奶牛繁殖力高低会影响产奶量与产犊效率，进而影响养殖场经济效益[1]，而奶牛胚胎早期死亡是造成奶牛场经济损失的重要原因之一。妊娠是一个高度复杂的生物学过程，虽然反刍动物的受精率可达85%~95%[2]，但胚胎发育过程中，由于胚胎因素、子宫因素以及胚胎与子宫间相互作用异常，导致相当大比例胚胎无法发育至足月，出现大量胚胎丢失[3]；研究显示，大多数胚胎丢失发生在配种后1周的囊胚形成期和授精后前17 d的母体妊娠识别期[4-5]。配种后第1周内胚胎发育过程包括卵母细胞受精形成受精卵、胚胎基因组激活、胚胎由单个细胞经历多次增殖分化在第7天形成囊胚[6]。Berg等[7]研究显示，奶牛第7天的妊娠率为70.9%，其中受精失败(15.8%)和桑椹胚期前发育停滞(10.3%)是导致第1周妊娠失败的主要原因。如果这个阶段妊娠失败，母体不能收到妊娠信号，黄体期不延长，奶牛在配种后一个情期内将再次发情[8]。而在配种后8~17 d胚胎伸长和妊娠识别的时期[9]，奶牛的胚胎丢失率有40%，其中在妊娠识别期及后期，因为胚胎发育受阻或各种因素引起胚胎死亡，会导致干扰素-τ(IFN-τ)分泌减少，减少的IFN-τ仍能使奶牛黄体期延长，使得再次发情配种的时间间隔延长[10]。因此，在人工授精后一定时间内寻找妊娠差异标志物，对于确定奶牛是否空怀，提高奶牛繁殖效益至关重要。
母体与胎儿之间的相互作用使得早期妊娠母牛与空怀母牛相关代谢存在差异，从而致使其生理和生化指标有所不同[11]。目前已有多种检测奶牛妊娠的方法，直接方法包括直肠触诊、超声检查等。直肠触诊是在奶牛配种后的第20天通过触摸卵巢的形状及形态变化进行筛查，受精后第30天以后的检查准确性超过80%[12]；超声检查是当在子宫腔内识别到一个形状不规则、无回声的黑色斑点时，则初步判断为奶牛妊娠，在配种后第17天准确性可达到80.4%[13]，第33天及以后可达到100%；这两种方法进行妊娠诊断时只有当胚胎发育至一定阶段时才可确定妊娠，配种后间隔时间越长其诊断的准确率越高[14]。
间接方法包括放射性免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、孕酮乳胶凝集试验等方法定量分析[15]，苏妮等[16]利用孕酮对配种后21~26 d奶牛进行妊娠检测准确性达到84.31%。血小板计数法的原理是血小板活化因子致使母体血小板减少，李助南等[17]据此对奶牛进行妊娠诊断，准确性达到86.36%。罗芳和陶金忠[18]利用UHPLC-QTOF-MS代谢组学方法在授精后第17天筛选出丙氨酸-亮氨酸、甘氨酸、脯氨酸、L-正亮氨酸、DL-苯丙氨酸、肌氨酸、吡咯-2-羧酸和缬氨酸-蛋氨酸作为奶牛妊娠识别阶段潜在的生物标志物。Forde等[19]研究显示，与发情期牛相比，妊娠第16天小母牛体内的缬氨酸浓度更高。然而，部分方法仍然存在一定的局限性。
因此，筛选妊娠期间特异的蛋白，用于妊娠检测变得尤为重要。目前蛋白质分离和鉴定技术领域的不断更新也加速了用于发现蛋白质生物标志物的生物液体差异蛋白的研究，其相关分子技术在动物研究中高要求应用与重大进展也为确定特定且敏感的早期妊娠诊断的生物标志物打开了新的窗口[20]。本文综述了国内外有关奶牛早期妊娠中血液、尿液、乳液等生物体液差异蛋白，以期找到能用于早期妊娠识别阶段的潜在蛋白生物标志物。
1 早期妊娠诊断相关蛋白研究目前利用生物体液中的与妊娠相关的蛋白质包括早孕因子(early pregnancy factor, EPF)、妊娠相关糖蛋白(pregnancy associated glycoprotein, PAG)、妊娠特异性蛋白B(pregnancy specific protein B, PSPB)，此外还有一些其他相关蛋白在奶牛妊娠早期发生表达变化(表 1)。
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表 1 妊娠相关蛋白在奶牛早孕诊断中的应用 Table 1 Pregnancy-related proteins in the diagnosis of early pregnancy in cows |
EPF最早在孕畜体内血清中出现，并在胚胎发育期间具有抑制母体免疫应答、维持妊娠等功能[25]。EPF是一种与妊娠相关的疾病免疫抑制蛋白，在人类[26]、绵羊、牛、猪[27]等动物中均可以检测到。对于奶牛来说，在受精后24 h可以在乳汁与血清中检测到EPF。在妊娠结束或胚胎死亡后24~48 h EPF的含量会迅速下降至消失，因此可以检测奶牛乳汁或是血清中EPF含量的变化以检测早期胚胎发育状况与早期妊娠诊断[28]。
目前常用玫瑰花环抑制试验(RIT)与硫酸铜检测法测定孕畜EPF浓度。EPF能通过补体抑制奶牛T淋巴细胞和动物红细胞的结合而形成玫瑰花样细胞团，利用玫瑰花环抑制滴度(R值)从而间接地测定血清中EPF的含量，其灵敏度较高，在奶牛受精后第7天进行妊娠诊断[29]。Laleh等[30]的研究表明测定的RIT分数高于8可确认为妊娠，低于4可认为未妊娠。张宏刚等[31]采用RIT对17头人工授精孕牛血清中EPF进行检测，结果显示妊娠率为58.82%。Fan等[21]发现，孕妇的血液通过RIT用于超早孕诊断，准确率达到88.6%。硫酸铜检测法是硫酸根可以与EPF发生凝集反应，当妊娠奶牛乳液中EPF含量较高时，将出现云雾状沉淀，从而确定牛乳中EPF含量[32]。白云[22]对85头奶牛进行硫酸铜检测，在第7天、第16天妊娠准确率分别达到72.41%、80.60%，因此，测定EPF活性对奶牛进行早期妊娠诊断、监测胚胎附植前胚胎早期发育情况、确定预测胚胎生长发育具有重要意义[33]。
1.2 干扰素-τIFN-τ是由反刍动物胚胎滋养层细胞分泌产生的I型干扰素，为糖蛋白，含有172个氨基酸，分子量在19~24 ku之间[34]。IFN-τ在奶牛受精后的7~28 d内产生，在妊娠18~20 d是IFN-τ分泌的峰值[35]，从第21天开始表达量逐渐下降，直至胚胎与母体子宫建立联系后不再分泌。在囊胚延长期间，滋养外胚层细胞分泌的IFN-τ进入子宫腔，其在子宫外组织和外周血液循环中的水平非常低。由于IFN-τ通过阻断PGF2α的释放，从而抑制黄体的溶解，以维持孕酮的分泌达到维持妊娠的目的[36]，因此IFN-τ被认为是母体识别妊娠的信号，为母体识别妊娠的重要关键分子[9]。除了抗黄体溶解作用外，IFN-τ还以旁分泌方式作用于子宫内膜，诱导增强干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes, ISGs)的表达。此外，IFN-τ还具抗增殖、抗炎、抗病毒、妊娠免疫调节等作用[37-38]。
在未妊娠母牛中，子宫内膜组织IFN-τ基因的转录水平较低，故对其在子宫内膜组织中的表达进行蛋白水平检测意义较低，但在妊娠初期子宫内膜中IFN-τ的表达与未妊娠时相比显著升高，这可能是由于胚胎滋养层中IFN-τ刺激因子对母体子宫内膜IFN-τ的转录产生了一定的影响，但IFN-τ在转录后不会被翻译或表达[39]。
此外，在子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞中，IFN-τ还作用于子宫内膜以诱导或增强许多基因的表达，这些基因主要用于调节植入过程中的子宫容受性和胚胎发育，如干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15, ISG15)、黏病毒抗性蛋白2(myxovirus resistance 2, MX2)、2-5寡肽-合酶(2，5 oligoadenylates synthetase 1，OAS1)等基因均在奶牛的早期妊娠期出现了差异表达[40]，因此在奶牛的外周血白细胞中ISGs的检测被用作预测妊娠早期IFN-τ的产生以检测孕体，该推测已在总白细胞[41]、外周血单核细胞[42]、外周血多形核细胞[43]中得到验证。一般来说，在奶牛妊娠的18~20 d之间发现妊娠和未妊娠母体之间存在显著差异的阳性妊娠诊断的准确性为70%~90%[39]；Yoshino等[44]通过检测外周血白细胞ISGs的表达量，对受精3周的日本黑牛进行早期妊娠诊断，阳性诊断准确率和阴性诊断准确率分别为80%和94.6%。尽管已有大量试验利用ISGs作为妊娠诊断进行研究，但高比例的假阳性和假阴性结果显著降低了该技术的准确性[45]。ISGs作为来自孕体的间接刺激对于早期妊娠诊断至关重要，因此有必要进一步对技术进行调整研究，以提高其准确性和特异性，从而用于监测妊娠早期胚胎存活率。
1.3 妊娠相关糖蛋白在偶蹄类物种中，PAG是公认的妊娠标志物。PAG是哺乳动物在妊娠期间由胎盘的滋养层双核细胞所表达出来的一种不太活跃的酶，属于天冬氨酸蛋白酶家族的非活性成员。其功能包括激活潜在的生长因子、绒毛-子宫内膜边界的细胞黏附、母体免疫系统调节和黄体营养功能[46]。
在人工授精后15~22 d，一些妊娠奶牛的血清中就可以检测到PAG[47]。在奶牛妊娠第22天PAG水平高于2 ng·mL-1，这时妊娠奶牛与未妊娠奶牛PAG水平存在显著差异[48]。但由于该蛋白在奶牛的血液中浓度低，因此可从28~30 d进行早期妊娠诊断以得到更准确的结果[49]。基于此，Green等[24]，以及Friedrich和Holtz[50]研究出第一个夹心ELISA用于测定PAG浓度，在定时人工授精后26~58 d，PAG ELISA检测的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为94%~100%、77%~94.2%、90.7%~97.8%和91.2%~97.1%。Durocher等[51]发现PAG检测的准确度不受胎次、自上次配种以来的天数和产奶水平的影响。因此，该蛋白的表达水平变化也为奶牛的早期妊娠识别提供了理论依据，PAG成为早期妊娠诊断的重要生物标志物。在定时人工授精后第7天泌乳奶牛循环PAG浓度低于1.4 ng·mL-1，胚胎移植后循环PAG浓度低于1.85 ng·mL-1，以此预测妊娠第31天的胚胎丢失准确率可高达95%[52]。目前市面上存在多种商业化的检测方法，主要是RIA和ELISA[53]，爱德士可视孕检试剂盒是市面上常用检测试剂盒之一，当母牛妊娠时阳性对照孔变为蓝色，妊娠准确率可高达99.5%，可避免过早与胚胎直接接触而造成流产的经济损失[54]，但PAG检测与直接妊娠检测相比成本较高、试验条件要求严格。另外，现阶段利用PAG检测最早只能达到人工授精后第28天，从而使再次配种时间延长，养殖成本增加，因此利用PAG的检测时间能否进一步缩短，这也是我国有关学者所要继续研究的方向。
2 奶牛人工授精后体内蛋白组学研究蛋白质组学技术涉及对特定细胞、组织、器官或生物体中的蛋白质功能、表达、相互作用和翻译后修饰的广泛研究，并且能够鉴定其中存在的所有蛋白质，关于其最新进展常聚焦于发现更新、更灵敏的特异性蛋白以识别各细胞、组织的生物学阶段。奶牛妊娠时由于胚胎与母体之间的相互作用，会导致母体血液、尿液和乳液等某些蛋白表达水平发生改变，而这些变化可作为判断奶牛是否妊娠的重要指标。考虑到与动物生产的经济效益相关，现阶段已经通过蛋白质组学方法找寻来自奶牛组织、细胞、乳汁、尿液等中的各差异表达蛋白(表 2)。
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表 2 早期妊娠的潜在蛋白生物标志物 Table 2 Potential protein biomarkers for early pregnancy |
血样是最常用的奶牛妊娠检测物质，Bahuguna和Sharma[55]在配种后的第0、12、16、19和22天采集了30头萨希瓦尔牛的血液样本，分离血清进行1D SDS PAGE分析与nano-LC-MS/MS检测，结果显示显著上调的蛋白质如乳铁蛋白、Golgin A4、MYRIP、PKD1具有作为妊娠诊断生物标志物的潜力，有望用于开发妊娠诊断试剂盒。
在所有的免疫细胞中，中性粒细胞是最先识别外来物的细胞，而在所有的血细胞中，中性粒细胞又是对子宫中胚胎最为敏感的细胞[61]，其受到IFN-τ诱导后参与母体妊娠识别过程，并且有助于奶牛妊娠的建立和维持。目前有研究显示，通过测量干扰素刺激基因如MX1、MX2、OAS1、ISG15在中性粒细胞中的表达，可以作为妊娠诊断的一种方法[62]。而为了探究这些分子的mRNA能否翻译成蛋白且依旧可以作为早期妊娠诊断生物标志物，Panda等[56]采集奶牛人工授精后血样并分离中性粒细胞，利用LC-MS研究蛋白表达情况，结果发现在人工授精后第18天MX1、MX2、OAS1、ISG15表达增加，同时qPCR也显示这些分子的相对mRNA表达增加，呈正相关，表明血液中性粒细胞中的ISGs对妊娠的建立至关重要，可作为奶牛妊娠诊断的潜在生物标志物。
2.2 奶牛人工授精后乳汁蛋白组学研究由于取样方便且富含蛋白质，乳汁也是常用妊娠检测物质之一[63]。Johnston等[57]利用LC-MS/MS对奶牛发情当天与妊娠第21天奶牛的乳清与富含细胞外囊泡的乳清进行蛋白组学研究，发现在乳清中APOB、SPADH1、PLIN2表达上调、LPO表达下调，在富含细胞外囊泡的乳清中PIGR、PGD、QSOX1、MUC1、SRPRA、MD2表达上调、GAPDH、FOLR1、GPRC5B和HHIPL2表达下调，因此这些蛋白质可能成为潜在的乳清生物标志物。Han等[64]利用二维凝胶电泳技术分析受精后第35天牛的乳清蛋白和未怀孕牛的乳清蛋白，发现乳铁蛋白、乳转铁蛋白、alpha-1G蛋白表达量较未妊娠奶牛高，其中alpha-1G蛋白在受精后第18天显著表达，在第39天达到峰值，并在整个妊娠期间持续分泌，因此，在这3种蛋白中，alpha-1G可能是最适合检测奶牛早期妊娠的指标，推测可以分别在妊娠第18和35天时利用alpha-1G、乳铁蛋白和乳转铁蛋白差异表达量建立相关妊娠诊断技术。
2.3 奶牛人工授精后尿液蛋白组学研究在蛋白组学研究中，与其他体液相比，尿液被认为是研究发现生物标志物的理想生物材料来源，可用于分析家畜在妊娠、疾病等各种生理变化条件下尿蛋白的差异表达[65]。Rawat等[58]为确定用于早期妊娠检测的潜在生物标志物，与人工授精当天的奶牛相比，在妊娠16~22 d时观察到总共11个差异表达蛋白具有1.5倍的变化，其中有9个蛋白上调，差异蛋白包括α2-HS糖蛋白(A2HS)、AMBP、肾素、甘露聚糖结合蛋白等蛋白；同时采用非标记定量技术(LFQ)检测的结果发现195个差异表达蛋白，其中28个蛋白表达上调，40个蛋白表达下调，筛选出在妊娠早期像性激素结合球蛋白、结合珠蛋白、Serpin B3蛋白、尿调制蛋白、组织蛋白酶抑制素、甘露聚糖结合蛋白、子宫珠蛋白、维生素结合蛋白和胰岛素样生长因子结合蛋白2等重要蛋白的表达量显著增加，这些蛋白积极参与了与妊娠相关的各种活动，如胚胎着床、妊娠的建立和维持，因此可将其视为妊娠的生物标志物，但后续仍需进一步的验证。
2.4 奶牛人工授精后输卵管液蛋白组学研究在胚胎着床之前，输卵管液和子宫腔液是早期孕体的唯一营养来源[66]，在该时期的胚胎丢失可能是由于组织营养素分泌异常而导致滋养层伸长和胚胎发育的失败或是延迟。
奶牛胚胎发育的前3~5 d在输卵管环境中生长，输卵管液中蛋白质来源于输卵管上皮分泌细胞合成分泌、从血液中渗出的蛋白质和排卵后期由卵泡或胚胎所诱导表达的蛋白质，在奶牛发情期间输卵管液成分的变化为精子获能、卵母细胞成熟、配子运输、受精和早期胚胎发育提供了合适的微环境[67]。磷酸丙糖异构酶(TIM)是一种代谢酶，在糖异生和糖酵解中将磷酸二羟丙酮转化为D-甘油醛-3-磷酸，并在胞质溶胶、细胞外间隙和外泌体中发现[68]，妊娠第8天和妊娠第16天的输卵管液中TIM的表达量显著增加。但也有在肉牛小母牛的研究中显示, TIM在妊娠第7天拥有活胚或死胚的牛的子宫液中表达没有差异[69]。而包括胱抑素B、α-1抗胰蛋白酶(SERPINA1)和前列腺素还原酶1(PTGR1)在内的应激反应蛋白则被认为是胚胎发育停滞的潜在生物标志物，它们表达的增加可能与炎症的代偿调节相关[59]。
2.5 奶牛人工授精后子宫液蛋白组学研究母牛的成功繁殖除了与胚胎本身质量有关外，也和子宫微环境密不可分[70]。子宫内膜通过子宫内膜分泌物在胚胎伸长方面发挥了关键作用，其内环境也会影响胚胎质量，进而影响胚胎发育[71]。通常在奶牛配种后1周内，胚胎会进入子宫。与血浆相比，奶牛子宫液中许多蛋白质的表达存在差异。有研究阐明了卵泡液对输卵管液组成以及在子宫输卵管交界处输卵管液和子宫液之间液体交换的作用机制[72]，进一步说明整合不同生殖器官分子研究的相关性。与未妊娠奶牛相比，在妊娠第8天和妊娠第16天，妊娠奶牛子宫腔液中TIM、胆红素原合成酶、SERPINA1表达升高。部分蛋白也与胚胎的发育质量有关，繁殖力高的初产母牛与发情期奶牛、经产奶牛相比，SERPINA1、α2抗纤溶酶(SERPINF2)和丝氨酸蛋白酶抑制剂D1(SERPIND1)在妊娠第17天的牛子宫腔液中含量更高，研究显示这些蛋白都参与凝血途径[59]。
朱喆[39]利用qPCR和Western blot技术对妊娠9~20 d的奶牛子宫内膜组织进行分析，发现相较于未妊娠奶牛，妊娠早期奶牛子宫内膜组织的IFN-τ和BoLA-Ⅰ转录水平显著升高，同时BoLA-Ⅰ的蛋白表达量也显著提高，由此假设IFN-τ能够使BoLA-Ⅰ上调表达，促进子宫内免疫抑制微环境的形成，提高子宫内膜容受性。也有相关研究利用胚胎移植来研究母体微环境和胚胎之间的关系，Moraes等[60]将第7天的优质胚胎移植到高繁殖力和低繁殖力的奶牛体内，并在第17天对其进行了子宫腔液蛋白组学研究，发现妊娠小母牛和未配种牛相比，胚胎分泌因子(TKDP1、PAG11)、线粒体蛋白(DLD、ACAA1、ACAA2、HSPD1、HSPA9和GLUD1)和谷胱甘肽合酶(GSS)在子宫腔液中表达增加。
3 小结目前许多奶牛早期妊娠的诊断技术已经逐渐成熟，但大部分蛋白质检测的诊断技术仍处于试验阶段，其检测的可靠性与现代化牧场的奶牛早期妊娠识别要求仍存在着较大的差异与局限，譬如部分体液采取不便、试验操作繁琐、成本较高等。妊娠影响母体血液、乳汁和尿液等蛋白质的表达，妊娠期间蛋白质表达的定量差异和特异表达的差异可用于检测与妊娠相关的生物标志物。高通量质谱靶向蛋白质组学方法的发展，可成为验证这些潜在生物标志物的理想方法。未来，应不断地寻找与奶牛妊娠有关的有效蛋白生物标志物，并不断探寻新的超早期妊娠诊断方法，以便在人工授精后早期对奶牛进行正确的妊娠诊断，提高奶牛的生产效益。
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(编辑 郭云雁)