 测序结果与ITS1/5.8S/ITS2基因BLAST结果 Table 2 Sequencing results and BLAST results of ITS1/5.8S/ITS2 gene |
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图 2 测序产物进化树分析 Fig. 2 Evolutionary tree analysis of sequencing products |
将病鸽口腔样本培养后，鸽毛滴虫经过Percoll溶液的纯化处理，在DMEM培养基(含双抗)中传代数代后，细菌和杂质得到净化，得到的鸽毛滴虫呈半透明状，具有活动性，呈现出良好的生长活性及繁殖能力，可多次传代用于后续试验(图 3)。
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A.鸽毛滴虫(100×)；B.鸽毛滴虫(400×) A. Trichomonas gallinae(100×); B. Trichomonas gallinae(400×) 图 3 纯化培养后的无菌鸽毛滴虫 Fig. 3 Purified culture of sterile Trichomonas gallinae |
龙胆草水提物25 mg ·mL-1的毛滴虫相对生长抑制率在12 h达(99.23±4.23)%，50和100 mg ·mL-1的毛滴虫相对生长抑制率在12 h均达100%，即可以杀灭全部虫体。此外，各浓度龙胆草水提物在24和48 h均可以杀灭全部虫体。结果表明：龙胆草水提物对鸽毛滴虫具有抑制和杀灭作用，龙胆草水提物在12 h杀灭全部虫体的MEC为50 mg ·mL-1(表 3)。
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表 3 中药水提物体外抗鸽毛滴虫活性 Table 3 Anti-Trichomonas gallinae activity of water extract of Traditional Chinese medicine |
龙胆草500 mg ·只-1组在第31天仍具有一定杀虫效果，杀虫率为20.87%±1.08%，其他各组杀虫率皆为0。这表明相对于甲硝唑，龙胆草500 mg ·只-1组的药效持续时间更长(表 4)。
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表 4 龙胆草水提物体内抗鸽毛滴虫活性 Table 4 Anti-Trichomonas gallinae activity of Gentian water extracts in vivo |
中药组各组杀虫效果显著(P＜0.05)；其中，龙胆草200 mg ·只-1组和龙胆草500 mg ·只-1组与甲硝唑组杀虫效果差异不显著(P>0.05)(表 4)。
2.4 龙胆草水提物恢复病鸽体重对患病肉鸽进行体重称量并统计，发现龙胆草水提物对体重降低的病鸽有恢复体重的作用。由图 4可知，与对照组相比，中药组在1~15 d均有体重上升趋势，在15 d以后呈体重下降趋势。
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图 4 龙胆草水提物对患病鸽体重的影响 Fig. 4 Influence of Gentian water extract on the body weight of pigeon |
根据试验期间患病鸽死亡的记录统计出各组患病肉鸽存活率，与对照组相比，中药组及甲硝唑组都可以使肉鸽存活率升高。其中甲硝唑组的肉鸽存活率在7 d降至94%，并保持稳定。与甲硝唑组相比，在15 d以后龙胆草水提物作用组的肉鸽生存率相对下降，但均高于对照组(图 5)。
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图 5 龙胆草水提物对患病鸽存活率的影响 Fig. 5 Effect of Gentian water extract on mortality of pigeon |
血清ALT含量在0~15 d呈下降趋势，15 d降至最低，15~31 d呈上升趋势。用药后龙胆草水提物各组血清ALT含量在7~23 d内均低于对照组(图 6A)。其中，在第15天时，龙胆草水提物各组血清ALT含量均极显著低于对照组(P < 0.01)，其中龙胆草200 mg ·只-1组血清ALT含量最低(图 6B)。
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A.龙胆草水提物组第0、7、15、23、31天血清ALT含量；B.龙胆草水提物组第15天血清ALT含量。图上标注中以*代表组间差异显著(P＜0.05)，**代表组间差异极显著(P＜0.01)，下同 A. Serum ALT levels in the Gentiana water extract group on day 0, 7, 15, 23, 31; B. Serum ALT levels in the Gentiana water extract group on day 15. In the marks on the figure, * represents significant difference between groups (P < 0.05), and ** represents extremely significant difference between groups (P < 0.01), the same as below 图 6 龙胆草水提物各组不同时间血清ALT含量对比 Fig. 6 Comparison of ALT content in serum of Gentian water extract at different time |
龙胆草水提物各组血清AST含量在第15天时最低，且均低于对照组(图 7A)。其中，在第15天时，龙胆草水提物1 000 mg ·只-1组血清AST含量最低，显著低于对照组(P < 0.05)，200 mg ·只-1与500 mg ·只-1组AST含量低于对照组(图 7B)。
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A.龙胆草水提物组第0、7、15、23、31天血清AST含量；B.龙胆草水提物组第15天血清AST含量 A. Serum AST levels in the Gentiana water extract group on day 0, 7, 15, 23, 31; B. Serum AST levels in the Gentiana water extract group on day 15 图 7 龙胆草水提物各组不同时间血清AST含量对比 Fig. 7 Comparison of AST content in serum of Gentian water extract at different time in each group |
龙胆草水提物各组血清AST/ALT含量在第7天时均低于对照组；第15天时龙胆草200 mg ·只-1组和龙胆草500 mg ·只-1组高于对照组，龙胆草1 000 mg ·只-1组低于对照组；第23天时龙胆草200 mg ·只-1组和龙胆草1 000 mg ·只-1组高于对照组，龙胆草500 mg ·只-1组低于对照组；第31天时龙胆草水提物各组血清AST/ALT含量均低于对照组(图 8)。
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图 8 龙胆草水提物各组不同时间血清AST/ALT含量对比 Fig. 8 Comparison of AST/ALT content in serum of Gentian water extract at different time in each group |
龙胆草水提物对患病鸽治疗后，血清内炎症因子含量表达见表 5，治疗前与治疗后(用药15 d)，IL-6、IL-1β的含量有所变化。与治疗前相比，龙胆草水提物及甲硝唑组IL-6、IL-1β含量明显升高，治疗后龙胆草各组血清IL-6含量均显著高于对照组(P < 0.05)；龙胆草水提物200、500 mg ·只-1组血清IL-1β显著高于对照组(P < 0.05)(表 5)。
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表 5 龙胆草水提物对血清中IL-6、IL-1β的影响(x±s) Table 5 Effects of Gentian water extract onIL-6, IL-1β in serum(x±s) |
与治疗前相比，龙胆草水提物及甲硝唑组MHC-Ⅱ没有明显变化，但TGF-β含量明显升高。在治疗后，各龙胆草水提物组及甲硝唑组血清TGF-β显著高于对照组(P < 0.05)(表 6)。
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表 6 龙胆草水提物对血清中MHC-Ⅱ、TGF-β的影响(x±s) Table 6 Effects of Gentian water extract on MHC-Ⅱ, TGF-β in serum(x±s) |
按照中兽医辨证施治理论，鸽毛滴虫病的发生多由湿热内蕴引起，所以治疗原则应以清热燥湿为主。研究表明香薷[18]、莳萝子挥发油[19]、参菊[20-21]、白头翁[22-23]、艾叶[24]等中药以及中药熏洗联合甲硝唑[25-29]具有抗毛滴虫的功效；苦参、鸡冠花、花椒[17]等中药水煎提取物，滴虫净、灭滴灵等组方，以及青蒿精油、天竺葵精油等活性成分，可在短时间内降低鸽场毛滴虫感染率或治愈病鸽。大蒜素、茜草素[30]、蛇床子素[31]、蒲公英的甲醇提取物在体外也能抑制和杀死毛滴虫，此类具抗毛滴虫功效的中药多为清热燥湿类。龙胆草味苦，性寒，其根及根茎中含有多种化合物，大致分为三萜类、黄酮类、环烯醚萜类、口山酮类、生物碱类[12]。其中环烯醚萜类化合物及口山酮类化合物既是龙胆科植物的特征性成分也是主要的药效成分[13]。如龙胆苦苷是一种环烯醚萜类化合物，除了可以作为苦味健胃剂还具有保肝、利胆、抗炎及解痉止痛等作用[14]。龙胆苦苷遇氨水易转化为龙胆碱、龙胆醛等，其抗炎药效是龙胆苦苷和龙胆碱的加和，在炎症早期起到抑制作用[15]。2010版《中华人民共和国药典》一部中写道，龙胆草具有“清热燥湿，泻肝胆火”的功能，与古方中的清热泻火、清热利湿、清肝明目的功效基本一致，即以清热为主导，故可以用作在临床上抗鸽毛滴虫的天然植物药物。
治疗鸽毛滴虫病常用的化学药物有甲硝唑、替硝唑和其他硝唑类药物，毒副作用大，并且有一定的复发率。当前，天然植物及植物提取物作为饲料添加剂的研究成为了热点。天然植物药物来源广泛、种类多、生产过程对环境污染较小、长期服用无毒副作用。在龙胆草体外抗虫试验中，其药效作用达到了化药甲硝唑的疗效。在龙胆草体内抗虫试验中，由于甲硝唑血药浓度达峰时间及药物维持时间较短，故在第31天杀虫率为0，而龙胆草500 mg ·只-1组在第31天仍具有一定杀虫效果，说明在该剂量下，龙胆草药效持续时间长于甲硝唑(表 4)。在肝损伤方面，中药组血清ALT含量在0~15 d呈下降趋势，15 d降至最低，后期由于药效降低，杀虫效果减弱，虫体迅速增殖，使得血清ALT含量在15~31 d呈上升趋势，但仍达到了与甲硝唑组相同的作用趋势。此外AST/ALT比值能够粗略地判断肝疾病的病程、严重程度以及病情的预后，在肝发生炎症时，可使血清AST升高幅度比较ALT大。试验中，AST/ALT比值在0~15 d呈上升趋势，15~31 d呈下降趋势，说明用药后期能够改善慢性炎症。在抗炎方面，龙胆草水提物对病鸽体内炎症因子水平的影响能够达到与甲硝唑同样的水平。此外，龙胆草对体重降低的病鸽有恢复体重的作用(图 4)，并可以提高患病肉鸽存活率(图 5)，且无显著毒副作用，因此龙胆草可以用作抗鸽毛滴虫病潜在的天然药物开发。
清热燥湿类药物种类繁多，可从中继续挖掘具有抗鸽毛滴虫功效的药物，与中药龙胆草联合使用，以期达到更好的疗效，今后可用作新兽药、饲料添加剂等。
4 结论龙胆草水提物对治疗鸽毛滴虫病具有显著的临床药效，其药效作用达到了化药甲硝唑的疗效，且无显著的毒副作用，因此，龙胆草可以用作抗鸽毛滴虫病潜在的天然药物开发。
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(编辑 白永平)