, XU Lu, ZHU Yuanyuan, XU Yuan, ZHANG Qianyi, LI Cui, LI Ming, XIA Yingju, WANG Qin, LIU Yebing, ZHAO Qizu
, ZOU Xingqi
猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高发病率、高死亡率的急性、热性、接触性传染病。该病没有固定的季节性，给全球的养猪业带来了巨大的经济损失。猪瘟病毒为猪瘟的病原，属于黄病毒科瘟病毒属，为单股正链RNA。CSFV基因组全长12.3 kb，唯一的开放性阅读框编码一个多聚蛋白，该多聚蛋白由3 989个氨基酸残基组成，在宿主细胞内蛋白酶和病毒特异的蛋白酶作用下裂解成12个成熟蛋白，从N端到C端依次是Npro、C、Erns、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B[1-4]。我国使用猪瘟病毒C株很好地控制了猪瘟疫情，但要净化猪瘟，则需要通过检测抗体来区分自然感染和疫苗免疫动物，因此, 标记疫苗的研究迫在眉睫[5]。E2在CSFV所有蛋白中免疫原性良好，可以产生有效的中和抗体，从而对动物提供保护[6]。有研究者发现, 猪瘟WH303单抗可以和CSFV的56个病毒株反应，但是不能和其他瘟病毒属成员，如BVDV、BDV反应[7]。据推测，WH303可以识别CSFV上保守的一个肽段，该肽段也正是可以区分CSFV和BVDV以及BDV的关键。在此基础上，有研究者用分子克隆方法敲除猪瘟病毒Alfort187株E2区段内的221个氨基酸，通过分段表达E2蛋白最终确定WH303最小识别基序为TAVSPTTLR[8]。2014年，有学者在猪瘟强毒BICv基础上，插入特异性片段flag，构建FlagT4v[9]，后又在FlagT4v基础上构建FlagT4Gv，解决了传代毒力返强的问题[10]。目前, 很大一部分猪瘟标记疫苗都是在强毒基础上构建的，存在不可控的生物安全隐患，如果以弱毒C株为基础，构建标记疫苗，可以从根本上解决这一问题，同时能够保持C株优秀的免疫效果。本试验以C株和实验室已成功构建的C-flag株[11]为基础，通过突变WH303位点，使该位点序列与BVDV NADL株保守序列一致[8]。并对病毒进行拯救，以期得到WH303单抗反应为阴性的突变毒株。
1 材料与方法 1.1 细胞系和病毒感染性克隆PK15细胞由中国兽医药品监察所保存；C株半长感染性克隆CH、CH-flag，C株全长感染性克隆C株和C-flag感染性克隆由本实验室构建保存；单抗WH303由英国APHA Weybridge的Trevor Drew教授惠赠、单抗1C8由本实验室制备保存。
1.2 试剂pGEM-T easy载体：Promega生物技术有限公司；限制性内切酶：SnaB Ⅰ、NgoM Ⅳ、BamH Ⅰ、Not Ⅰ、Sac Ⅰ：NEB公司；羊抗鼠二抗(HRP)(CW0102 S)：康为世纪生物科技有限公司(50230)；羊抗鼠二抗(FITC)(F9006)：赛默飞生物科技有限公司(SLBQ6729V)；MEM(11095-080)：Gibco公司(1858767)；胎牛血清(16010-159)：Gibco公司(8174565)；反转录试剂盒：天根生物科技有限公司(Q5504)；猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒：爱德仕生物科技有限公司；猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒：中国兽医药品监察所
1.3 实验动物实验兔：日本大耳白兔(2~3 kg)20只，购自北京隆安实验动物养殖中心。
1.4 WH303位点的突变通过重叠PCR扩增得到突变片段M，再将其连接至T载体，经过筛选得到阳性克隆MT。以MT为模板，引物P297、P298为模板，进行PCR扩增。得到的产物进行测序，与引物P582、P583序列比对，验证是否突变成功。突变与验证引物序列见表 1。
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表 1 引物序列 Table 1 Primer sequence |
通过酶切连接的方法，先将MT连接至猪瘟病毒C株半长CH、CH-flag，再连接至全长C株和C-flag，得到WH303突变的C株全长感染性克隆MC和MC-flag。将MC和MC-flag分别进行酶切鉴定(表 2)，同时进行PCR测序后进行比对，验证突变稳定性。
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表 2 重组质粒对应的内切酶与理论条带大小 Table 2 Endonuclease corresponding to recombinant plasmid and theoretical band size |
大量提取MC和MC-flag质粒，进行线性化处理、去RNase操作后，按照转录试剂盒操作，体外合成RNA。将合成的MC和MC-flag RNA电转至PK15细胞，每个样品加入10 μL RNA和密度为1×107个·ml-1的细胞，均以750 V、25 μF电击，同时设不加RNA的空白对照。每个样品加入到10 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基中，然后分别转移至6孔细胞培养板中，在37 ℃，5%CO2培养。
1.7 带毒细胞的传代与检测将MC电转后长满的PK15细胞按1∶3传代，培养48 h，在细胞生长密度达到90%左右时，再次进行传代。按照上述方法，传代至17代。取F0、F6、F12、F17细胞培养液上清进行RT-PCR，同时对细胞进行IPMA检测。
1.8 MC株兔体传代与检测MC株在实验兔中传3代，第一代MC株、C株各4只，对照2只；第二代MC株4只、对照1只；第三代MC株4只，对照1只。以耳缘静脉注射接种，每只接种1 mL。接种后测量实验兔体温。第一代接种C株兔和第三代接种MC株兔安乐死后取脾组织，制备组织切片。分别用单抗WH303和单抗1C8进行免疫组织化学试验，比较接种C株和MC株兔脾组织对两种单抗的不同反应。
2 结果 2.1 MC和MC-flag酶切鉴定结果以限制性内切酶对MC和MC-flag构建过程中的阳性质粒进行酶切鉴定，得到的条带均符合预期(图 1)。测序结果与引物P582、P583进行序列比对一致，说明WH303突变位点在分子构建过程中保持稳定。
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M. 10000DL bp Marker；1. MC单酶切；2. MC-flag单酶切；3. MC双酶切；4. MC-flag双酶切 M. 10000DL bp Marker; 1. Single restriction of MC; 2. Single restriction of MC-flag; 3. Double restrictions of MC; 4. Double restrictions of MC-flag 图 1 重组质粒酶切鉴定图谱 Fig. 1 Restriction analysis of the recombined plasmids |
转录结果显示有明显条带，说明3株阳性质粒cDNA条带转录成功(图 2)。
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M. DL15000 bp Marker；1. C株；2. MC株；3. MC-flag株； M. DL15000 bp Marker; 1. Strain C; 2. Strain MC; 3. Strain MC-flag 图 2 cDNA转录 Fig. 2 Transcription of cDNAs |
2.3.1 病毒序列比对结果 在F6、F12和F17细胞培养上清中均检测到病毒。PCR产物送测序，与引物P582、P583进行序列比对也一致(图 3)，说明在病毒传代的过程中，突变位点可以稳定遗传。
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图 3 测序后序列比对 Fig. 3 Sequence alignment after sequencing |
2.3.2 IPMA 转染后48 h、F6和F12:C株与WH303和1C8两个单抗反应均为阳性；MC株与WH303反应为阴性，与1C8反应为阳性(图 4)。MC-flag与1C8反应在48 h时可以检测到轻微阳性，F6时显示阴性，说明病毒在传代过程中丢失。
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A. C株WH303；B. C株1C8；C. MC株WH303；D. MC株1C8；E. 阴性对照 A. WH303 IPMA of the rescued strain C; B. 1C8 IPMA of the rescued strain C; C. WH303 IPMA of the rescued strain MC; D. 1C8 IPMA of the rescued strain MC; E. Negative control 图 4 C株与MC株IPMA检测(40×) Fig. 4 IPMA detection of the rescued strain C and MC(40×) |
2.4.1 兔体热反应结果 从兔体发热情况来看，在第一代接种C株的兔中，体温升高情况非常明显，全部达到定型热的标准。但是接种MC株的兔在前两代MC株体温升高情况不明显，以可疑反应为主，少量轻热反应。到第三代体温在72~80 h后有明显升高，升高幅度在1.5~2 ℃，都为定型热反应。兔体温度变化见图 5。
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图 5 参试病毒兔体接种体温测定图 Fig. 5 Body temperature of rabbits inoculated with experimental virus |
2.4.2 组织切片免疫组织化学结果 第三代兔脾组织切片的免疫组织化学染色结果显示，C株与单抗WH303和1C8免疫组织化学反应都为阳性，MC株与单抗WH303免疫组织化学反应为阴性，与单抗1C8反应为阳性，说明MC株的突变WH303表位序列保持稳定，同时又保持识别单抗1C8的能力。对照组与单抗WH303和1C8反应都为阴性。免疫组织化学结果见图 6。
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图 6 兔脾组织免疫组织化学结果(20×) Fig. 6 Immunohistochemical results of rabbits spleen (20×) |
反向遗传学操作平台，是应用于RNA病毒基因构建比较成熟的技术方法。邹兴启等[12]完成了C株全长cDNA感染性克隆的构建和拯救；朱元源等[13]和韩焘[11]分别在猪瘟石门株和猪瘟C株的基础上，插入标记多肽flag片段，构建并拯救带有flag阳性标记的毒株。Flag是专为标记而设计的多肽标记物，为非已知蛋白。与插入flag的阳性标记相比，本研究在C株和C-flag株的基础上突变WH303位点，构建阴性标记。相较于阳性标记，阴性标记可以减少阳性标记鉴定中弱阳性和假阳性的干扰，在鉴定过程中更为直观。遗憾的是，MC-flag在拯救后传代的过程中丢失，没能构建成功同时含有阴性标记和阳性标记的C株突变毒株。由于MC株在传代的过程中1C8单抗反应阳性率也明显低于C株，据此推测，WH303结合位点对原毒株的增殖和传代可能会有一定影响。如何验证这一猜想并有针对地减少这种影响，保证突变毒株的复制效率还有待后面进一步的研究。
本研究利用重叠PCR的方法达到特异片段突变的目的，在实际操作中，直接以回收片段为模板扩增没有成功扩增出突变后的297~300片段。针对这种情况，采用不加引物延伸补平后加引物扩增，通过对比试验找出了最佳的无引物扩增循环数，为这一操作方法提供数据支撑。
在MC构建过程中，采用琼脂糖凝胶电泳观测特异性PCR条带、PCR产物测序和酶切3种方法，实时验证每一步构建结果的准确性和WH303位点突变的稳定性。测序结果与引物P582、P583序列比对，结果都显示吻合，这说明WH303位点突变后是稳定的，没有在后续的操作过程中发生回复突变。在MC全长阳性克隆构建完成后，选用了ScaⅠ单酶切和NotⅠ、BamHI双酶切两组酶切进行验证，结果显示产生的条带均与理论值相符。
单抗1C8与WH303都位于猪瘟病毒E2基因中的保守位点，1C8位于898~906位[14]，WH303位于829~837位，二者位置不重叠。单抗1C8研究目前已经比较成熟，可以作为IPMA的阳性对照。IPMA使用C株作为病毒株阳性对照，使用单抗1C8作为单抗阳性对照。结果显示，MC株与WH303反应为阴性，而与1C8反应为阳性，而C株与两个单抗反应都为阳性，这说明成功拯救的MC株达到了预期的标记效果。MC-flag虽然在转染后检测到病毒存在，但在后续传代过程中丢失，可能是由于WH303的突变影响了病毒的增殖能力所致，具体原因还需要后续试验进一步探究。
从IPMA结果中可以看出，MC株与C株在PK15细胞中传代时随着代次的增加，阳性率略有所下降，因此需要确定突变对病毒增殖是否有影响。影响病毒增殖的因素有很多，培养温度、血清、培养基、微量化学物质等，以及病毒在感染细胞时与细胞本身的相互作用都会对病毒基因组复制产生影响[15]。E2蛋白位于病毒囊膜表面，是变异程度较大的一个蛋白。但是，单克隆抗体WH303位点位于E2上的保守抗原表位中。猪瘟病毒表面抗原决定簇主要分布在A、B、C、D四个结构域中[16-17]，这四个结构域都位于E2蛋白[18]。E2蛋白参与病毒对细胞感染的过程，携带有能刺激CSFV中和抗体产生的抗原决定簇。所以，不排除WH303表位的阴性突变对病毒E2结构蛋白产生影响进而影响其增殖的可能性。由于猪瘟病毒增殖不引起细胞病变，可与传代细胞共繁殖。带毒细胞传代繁殖病毒，但病毒增殖速率达不到细胞增殖速率时，通过IPMA检测病毒阳性率可能呈下降趋势。当前，我国宁宜宝等[19]通过ST传代细胞繁殖猪瘟C株，细胞维持时间可达20~30 d，解决了猪瘟病毒C株生产培养的难题，因此后续可尝试在ST细胞中繁殖，优化生产工艺以增加病毒滴度。
区分疫苗免疫与野毒感染的标记疫苗已经成为猪瘟防控研究中的热点，国内外学者已经做了大量研究。Flc9和Flc11通过C株与牛病毒性腹泻病毒II(BVDVII)5250株重组构建而来[20]，具有良好的免疫原性，且不在动物中水平传播[21]。CP7_E2alf是以BVDVCP7株为框架，通过反向遗传学方法用CSFV187株的E2基因替换CP7株相应区段构建而来[22]。接种猪后，细胞因子TNF-ɑ和IL-6含量明显降低，而IFN-γ和IgG2含量却明显升高，说明了CP7_E2alf在细胞免疫方面的重要作用[23]。该疫苗作为欧盟第一个被官方授权的标记疫苗[24]，保护性强于Flc11株[25]，且遗传稳定，更加安全[26]。Hulst等[27]构建了表达E2基因的亚单位疫苗pAcAS3gXE2±TMR，接种猪后可以抵御猪瘟强毒的攻击[27]，其具有良好的安全性，但是免疫效果不如C株。国内已经获批的E2亚单位疫苗有2个，理论上可以通过鉴别Erns蛋白表达抗体达到区分免疫与野毒感染的目的。但由于Erns蛋白在猪体内表达量低，检测难度大，目前还没有成熟的检测方法。在构建标记疫苗候选的毒株的过程中，由于强毒本身的特性，标记位点在传代过程中不稳定，存在回复突变导致毒力返强的问题。猪瘟C株经历了多年的临床实践，成为国内猪瘟防控的“金标准”。MC株在C株的基础上设计构建而来，在一定程度上避免了生物安全隐患。MC株在PK15细胞中传代稳定，突变表位未发生回复突变或其它变异，有望开发成为安全、稳定、有效的猪瘟标记疫苗。
4 结论 4.1以猪瘟C株和C-flag为原材料，成功构建WH303突变毒株MC和MC-flag的阳性克隆。
4.2以PK15细胞为宿主，成功拯救MC株，病毒遗传稳定性良好。
| [1] |
VAN OIRSCHOT J T. Vaccinology of classical swine fever: from lab to field[J]. Vet Microbiol, 2003, 96(4): 367-384. DOI:10.1016/j.vetmic.2003.09.008 |
| [2] |
HULST M M, VAN GENNIP H G, VLOT A C, et al. Interaction of classical swine fever virus with membrane-associated heparan sulfate: role for virus replication in vivo and virulence[J]. J Virol, 2001, 75(20): 9585-9595. DOI:10.1128/JVI.75.20.9585-9595.2001 |
| [3] |
殷震, 刘景华. 动物病毒学[M]. 2版. 北京: 科学出版社, 1997: 645-664. YIN Z, LIU J H. Animal virology[M]. 2nd ed. Beijing: Science Press, 1997: 645-664. (in Chinese) |
| [4] |
RUGGLI N, MOSER C, MITCHELL D, et al. Baculovirus expression and affinity purification of protein E2 of classical swine fever virus strain Alfort/187[J]. Virus Genes, 1995, 10(2): 115-126. DOI:10.1007/BF01702592 |
| [5] |
DONG X N, CHEN Y H. Marker vaccine strategies and candidate CSFV marker vaccines[J]. Vaccine, 2007, 25(2): 205-230. DOI:10.1016/j.vaccine.2006.07.033 |
| [6] |
王琴, 涂长春. 猪瘟[M]. 北京: 中国农业出版社, 2015: 30-32. WANG Q, TU C C. Classical swine fever[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2015: 30-32. (in Chinese) |
| [7] |
EDWARD S, SANDS J J. Antigenic comparisons of hog cholera virus isolates from Europe, America and Asia using monoclonal antibodies[J]. Dtsch Tierarztl Wochenschr, 1990, 97(2): 79-81. |
| [8] |
IN ML, LIN F, MALLORY M, et al. Deletions of structural glycoprotein E2 of classical swine fever virus strain Alfort/187 resolve a linear epitope of monoclonal antibody WH303 and the minimal N-terminal domain essential for binding immunoglobulin G antibodies of a pig hyperimmune serum[J]. J Virol, 2000, 74(24): 11616-11625. |
| [9] |
HOLINKA L G, FERNANDEZ-SAINZ I, O'DONNELL V, et al. Development of a live attenuated antigenic marker classical swine fever vaccine[J]. Virology, 2009, 384(1): 106-113. DOI:10.1016/j.virol.2008.10.039 |
| [10] |
HOLINKA L G, FERNANDEZ-SAINZ I, SANFORD B, et al. Development of an improved live attenuated antigenic marker CSF vaccine strain candidate with an increased genetic stability[J]. Virology, 2014, 471-473: 13-18. DOI:10.1016/j.virol.2014.09.021 |
| [11] |
韩焘. 猪瘟兔化弱毒标记株感染性克隆的构建与病毒拯救[D]. 北京: 中国兽医药品监察所, 2011. HAN T. Construction infectious cDNA of markered classical swine fever virus C strain and virus rescue[D]. Beijing: China Institute of Veterinary Drugs Control, 2011. (in Chinese) |
| [12] |
邹兴启, 赵启祖, 范运峰, 等. 猪瘟病毒C株全长cDNA感染性克隆的构建及病毒拯救[J]. 中国农业科学, 2011, 44(2): 409-416. ZOU X Q, ZHAO Q Z, FAN Y F, et al. Construction of the full length infectious cDNA clones of CSFV C strain and virus rescue[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2011, 44(2): 409-416. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2011.02.022 (in Chinese) |
| [13] |
朱元源, 韩焘, 邹兴启, 等. 猪瘟病毒石门重组标记毒株的构建与拯救[J]. 中国农业科学, 2013, 46(1): 187-194. ZHU Y Y, HAN T, ZOU X Q, et al. Construction and rescue of recombinant classical swine fever virus with Shimen structure protein and flag marker[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2013, 46(1): 187-194. (in Chinese) |
| [14] |
王琴, 徐璐, 张乾义, 等. 一种抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体细胞株及其应用: 中国, 107058239[P]. 2017-08-18. WANG Q, XU L, ZHANG Q Y, et al. A monoclonal antibody cell line against E2 protein of swine fever virus and its application: CN, 107058239[P]. 2017-08-18. (in Chinese) |
| [15] |
TRATSCHIN J D, MOSER C, RUGGLI N, et al. Classical swine fever virus leader proteinase Npro is not required for viral replication in cell culture[J]. J Virol, 1998, 72(9): 7681-7684. DOI:10.1128/JVI.72.9.7681-7684.1998 |
| [16] |
WENSVOORT G. Topographical and functional mapping of epitopes on hog cholera virus with monoclonal antibodies[J]. J Gen Virol, 1989, 70(11): 2865-2876. DOI:10.1099/0022-1317-70-11-2865 |
| [17] |
WENSVOORT G, TERPSTRA C, DE KLUIJVER E P, et al. Antigenic differentiation of pestivirus strains with monoclonal antibodies against hog cholera virus[J]. Vet Microbiol, 1989, 21(1): 9-20. DOI:10.1016/0378-1135(89)90014-X |
| [18] |
WEILAND E, STARK R, HAAS B, et al. Pestivirus glycoprotein which induces neutralizing antibodies forms part of a disulfide-linked heterodimer[J]. J Virol, 1990, 64(8): 3563-3569. DOI:10.1128/jvi.64.8.3563-3569.1990 |
| [19] |
宁宜宝, 吴文福, 林旭埜, 等. 用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法: 中国, 100577204C[P]. 2010-01-06. NING Y B, WU W F, LIN X Y, et al. Method for producing live swine fever vaccine from cell lines: CN, 100577204C[P]. 2010-01-06. (in Chinese) |
| [20] |
VAN GENNIP H G P, VAN RIJN P A, WIDJOJOATMODJO M N, et al. Chimeric classical swine fever viruses containing envelope protein ERNS or E2 of bovine viral diarrhoea virus protect pigs against challenge with CSFV and induce a distinguishable antibody response[J]. Vaccine, 2000, 19(4-5): 447-459. DOI:10.1016/S0264-410X(00)00198-5 |
| [21] |
WIDJOJOATMODJO M N, VAN GENNIP H G P, BOUMA A, et al. Classical swine fever virus Erns deletion mutants: trans-complementation and potential use as nontransmissible, modified, live-attenuated marker vaccines[J]. J Virol, 2000, 74(7): 2973-2980. DOI:10.1128/JVI.74.7.2973-2980.2000 |
| [22] |
REIMANN I, DEPNER K, TRAPP S, et al. An avirulent chimeric Pestivirus with altered cell tropism protects pigs against lethal infection with classical swine fever virus[J]. Virology, 2004, 322(1): 143-157. DOI:10.1016/j.virol.2004.01.028 |
| [23] |
RENSON P, LE DIMNA M, GABRIEL C, et al. Cytokine and immunoglobulin isotype profiles during CP7_E2alf vaccination against a challenge with the highly virulent Koslov strain of classical swine fever virus[J]. Res Vet Sci, 2014, 96(2): 389-395. DOI:10.1016/j.rvsc.2014.01.002 |
| [24] |
BLOME S, WERNIKE K, REIMANN I, et al. A decade of research into classical swine fever marker vaccine CP7_E2alf (Suvaxyn® CSF Marker): a review of vaccine properties[J]. Vet Res, 2017, 48(1): 51. DOI:10.1186/s13567-017-0457-y |
| [25] |
BLOME S, AEBISCHER A, LANGE E, et al. Comparative evaluation of live marker vaccine candidates "CP7_E2alf" and "flc11" along with C-strain "Riems" after oral vaccination[J]. Vet Microbiol, 2012, 158(1-2): 42-59. DOI:10.1016/j.vetmic.2012.02.015 |
| [26] |
GOLLER K V, DRÄGER C, HÖPER D, et al. Classical swine fever virus marker vaccine strain CP7_E2alf: genetic stability in vitro and in vivo[J]. Arch Virol, 2015, 160(12): 3121-3125. |
| [27] |
HULST M M, HIMES G, NEWBIGIN E, et al. Glycoprotein E2 of classical swine fever virus: expression in insect cells and identification as a ribonuclease[J]. Virology, 1994, 200(2): 558-565. |
(编辑 范子娟)