马立克病(Marek′s disease，MD)是鸡的一种传染性肿瘤病，以淋巴组织增生和肿瘤形成为主要特征[1]。近年来, 我国山东、河南、吉林、广西等地不断有从免疫鸡群中分离到MDV强毒株的报道，因此MD仍然是鸡最重要的传染病之一，MD肿瘤发生、发展机制和有效防控仍是该病研究的重要方向。病毒诱发的肿瘤是病毒致瘤因子和宿主之间的相互作用的结果，宿主自身基因的变化也是肿瘤形成的重要因素。宿主基因突变是肿瘤形成过程中的关键驱动力量，肿瘤的产生被认为依赖于获得的遗传不稳定性[2]，而基因组微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)是遗传不稳定性的主要形式，表现为肿瘤组织相对于健康组织微卫星序列重复单位的插入或缺失，造成微卫星长度的改变[3]。研究表明多种病毒性肿瘤，如人类T细胞白血病病毒1型，丙型肝炎病毒，EB病毒等诱导的肿瘤中都存在基因组不稳定性[4-6]。研究还发现EBV DNA酶可能直接诱导人上皮细胞DNA损伤或者间接抑制DNA修复，导致MSI，基因突变，继而发生癌变[6]。关于微卫星不稳定的检测目前主要有PCR单链构象多态性(PCR-SSCP)、多重荧光PCR毛细管电泳法、二代测序(NGS)等方法。PCR-SSCP操作复杂，耗时较长，不适用于高通量的检测。多重荧光PCR毛细管电泳法是检测MSI的方法学“金标准”，但是操作过程复杂，荧光标记引物费用较高，结果判断中会面临荧光过强或过少，非特异性峰、不显著的峰大小改变，杂合性缺失等问题[7]。NGS与传统PCR方法相比具有通量高、灵敏度强和特异性强等特点，可以实现对样本中多个微卫星位点和多个疾病相关基因同时检测，但是由于成本和周转时间的限制，使得基于NGS的MSI检测方法未能在临床实践中常规使用[8]。高分辨率熔解曲线(high resolution melting，HRM)是2003年兴起的一种基因序列分析新技术，不仅可检测基因单核苷酸多态性、插入缺失、串联重复序列、甲基化和线粒体单体型，而且还可用于突变扫描和荧光聚合酶链反应仪的温度校验。具有快速、准确、廉价、闭管操作等优点，现已广泛用于医学、遗传学、微生物学、动植物学、法医学和农业等学科[9]。因此本研究采用HRM方法检测MD肿瘤基因组微卫星序列相对于健康组织(肌肉组织)的变化，揭示MD肿瘤发生后MSI现象。
1 材料与方法 1.1 主要试剂LightCycler 480 High Resolution Melting Master购自Roche公司。蛋白酶K购自天根生化(北京)有限公司。DNA提取酚试剂购自北京索莱宝科技有限公司。裂解液(100 mmol ·L-1 Tris-HCl，25 mmol ·L-1 EDTA，1% SDS)。枸橼酸葡萄糖合液(二水枸橼酸钠13.2 g，一水枸橼酸4.8 g，一水葡萄糖14.7 g，溶于1 L水中)。TE缓冲液(10 mmol ·L-1 Tris-HCl，1 mmol ·L-1 EDTA，pH 7.6)
1.2 样品采集山东某鸡场，京红蛋鸡，1日龄接种MDV疫苗，4月龄发病，观察整个鸡群的健康状况以及临床症状。颈静脉放血，处死，然后打开腹腔观察肝、脾、肾、睾丸、卵巢等内脏器官的病理变化。血液样品：挑选精神沉郁、羽毛蓬松，消瘦，后麻痹的病鸡，心脏采血，枸橼酸葡萄糖合液抗凝，保存于冻存管中。组织样品：每只鸡采集肌肉、肝、脾、肾和肿瘤等组织样品，组织取样在组织离体30 min内完成，取样动作迅速，将组织切成小块，一份置于离心管内，放于泡沫箱中，冰块低温运输保存，用于DNA提取；一份放入青霉素瓶内，加入10倍体积的10%福尔马林溶液，常温运输保存，用于组织病理学检查。
1.3 组织病理学检查取出10%的福尔马林中固定的肝组织修剪成小块，经过脱水、透明，浸蜡制备石蜡包埋切片，然后进行HE染色，光学显微镜观察组织病理学变化并拍照记录。
1.4 病毒PCR检测取组织样品0.1 g置于2 mL离心管中，加入1 mL裂解液，用电动匀浆器研磨组织，形成组织悬液。采用蛋白酶K消化、苯酚抽提的方法提取样品中总DNA[10]。马立克病病毒(MDV)检测采用引物MDV meq F：5′-GCGAATTCTATGTCTCAGGAGCCAGAGCC-3′，MDV meq R：5′-TTATCT-CGAGTCAGGGTCTCCCGTCACC-3′，扩增MDV基因片段长度为1 039 bp[11]；禽白血病病毒(ALV)检测采用引物ALV F：5′-CATGCCTGTAGTGATTAAGACA-3′，ALV R：5′-TCTAGCACATATTTGATTATC-3′，扩增目的片段大小675 bp[12]；禽网状内皮组织增生症病毒(REV)检测采用引物REV F：5′-CGCTGGCTCGCTAACTGCCAT-3′，REV R：5′-ACGGATTCAGTCCGGATCCCT-3′，扩增目的片段大小467 bp[12]；PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。得到的序列采用DNAstar软件包的中SeqMan软件进行拼接，得到的meq基因序列在NCBI数据库中(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)与国内外的MDV分离株meq基因序列进行比较。
1.5 微卫星位点选择与引物的合成参考鸡遗传图谱，根据本实验室前期的研究结果[13]，选择15个微卫星标记(ABR0026、ABR0382、ABR0433、MCW0036、MCW0200、MCW0220、ABR0672、ADL0198、ABR0549、ABR0287、ABR0532、ADL0268、LEI0104、LEI0124) 进行高分辨率熔解曲线分析，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.6 微卫星标记HRM检测根据病理剖检的结果，采集5只病变较为明显的MD病鸡的肌肉、肝、脾、血液及肿瘤结节(5号鸡)样本。采用蛋白酶K消化、苯酚抽提的方法提取样品中总DNA。用TE缓冲液将DNA浓度统一调整为100 ng ·μL-1，然后置于-20 ℃冷冻保存备用。
使用LightCycler 480实时荧光定量PCR系统(罗氏)配套的LightCycler 480 High Resolution Melting Master试剂(罗氏)和96孔板(白色)。20 μL PCR反应体系Master Mix(2×conc)10.0 μL，微卫星扩增的上、下游引物混合物(5 μmol ·L-1)1.0 μL，MgCl2(25 mmol ·L-1)2 μL，DNA模板1 μL，补水至20 μL。LightCycler 480实时荧光定量PCR系统高分辨率熔融曲线程序：采用覆盖65~53 ℃退火温度的降落PCR方案。PCR反应程序和参数设置如表 1所示。比较分析不同样品之间15个微卫星标记熔解曲线的差别。先观察是否有扩增曲线，是否为特异性扩增，获得扩增曲线后，在软件分析模块选项中使用Gene scanning选项进行分析，选取扩增曲线拐点前后区域进行分析，观察曲线分群，分析系统软件自动将不同分群曲线以不同颜色区分。
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表 1 HRM反应程序参数 Table 1 Parameters of HRM program |
挑选HRM检测结果中发现有明显差异的样品，将其PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。配制5.5%聚丙烯酰胺凝胶：丙烯酰胺∶双丙烯酰胺溶液(29 ∶1)18 mL，10×TBE缓冲液10 mL，去离子水61.5 mL，甘油10 mL，加入10 mL新配制的1%过硫酸铵，然后在通风橱中加入70 μL TEMED，充分混匀后迅速灌制凝胶，室温聚合1 h左右备用。取4 μL PCR产物加入10 μL甲酰胺上样缓冲液，混匀后进行94 ℃变性5 min，于冰上迅速冷却。取5 μL样品加到聚丙烯酰胺凝胶加样孔中，垂直电泳仪200 V电泳，具体电泳时间由溴酚蓝指示剂的位置来确定。电泳结束后用硝酸银染色[13]，在Bio-Rad凝胶成像分析仪下观察电泳结果，并分析各泳道条带增多、减少或位置发生改变的情况。
1.8 微卫星序列分析同一个微卫星标记的PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，若在同一只鸡的肌肉、肝、肿瘤样品中观察到电泳条带存在差异，则对差异电泳条带进行切胶处理。用手术刀片小心切取差异的电泳条带，将切下来的胶条置于1.5 mL的离心管中，100 μL TE缓冲液漂洗3次，每次浸泡5 min。然后将胶条置于新的离心管中，100 μL TE缓冲液浸泡12 h。取5 μL上清液作为模板，用相对应的微卫星标记PCR扩增使用的引物再次进行PCR扩增。PCR产物采用2%琼脂糖凝胶电泳35 min，切取电泳条带，采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化PCR产物。纯化的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。得到的序列采用DNAstar软件包的中SeqMan软件进行拼接，采用MegAlign软件比较肌肉、肝、肿瘤扩增片段的基因序列的差别。
2 结果 2.1 MD临床症状及病理学变化患病鸡表现为精神萎靡，消瘦，羽毛蓬乱，个别鸡翅膀下垂，劈叉姿势，扭头、仰头等症状，死亡率约30%。剖检后主要的病理变化如图 1所示，肝体积增大，少数病鸡(约3%)肝表面有孤立的隆起结节，多数病鸡(约90%)肝表面和切面有灰白色的结节。脾肿大(约80%)，表面和切面有灰白色的致密的结节样病灶。肾肿大(约70%)，表面和切面有灰白色的致密的结节样病灶。其他内脏器官病理变化不明显。少数(约5%)鸡坐骨神经轻度增粗，水肿。组织病理学检查如图 2所示，低倍镜下可见肝小叶之间界限不清，肝小叶内有多个肿瘤灶，高倍镜下可见肝窦内大量肿瘤细胞浸润，肝细胞严重变性坏死，肝窦扩张，可见肝索排列紊乱，肿瘤细胞形态多样，包含大、中、小淋巴细胞，成淋巴细胞，核质比高，部分肿瘤细胞可见有丝分裂像。
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A. 肝肿大，表面及切面大量灰白色小结节；B. 脾肿大，表面大量灰白色小结节；D. 肾肿大，表面大量灰白色小结节 A. The liver was enlarged with numerous small gray-white nodules on the surface and in the section of the liver; B. The spleen was enlarged with numerous small gray-white nodules on the surface; C. The kidney was enlarged with numerous small gray-white nodules on the surface 图 1 病理剖检变化 Fig. 1 Changes in pathological autopsy |
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A. 肝小叶内大量肿瘤细胞增生，形成肿瘤灶(H.E 10×)；B. 肝窦内大量肿瘤细胞浸润，肝索排列紊乱(H.E 40×)；C. 肿瘤细胞形态多样，小(白色箭头)、中(白色箭号)、大(黑色箭号)淋巴细胞，部分肿瘤细胞可见有丝分裂像(黑色箭头)(H.E 100×) A. Numerous tumor cells were proliferated in the hepatic lobules, forming tumor focus (H.E 10×); B. Numerous tumor cells infiltrated in the hepatic sinusoids, and hepatic cord arrangement were disordered (H.E 40×); C. Pleomorphic lymphoid cells, including lymphoblasts (arrows black), small (arrows heads white), medium (arrows white) and large lymphocytes (arrow white) were present in live tissues. Mitotic figures can also be seen in live tissues (arrow heads black) (H.E 100×) 图 2 肝组织病理学切片 Fig. 2 Pathological examination of the chicken live tissues |
随机挑选5个肾组织样品进行PCR扩增，结果如图 3所示，5个样品均能够扩增出MDV 1 039 bp的meq基因目的片段，而ALV和REV病毒PCR扩增均为阴性，进一步说明这些病鸡为MDV感染，不存在ALV和REV病毒感染及混合感染的情况。测序后与NCBI数据库中的MDV meq基因进行序列比较，此次山东分离的MDV毒株与近年来我国境内江苏分离株JS201801相同，相似性为100%，与其他省市分离株(河南HNXZ101，山东QD01311，广东GD20QY04A，安徽AN-1，吉林JL/1404，黑龙江WC/1203，广西GX0101)的相似性也高达99.69~99.90%。与国外早期分离的经典强毒株(848A、MD5、RB1B)相似性为98.64%~99.16%。与常用的疫苗毒株的相似性略低，与CVI988疫苗株相似性为98.26%，与814疫苗株相似性为98.96%。此次山东分离株与国内近年来分离的强毒株处于同一分支，亲缘关系较近，与国外强毒株和疫苗毒株亲缘关系较远。
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1、4、7、10、13. MDV检测；2、5、8、11、14. ALV检测；3、6、9、12、15. REV检测；M.DL2000 DNA相对分子质量标准；17~19. MDV，ALV，REV阴性对照 1, 4, 7, 10, 13. Detection of MDV; 2, 5, 8, 11, 14. Detection of ALV; 3, 6, 9, 12, 15. Detection of REV; M.DL2000 DNA marker; 17-19. Blank control of MDV, ALV, REV 图 3 MDV、ALV、REV病毒PCR检测 Fig. 3 Detection of MDV, ALV, REV by PCR |
采用LightCycler 480系统中的Gene scanning选项进行熔解曲线分析，得到归一化处理后的差异熔解曲线，如图 4所示，15个微卫星标记中有14个微卫星标记存在肌肉组织和其他组织(肝、脾、血液、肿瘤)之间熔解曲线差异，即存在微卫星不稳定性(MSI)。
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图 4 14个微卫星标记的高分辨率熔解曲线(差异熔解曲线) Fig. 4 HRM of 14 microsatellites (difference plots) |
统计不同病鸡和不同微卫星标记熔解曲线的差异如表 2所示，5号病鸡存在明显较大的肿瘤结节，15个微卫星标记中14个存在差异。其他4只病鸡主要表现为脏器肿大，组织内弥漫性分布灰白色的肿瘤小结节，与正常组织之间没有明显的界限，存在MSI的微卫星标记较5号鸡少。其余4只鸡15个微卫星标记存在MSI的频率分别为3/15，2/15，5/15，7/15。同一个微卫星标记在不同的发病鸡样品中出现MSI的频率不相同，在15个微卫星标记中，MCW0200和MCW0220两个微卫星标记出现MSI的频率最高，在所有的发病鸡样品中都存在MSI。其次是ABR0549微卫星标记，在4只鸡的样品中存在MSI现象。另外，ADL0198微卫星标记在所有鸡的样品中都不存在熔解曲线的差异。
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表 2 不同病鸡和不同微卫星熔解曲线差异统计分析 Table 2 Statistical analysis of difference plots in chickens and microsatellites |
挑选HRM检测结果中发现的有明显差异3个微卫星标记(MCW0200、ABR0549和ABR0220)的样品，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图 5所示，肿瘤、肝、脾和肌肉组织之间的电泳条带的大小存在明显的差异。MCW0200微卫星标记肌肉组织样品的PCR产物条带小于肿瘤、肝、脾组织。ABR0549和ABR0220微卫星标记肌肉、肝、脾组织样品的PCR产物小于肿瘤组织。对存在差异的条带进行切胶测序分析，序列的峰图比较如图 6所示，MCW0200微卫星标记肿瘤组织中简单重复序列(CA)重复15次，比肝和肌肉组织中的重复次数增加了6次，肿瘤中(TA)重复了2次，比肝和肌肉组织中的重复次数减少了1次，另外肝中比肿瘤和肌肉中增加了2个碱基(AA)序列。ABR0549微卫星标记肿瘤组织中增加了2个(CA)重复。MCW0220微卫星标记肿瘤、肝、肌肉组织中的简单重复序列的重复次数没有差异，但是肿瘤相对肝和肌肉组织插入了一段GAGTGTTT序列。
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A. MCW0200(1. 肝；2. 肿瘤；3. 肌肉；4. 脾)；B. ABR0549(1. 肿瘤；2. 肝；3. 肌肉；4. 脾)；C. MCW0220(1. 脾；2. 肌肉；3. 肿瘤；4. 肝) A. MCW0200 (1. Liver; 2. Tumor; 3. Muscle; 4. Spleen); B. ABR0549 (1. Tumor; 2. Liver; 3. Muscle; 4. Spleen); C. MCW0220 (1. Spleen; 2. Muscle; 3. Tumor; 4. Liver) 图 5 微卫星标记聚丙烯酰胺凝胶电泳 Fig. 5 Polyacrylamide gel electrophoresis of microsatellite markers |
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A. MCW0200(肿瘤相对于正常肌肉组织简单重复序列CA增加6次，TA减少1次；肝比肌肉、肿瘤组织增加2个碱基AA)；B. ABR0549(肿瘤相对于肝、正常肌肉组织简单重复序列CA增加2次)；C. MCW0220(肿瘤、肝、正常肌肉组织简单重复序列CA重复次数相同，肿瘤增加了GAGTGTTT序列) A. MCW0200 (The repetitive unit of CA was increased 6 times and TA decreased 1 time in tumor samples. Two bases were inserted in liver comparing to muscle and tumor); B. ABR0549 (The repetitive unit of CA was increased 2 times in tumor samples); C. MCW0220 (The number of repetitive units, CA, were same in muscle, tumor and liver, however a fragment GAGTGTTT was inserted in tumor) 图 6 微卫星标记测序峰图比较 Fig. 6 Sequence alignment of microsatellite markers |
马立克病是马立克病病毒感染鸡后引起的一种淋巴细胞增生为主要特征的病毒性肿瘤病，虽然疫苗能较好地预防该病的发生，但伴随着病毒自身进化及疫苗免疫压力，MDV流行毒株的毒力正不断增强，因此MD肿瘤发生发展的机制和有效防控仍是该病研究的重要方向[14]。山东省农业科学院检测2022年第3季度MD发病率为3.33%[15]。本研究从山东某鸡场采样，该鸡场鸡群发病年龄为4月龄，主要的临床表现符合MD肿瘤发病后消瘦，精神沉郁的特点，同时也表现出神经系统损伤后翅膀下垂，后肢麻醉，头颈歪斜等特点。病理剖检可以看到肝、肾、脾等脏器表面和内部有大量灰白色结节状的肿瘤病灶，符合MD内脏肿瘤的特点。组织病理学符合MD肿瘤细胞大小不一淋巴细胞的特征。PCR也能检测到病料中的MDV，因此确诊该鸡场鸡群患MD。虽然该鸡群1日龄已经接种过MDV疫苗，但是仍然发生MDV感染，且meq基因序列与国内近年分离的强毒株相似性高达99.69~100%，说明MDV可能突破目前商品疫苗所提供的保护，这给MD的防控带来了新的挑战[16]。
目前存在很多关于肿瘤发生的理论，包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活、细胞增殖周期控制点的失控、基因组的不稳定、端粒酶耗损、抗凋亡基因过表达等理论，这些理论的共同特点：肿瘤是由于DNA受到损伤，遗传物质改变引起的[2]。病毒感染或表达的蛋白也可以直接或间接的激活DNA损伤信号通路。MDV感染使机体产生氧化应激反应，抗氧化酶活性降低，丙二醛、蛋白羟基和一氧化氮浓度升高，大量自由基在体内蓄积，造成DNA损伤[17]。MDV感染抑制DNA损伤应答(DDR)通路，DDR信号通路受损使得细胞的DNA复制正确率下降以及DNA修复功能遭到破坏，这些效应共同加剧了细胞基因组的不稳定性，这些基因组的不稳定性可进一步导致细胞的癌变或病变[18]。MSI是遗传不稳定性的主要形式，MSI最早发现于遗传性非息肉性结肠癌中，目前在许多肿瘤中都发现MSI现象，如结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等恶性肿瘤[19]。本研究发现在MD肿瘤中也存在微卫星不稳定的现象，15个微卫星标记中14个微卫星标记扩增后均表现为不稳定，这与医学上发现的肿瘤MSI现象相似[18]。同时也发现，来源于不同鸡的组织发生MSI的频率不同，本研究5号鸡发生的MSI的微卫星个数为14个，而其他鸡只有7个及以下。主要由于5号鸡样本中有肿瘤组织，肝上存在明显的肿瘤结节，而其他鸡的样本仅表现为肝、脾肿大，表面有小结节，肿瘤组织与正常组织之间的界限不清，在取样时肿瘤组织中常混有正常的组织，检测时正常组织PCR扩增产物会掩盖肿瘤组织的PCR产物，因此发生MSI的微卫星的个数没有肿瘤多。
目前关于肿瘤基因突变的检测技术方法(电泳、质谱、测序等)操作复杂，时间较长，费用成本较高[20]。高分辨率熔解曲线分析技术(HRM)是近年来发展起来的用于突变扫描和基因分型的新技术。熔解曲线与DNA的序列长度、GC含量及双链互补性相关，碱基序列发生替换、缺失、插入等改变均可引起DNA熔解曲线的变化，通过高灵敏度荧光定量PCR仪检测的熔解曲线变化，把野生型、纯合突变型及杂合突变型予以鉴别[21]。HRM技术在基因突变筛查中具有较高的灵敏度，研究表明HRM检测结肠癌患者KRAS基因突变，检出率高于Sanger测序法，检测敏感性为100%，特异性为95.24%，而且操作简便、节约时间[22]。HRM在检测小于400 bp的PCR产物时，灵敏度特异性均为100%；而检测长达1 000 bp的PCR产物时，灵敏度仍高达96.1%，特异性99.4%[20]，变异位点在PCR产物的位置并不影响扫描的精确性。微卫星DNA片段长度通常小于350 bp，正好在HRM检测范围内，所以用HRM方法检测MSI方便适用。本研究采用LightCycler 480系统中的Gene scanning得到归一化处理后的差异熔解曲线，正常组织和病变组织或肿瘤组织之间的熔解曲线形状存在明显的差异。为进一步验证这种差异，将各组织的PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果也发现不同组织之间的电泳条带的大小也存在差异，通过切胶纯化、测序的结果进一步证明他们之间的差别，肿瘤或病变组织相对于正常组织存在微卫星重复单位的增多或减少，基因片段的插入等情况。上述结果说明HRM技术可以应用于肿瘤中MSI的检测，且操作简单，可实现高通量的检测。
4 结论本研究采集MD自然发病鸡的组织样本，通过高分辨率熔解曲线分析技术发现MD发病鸡的肌肉、肝、脾、血液、肿瘤组织中微卫星标记PCR扩增后的熔解曲线存在明显的差异，碱基序列存在微卫星重复单位的增多、减少或基因片段的插入或缺失，即存在MSI现象。肿瘤生物学研究表明MSI是错配修复(mismatch repair，MMR)系统缺陷的表现形式，MMR系统是细胞复制后的一种修复机制，该系统能特异性地识别和修复DNA复制过程中出现的碱基错配、插入和缺失等，从而起到维持整个基因组稳定、降低自发突变的功能，同时也是防止肿瘤发生的重要屏障[2]。然而在MD肿瘤形成过程中是否伴有宿主MMR功能的异常尚没有相关的研究报道，这也为MD肿瘤形成机制的研究提供了新的思路。
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(编辑 白永平)