牛冠状病毒病是由牛冠状病毒(bovine coronavirus，BCoV)引起的导致牛呼吸道和肠道感染的病毒性疾病^[1]，被广泛认为是引起初生犊牛腹泻的重要病原之一。目前国内BCoV广泛流行，严重阻碍了养牛业的发展^[2-4]。有研究证实BCoV能感染多种宿主^[5-6]，说明BCoV在跨物种传播领域具有重要意义，其生物安全影响不容忽视。

BCoV是单股正链RNA病毒，属于套式病毒目、冠状病毒科、β冠状病毒属^[7]。其病毒粒子呈球形或多边形，编码五种主要结构蛋白，即纤突蛋白(S蛋白)、核衣壳蛋白(N蛋白)、囊膜糖蛋白(M蛋白)、血凝脂酶糖蛋白(HE蛋白)和小膜蛋白(E蛋白)^[8]。其中S结构蛋白含有主要抗原位点，包含S1、S2两个亚基，能诱导机体产生免疫应答，进而诱导中和抗体的产生^[9-10]。目前已有多种冠状病毒的疫苗是基于S蛋白进行开发的^[11-13]。

杆状病毒表达系统(baculovirus expression system，BES)是以杆状病毒为外源基因表达载体，以昆虫细胞为受体的真核表达系统。其优点是杆状病毒对外源基因的容纳能力较强，只感染节肢动物^[14]，在实际生产应用中较为安全；昆虫细胞能够对外源蛋白进行加工修饰，使外源蛋白能够正确折叠，保持空间构象及蛋白活性^[15-16]。BES已被广泛用于表达重组蛋白^[15]，已有多种商业化的基因工程亚单位疫苗使用该系统生产重组蛋白，如由GSK公司研发的人乳头瘤病毒二价疫苗，四川大学华西医院研发的重组新冠病毒疫苗，武汉科前生物股份有限公司生产的猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒灭活疫苗(WH-09株)^[17-18]。

目前, 有关BCoV S蛋白表达的报道均属于原核表达，缺乏翻译后修饰、蛋白产量较低，而且未表达完整S蛋白^[19-20]。因此，本研究构建了携带BCoV S基因的重组杆状病毒，通过杆状病毒表达系统获得重组S蛋白，免疫BALB/c小鼠，对其免疫原性进行评价，为今后BCoV亚单位疫苗的研究提供思路。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌株和细胞 　　大肠杆菌感受态细胞(DH5α、DH10Bac)、Sf9细胞、pFastBac-Dual质粒由西南民族大学畜牧兽医学院预防兽医学实验室保存。

1.1.2 主要试剂 　　质粒小提试剂盒购自OMEGA生物公司，BacPAK^TM杆状病毒滴度快速测定试剂盒购自TaKaRa生物公司，超敏ECL化学发光底物购自四正柏生物公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG、HRP标记的山羊抗鼠IgG均购自北京博奥森生物有限公司，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗兔IgG、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自博士德生物工程有限公司，RIPA裂解液购自Thermo Fisher Scientific公司，蛋白酶抑制剂混合物(通用型)购自上海碧云天生物技术有限公司，NE41动物免疫佐剂(MF59佐剂)、CpG免疫增强剂均购自北京利昂盛生物技术有限公司。

1.1.3 实验动物 　　4~6周龄雌性BALB/c小鼠, 购自成都达硕实验动物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒的构建与鉴定 　　选择BCoV/SWUN/HXD-4/2021株(GenBank：OL456213.1)的S结构蛋白作为模板，由生工生物工程(上海)股份有限公司针对Sf9细胞进行密码子优化并合成，连接至pFastBac-Dual载体上，得到pFastBac-Dual-S重组质粒。

1.2.2 收获重组杆粒 　　将上述构建成功的pFastBac-Dual-S重组质粒DNA转化至DH10Bac感受态细胞中，涂布到含有庆大霉素、卡那霉素、氯霉素的LB琼脂平板上。在37 ℃二氧化碳培养箱中静置培养48 h后，可观察到蓝色和白色的圆形菌落，挑取白色圆形单个菌落利用菌落PCR筛选出阳性克隆，并通过三线法进一步划线纯化以去除假阳性。将筛选出的阳性克隆扩大培养，提取重组杆粒命名为Bacmid-S，测定浓度后保存于-20 ℃。

1.2.3 重组杆状病毒的拯救 　　将长满细胞培养瓶的Sf9细胞传代到六孔板中，根据Cellfectin^TM II Reagent转染试剂说明书进行转染，27 ℃静置培养96 h后，反复冻融3次，收获病毒液，将其作为第一代病毒(P1)，命名为rpFastBac-S。盲传代到P4后，收集病毒液，分装保存于-80 ℃。

1.2.4 重组杆状病毒的鉴定

1.2.4.1 基因组PCR　　取P4病毒液提取基因组DNA。将rpFastBac-S的DNA作为模板，进行基因组PCR鉴定。

1.2.4.2 间接免疫荧光试验　　将长满细胞培养瓶的Sf9细胞进行传代，用Sf9专用培养基将细胞浓度调整到4×10⁵ cells·mL^-1，进行六孔板铺板，每孔2 mL，8~10 h后按细胞培养液3%的比例接入rpFastBac-S。27 ℃静置培养48 h后弃去培养液，用80%丙酮固定10 min，PBS洗涤3次；5%脱脂奶封闭2 h，PBS洗涤3次；以Anti-BCoV-S2蛋白多克隆抗体为一抗，37 ℃孵育2 h，PBS洗涤3次；以FITC标记的Goat Anti-rabbit IgG作为二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗涤3次；滴入DAPI染色液，室温孵育10 min，使用吸水纸吸取净残留液体后，进行荧光显微镜成像。

1.2.4.3 Western blot分析　　通过Western blot分析S蛋白在Sf9细胞中的表达情况。样品制备方法同“1.2.4.2”，27 ℃静置培养48 h后弃去培养液，用PBS重悬细胞，12 000 r·min^-1离心5 min，弃去上清；加入200 μL RIPA裂解液裂解细胞，同时加入2 μL通用型蛋白酶抑制剂，冰浴15 min后再次离心，取上清，加入SDS-PAGE上样缓冲液，95 ℃加热5 min，完成样本制备。以5%脱脂奶为封闭液，37 ℃水平摇晃孵育2 h，TBST洗涤3次；以Anti-BCoV-S2蛋白多克隆抗体为一抗，4 ℃水平摇晃孵育过夜，TBST洗涤3次；以HRP标记的Goat Anti-rabbit IgG作为二抗，37 ℃水平摇晃孵育2 h，TBST洗涤3次；使用超敏ECL化学发光底物显影，观察目的条带。

1.2.5 重组杆状病毒滴度的测定 　　按照BacPAK^TM杆状病毒滴度快速测定试剂盒说明书，测定P4重组杆状病毒rpFastBac-S的滴度。

1.2.6 优化不同感染剂量对蛋白表达的影响 　　将rpFastBac-S分别以MOI=0.005、MOI=0.05、MOI=0.5、MOI=1、MOI=2感染Sf9细胞，3 d后，弃去上清，收集细胞，Western blot检测蛋白表达情况。

1.2.7 收获S蛋白及制备免疫原 　　将rpFastBac-S按照最佳感染复数感染Sf9细胞，3 d后收获细胞培养液，3 000 r·min^-1离心20 min以去除细胞碎片，收集上清进行超速离心纯化，离心条件为“4 ℃、30 000 r·min^-1、2 h”，离心后用PBS重悬沉淀。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，分装储存于-80 ℃备用。

1.2.8 rpFastBac-BCoV-S蛋白在小鼠中的免疫原性评价

1.2.8.1 rpFastBac-BCoV-S免疫小鼠的方案设计　　4~6周龄雌性BALB/c小鼠24只，随机分为3组，分别为S蛋白组、灭活病毒组、佐剂对照组，每组8只。均采用肌肉注射，S蛋白组每只每次免疫50 μg蛋白，灭活病毒组每只每次免疫200 μL灭活病毒液(剂量为2×10^4.67 TCID₅₀)，佐剂对照组每只每次免疫50 μL MF59佐剂，其中S蛋白组与灭活病毒组均混合了等体积的MF59佐剂与20 μg CpG免疫增强剂。首免后14 d进行二免，并在免疫前、首免7 d、首免14 d、二免7 d、二免14 d进行采血，收集血清备用。

1.2.8.2 间接ELISA试验检测小鼠血清特异性抗体水平　　根据本实验室建立的基于BCoV S2重组蛋白的间接ELISA抗体检测方法，对收集到的血清样本进行特异性抗体水平检测。将原核表达获得的BCoV S2蛋白用50 mmol·L^-1 Tris-HCl溶液稀释为0.1 μg·mL^-1，每孔100 μL，37 ℃包被1 h后弃液，PBST洗涤三次；每孔加入100 μL 5%脱脂奶，37 ℃封闭1 h后弃液，PBST洗涤三次；以收集到的小鼠血清作为一抗，用2%冷水鱼皮明胶进行梯度稀释后，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h后弃液，PBST洗涤三次；将HRP标记的羊抗鼠IgG用2%冷水鱼皮明胶按照1∶10 000稀释，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h后弃液，PBST洗涤三次；加入TMB显色液，每孔100 μL，37 ℃避光孵育10 min后，加入终止液终止反应，使用酶标仪读取OD_{450 nm}值。

1.2.8.3 微量中和试验检测小鼠血清中和抗体水平　　将长满细胞培养瓶的HCT-8细胞传代至96孔板，37 ℃静置培养8~10 h；将小鼠血清56 ℃灭活30 min，用不含血清与双抗的DMEM培养基进行2倍倍比稀释，与200 TCID₅₀的BCoV混合，37 ℃培养箱感作1 h；取出含有HCT-8细胞的96孔板，弃液，PBS洗涤2次，将感作完成后的混合培养液加入到96孔板中培养96 h后，观察记录每孔的病变情况，按Reed-muech两氏法计算血清中和抗体的效价。

2 结果 2.1 重组质粒的构建

以S基因为模板，针对昆虫细胞进行密码子优化，CAI(密码子适应指数)从0.39调整为0.87，平均GC含量从35.8%调整为50.6%，利用基因合成技术获得重组质粒pFastBac-Dual-S。

2.2 重组杆粒获取及重组杆状病毒的拯救与鉴定

将上述构建成功的重组质粒转化DH10Bac同源重组后获得重组杆粒，并在转染Sf9细胞后收获重组杆状病毒rpFastBac-S，将拯救的重组杆状病毒rpFastBac-S传代至第四代时，Sf9细胞开始出现典型病变，表现为细胞生长缓慢、变大变圆。为了验证重组杆状病毒rpFastBac-S是否构建成功，作者通过PCR、Western blot、IFA试验对其进行鉴定(图 1A~C)。鉴定结果如图 1所示，图 1A为提取第四代重组杆状病毒DNA后，利用S基因特异引物进行PCR鉴定和琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示在4 000 bp附近出现预期条带，说明收获的重组杆状病毒正确表达了S目的蛋白基因；IFA试验的一抗为Anti-BCoV-S2蛋白多克隆抗体，利用倒置荧光显微镜能观察到试验组产生了很亮的绿色荧光(图 1C)，说明构建的杆状病毒有效表达了S目的蛋白；收集重组杆状病毒rpFastBac-S感染Sf9细胞48 h后的培养液上清部分，使用Anti-BCoV-S2蛋白多克隆抗体进行Western blot分析，结果显示其能够与Anti-BCoV-S2蛋白多克隆抗体发生特异性结合(图 1B)，说明重组杆状病毒感染Sf9细胞后可以有效表达S目的蛋白，并且该蛋白具有较好的反应原性。

2.3 杆状病毒滴度测定

鉴定完成后，使用试剂盒测得第四代重组杆状病毒rpFastBac-S的滴度为1.013×10⁷ IFU·mL^-1，表明第四代重组杆状病毒数量和密度良好，达到要求，能用于Sf9细胞的接种，可以进行大量蛋白的表达。

2.4 优化不同感染剂量对蛋白表达的影响

将rpFastBac-S分别以MOI=0.005、MOI=0.05、MOI=0.5、MOI=1、MOI=2感染Sf9细胞，3 d后，Western blot检测蛋白表达情况。图 2显示MOI为0.5时S蛋白表达量最高，所以将其作为后续大量表达蛋白时的最佳感染条件。

2.5 rpFastBac-BCoV-S蛋白在小鼠中的免疫原性评价

2.5.1 小鼠血清特异性抗体IgG检测结果 　　根据本实验室建立的基于BCoV S2重组蛋白的间接ELISA抗体检测方法，对收集到的血清进行特异性抗体检测。由图 3可以看出，S蛋白组小鼠在首免一周后抗体水平开始升高，并在二免后抗体水平持续增长，二免7、14 d的特异性抗体效价显著高于灭活病毒组和佐剂对照组，二免14 d特异性抗体效价最高达到1∶12 800。

2.5.2 小鼠血清中和抗体检测结果 　　对收集到的各组一免7 d、一免14 d、二免7 d、二免14 d血清进行BCoV中和抗体检测。分析结果如图 4所示，S蛋白组小鼠在首免1周后就产生了抗BCoV的中和抗体，效价为1∶20~1∶40，与MF59佐剂对照组相比，统计学差异显著(P＜0.05)，并且随着时间增长，中和抗体效价在持续升高，二免14 d后中和抗体效价最高达到1∶224。一免14 d后，S蛋白组中和效价平均值高于灭活病毒组，但中和抗体效价相当，统计学差异不显著(P>0.05)。

3 讨论

牛冠状病毒最早在1972年由Mebus等从牛腹泻粪便中分离得到^[21]。BCoV首先在美洲流行，随后在亚洲和欧洲暴发，流行范围广，可引起呼吸道和肠道双重临床症状^[22]。感染BCoV后通常会导致初生犊牛腹泻、冬季痢疾和呼吸道感染症状，进而造成犊牛死亡、肉牛生长缓慢、奶牛产奶量和产奶品质降低等影响，对养殖业造成巨大的经济损失。牛冠状病毒的S蛋白是病毒感染宿主细胞的主要成分，全长1 363个氨基酸^[23]，基因组较大，其序列高度突变和高重组的特性可能会导致BCoV的抗原性与致病性改变^[24-25]。有研究表明，分子伴侣pG-KJE8可促进BCoV病毒样颗粒的可溶性表达，与分子伴侣共表达的VLPs具有免疫活性，免疫小鼠后能使其产生较高IgG抗体水平和细胞因子水平^[26]。S蛋白的单克隆抗体在体内可防止BCoV引发的犊牛肠毛萎缩，证实了S蛋白在诱导中和抗体产生的同时，也起到阻断病毒附着和感染的作用，因此该蛋白在疫苗研究方面具有重要参考价值。

目前国内暂无商品化BCoV疫苗。S蛋白是冠状病毒的主要抗原蛋白，可以作为新型疫苗研究的切入点。新型冠状病毒通过S蛋白的RBD结合宿主细胞表面受体——血管紧张素转换酶2，介导病毒进入宿主细胞^[13]。2021年9月，中国三叶草生物制药公司一项研究表明，基于SARS-CoV-2 S蛋白的改良疫苗针对该病毒的五种变体提供了较强的保护作用，并且对具有高度传染性的Delta毒株也具有较强的保护作用^[27]。2022年，四川大学华西医院研发出RBD-HR/三聚体亚单位疫苗，该研究将Delta变异株的RBD序列与SARS-CoV-2 S2亚基中的HR1和HR2序列直接串联起来，使其通过自组装形成三聚体^[28]，在多种动物模型中能够诱导持续的体液免疫，产生高水平的针对Omicron变异株的广谱中和抗体，也可在体内诱导强烈的T细胞免疫应答。

本研究发现，利用杆状病毒表达系统表达出的BCoV S重组蛋白经过昆虫细胞较为完整的包括糖基化在内的翻译后修饰，能够正确折叠以维持原有的空间构象和蛋白活性，在此基础上还优化了不同MOI感染后的S重组蛋白的表达量，结果表明MOI=0.5的接毒条件更适合蛋白表达。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)与BCoV同属于冠状病毒科，在一项应用杆状病毒表达系统表达PEDV纤突蛋白的研究中，S蛋白免疫小鼠后，可刺激小鼠产生IL-4，但血清抗体水平与PBS组相比，并无明显差异^[29]。而本研究在BCoV S重组蛋白制备免疫原时使用了MF59佐剂与CpG免疫增强剂，小鼠免疫试验结果显示，该免疫原能够刺激小鼠产生特异性IgG抗体，血清抗体效价最高达到1∶12 800，抗体效价显著高于灭活病毒组和佐剂对照组，同时也能诱导小鼠产生高水平的中和抗体，最高中和抗体效价达到1∶224，且S蛋白组的中和效价平均值高于灭活病毒组。MF59佐剂安全有效并且可以完全降解，在新型冠状病毒疫苗研究中也有使用^{[28, 30]}，而CpG免疫增强剂能提高免疫原稳定性并延长其在体内的半衰期，可不同程度地诱导体液免疫与细胞免疫，增强机体的免疫应答^[31]。本研究为后续BCoV重组亚单位疫苗的研制提供了进一步的参考。

4 结论

本研究利用杆状病毒表达系统表达了BCoV全长S蛋白，免疫小鼠后，产生高水平的特异性IgG抗体与中和抗体，说明本研究中表达的BCoV S重组蛋白具有良好的免疫原性，为今后BCoV亚单位疫苗的研发提供了进一步的理论依据。