家畜性别控制技术是通过对家畜正常生殖过程的人为干预，使雌性动物生产出符合人类所期望的性别后代的技术手段，在畜牧生产实践中有着重要的意义[1-5]。在畜牧生产实践中，通过家畜的性别控制可极大地加强良种选育的强度，加快育种进程。同时，对特定畜产品的需求往往会导致对动物后代性别控制的需求偏向[6]，例如，在实际生产中往往会使雌性家畜充分发挥繁殖和泌乳性能，而雄性家畜发挥其肉用或种用性能，使得公母畜最大限度产生经济效益[3]。
性控技术主要分为受精前的X/Y精子分离和受精后早期胚胎鉴定两大类，家畜育种主要聚焦于受精前的X/Y精子分离技术。目前，常用的受精前X/Y精子分离技术主要有离心分离法、免疫学分离法和流式细胞仪分离法等，其中流式细胞仪分离法应用范围最广、分离效果最好；常用的受精后早期胚胎性别鉴定主要依靠SRY-PCR法、免疫学法和细胞遗传学方法等，其中最常用的是SRY-PCR法[7]。但以上方法在实际应用中均有所限制，Umehara等[8]基于抗原抗体反应报道了新的X/Y精子分离方法——激活TLR7和TLR8受体以分离X/Y精子。将TLR7和TLR8与共同配体R848共孵育，通过抑制糖酵解途径以降低X精子ATP产生，影响X精子活力，从而分离X/Y精子。目前对该方法的作用机制及应用前景的研究，将为畜产品发展提供巨大的经济效益。
1 传统性别控制技术 1.1 受精前X/Y精子分离技术受精前的性别控制技术基于X/Y精子分离技术，在畜牧业发展中起到重要作用。通过受精前的性别控制技术可以大幅提高家畜育种的选择强度、缩短育种周期，从而提高育种效率。该技术是基于哺乳动物X/Y精子的理化差异，利用物理或化学方法使得X/Y精子分离[9-12]，然后使卵母细胞受精，是目前干预和选择后代的最直接方法。研究发现，X精子和Y精子之间存在差异，包括体积大小、DNA含量、游动速度、表面电荷以及耐冻性[13]。早期的精子分离方法大多以X/Y精子之间存在的物理差异——精子的密度、形态、大小、活力、质量、表面电荷等特性为依据进行分离，这类方法缺乏试验的可靠性和重复性，未能在生产上得到有效推广和应用[14]。近年来，随着精子差异蛋白的深入研究，流式细胞仪分离技术成为目前最为成熟和科学可靠的精子分离方法[15]。此外，利用CRISPR-Cas9基因编辑系统对精子进行改造，实现X/Y精子分离的研究也不断涌现[16-17]。虽然这些技术还需要进一步完善和验证，但它们具有非常大的应用潜力，有望推动受精前性别控制技术的进一步发展和应用。
1.1.1 离心分离法 研究表明，哺乳动物X/Y精子的DNA含量不同，如牛、马、羊、猪等的X精子染色体DNA含量分别比Y精子高3.8%、4.1%、4.2%、3.6%，X精子染色体DNA含量高于Y精子，使得X精子的密度及重量大于Y精子，在离心时X精子的沉降速度比Y精子快，从而使X精子和Y精子得到有效的分离[18]。曹世祯等[19]通过Percoll溶液将人的精液进行离心，获得了纯度高达90% 以上的X精子。除此之外，曹世祯等[19]还利用该方法处理牛的精液，所得后代中雌性动物比例超过50%。使用该方法分离X/Y精子的操作时间短，对精子的损害小，但是分离X/Y精子缺乏重复性，其中的原因有待进一步研究。
1.1.2 免疫学分离法 X/Y精子免疫学分离的关键是挖掘X精子和Y精子的根本差异，X/Y精子基因差异表达会导致两类精子表型发生变化，从而将二者进行分离。X染色体上存在大量蛋白质编码基因，基因密度约为所有常染色体平均值的一半，大多数为编码拷贝基因。相比之下，Y染色体只保留了常染色体3%的基因，且Y染色体上的雄性特异区域MSR共包含156个转录本，几乎所有基因都与睾丸发育和精子形成有关。X/Y染色体的特异基因构成了X/Y两类精子间蛋白表达差异的遗传基础，从而利用X/Y精子的蛋白表达差异分离出X/Y精子[20]。
H-Y抗原是哺乳动物中最早发现的雄性特异性组织相容性抗原，免疫学分离法(immunomagnetic method)是利用H-Y抗体检测Y精子质膜上存在的H-Y型抗原(histocompatibility-y-antigen)，根据抗原抗体反应来分离家畜的X精子和Y精子[21]，再选择X精子或Y精子进行人工授精从而得到所需性别后代的方法[14]。基于以上原理，罗承浩等[22]应用生殖免疫技术制作性别化冷冻精液，配种受胎试验结果表明，性别化冷冻精液与正常冻精情期受胎率相似，且奶牛产母犊率可达60.7%。虽然利用此方法分离X/Y精子效率较高，但需要制备高效价的H-Y抗体，且经处理后的精子数目少、活力低，在实际生产中很难得到广泛应用[23]。SRY基因位于Y染色体短臂(Yp)上，是目前公认的睾丸决定因子，在哺乳动物的性别决定中至关重要[24]。为降低免疫分离方法的应用成本，李蓉和华松[3]通过单克隆抗体技术制作针对关中奶山羊SRY的抗体，制备负载SRY抗体的磷酸钙纳米颗粒，注射到性成熟前的雄性羔羊的睾丸，阻碍Y精子的成熟分化，在体成熟后进行采精，通过离心去除Y精子，能得到高比例的X精子。该技术具有低成本、简便、快速、易操作等优势，有望在将来取代流式细胞仪分选法，广泛应用于家畜生产。
1.1.3 流式细胞仪分选法 研究表明，哺乳动物X精子的DNA含量高于Y精子。Hochest33342作为一种广泛应用于核酸染色的荧光染料，可以通过与细胞或精子中的DNA结合，在荧光显微镜下观察到细胞核的形态和数量。在细胞活体染色的应用中，Hoechst 33342也被称为“活染剂”。其结合原理是通过静电相互作用和氢键相互作用与DNA中的GC互补碱基对结合。将Hochest33342与精子核DNA结合后，会发出蓝色的荧光信号，捕捉到的蓝色荧光信号与核酸含量成正比例，从而使荧光染料在X/Y精子上的染色程度不同[25]。因此，在流式细胞仪中进行分离时，在紫外激光的照射下，荧光标记的X精子和Y精子会发出不同的荧光信号强度，可以通过检测精子中的荧光信号来区分X精子和Y精子，从而使它们能够被区分并分离出来[25-26]。目前，通过流式细胞仪分离动物精子的准确率已高达95%以上，生产的商业化性控精子已广泛应用于畜牧业中，尤其在奶牛、奶山羊的生产中应用较多[27]。然而，据曾有权等[28]研究表明，利用流式细胞仪分离X/Y精子，精子分离的纯度与活力及产量呈负相关关系，并且在分离过程中对Y精子的活力损失较大。此外，流式细胞仪分选成本高，对操作技术要求非常严格，使得该技术在实际生产应用中受到一定的限制[28-29]。
1.1.4 基于基因编辑的X/Y精子分离方法 在精子发生过程中干扰Y染色体的生成是性别控制技术的一种新的发展方向[30]。从Y染色体中分离出的Y染色体相关锌指蛋白转录因子(Y chromosome linked zinc-finger protein transcriptional factor，Zfy)被认为是睾丸的决定基因，参与调节其他基因的表达，在精子发生过程中起着重要作用[31-32]。研究表明，在精子发生过程中，采用RNAi技术干扰与精子发生相关的特异性基因Zfy，Zfy基因的沉默会导致在精子形成过程中限制或损坏Y精子的功能发育，从而影响Y精子的形成，最终引起后代性别比例的改变[30-33]。目前，该方法在绵羊、马鹿、猪及小鼠等动物上取得了一定的性别控制效果[34-38]，并且不会影响胚胎发育，具有极大的研究前景[30]。
上述方法中，流式细胞仪分选法是目前最常用、最成熟的X/Y精子分离方法，也是迄今为止唯一公认的家畜性别控制方法，相较于其他方法，流式细胞仪分选的X/Y精子纯度较高，可达到75%~90%[39]。然而，利用该方法分离X/Y精子依然存在仪器成本价格过高和专利费昂贵等问题，同时，与普通精液相比，使用流式细胞仪获取性控精液的效率较低(每小时仅7~12根细管)，且每根细管的有效精子数量较少(200万~400万)，极大限制了其在畜牧业中的应用[40-41]。此外，利用流式细胞仪分选后的精子活率和质膜完整性较低，从而影响受精率和胚胎发育[42]。因此，研究人员致力于挖掘X/Y精子的差异表达基因或者蛋白，特别是寻找X/Y精子间的差异膜蛋白，以期发现分离X/Y精子的新方法。近年来，在根据X和Y精子之间的蛋白表达差异来分离X/Y精子方面取得了新的进展。研究表明，精子具有一些先天的免疫细胞功能，发挥该功能的TLR家族成员(Toll-like receptors，TLRs)可识别特定病原体，在哺乳动物精子中表达，且相关基因表达较高，能通过降低精子的运动性和受精能力来响应细菌内毒素LPS和肽聚糖[43]，在精液或子宫感染细菌和/或病毒时通过改变精子获能和过度活化运动来损害受精[43-44]。在此基础上，Umehara等[8]报道了两种膜相关受体蛋白：Toll样受体7(Toll-like receptor 7，TLR7)和Toll样受体8(Toll-like receptor 8，TLR8)。TLR7和TLR8均定位于细胞内膜，在哺乳动物先天免疫和炎症反应中起关键作用[45]。TLR7和TLR8可被RNA病毒释放的单链RNA激活，RNA介导的生殖道中TLR7和TLR8的激活可能会增加XY胚胎与XX胚胎的比例[46]。雷西莫特(R848)是咪唑喹啉的小分子化合物，也是TLR7和TLR8的激动剂，目前临床上用于治疗感染性病毒性疾病和肿瘤[47-48]，可用于分离小鼠附睾中的X精子或Y精子。由于在X染色体上编码的TLR7和TLR8在精子中表达并且两者都具有共同的配体，将精子与TLR7和TLR8的配体R848一起进行孵育后，TLR7和TLR8的配体会选择性地抑制携带X染色体的X精子的运动能力，而Y精子不受影响，且不会改变精子的质膜和顶体完整性，从而利用X/Y精子运动能力差异分离X和Y精子，使用该方法分离X/Y精子的准确性达到了80% 以上[40]。Umehara等[8]的工作为研究精子表面特异性蛋白差异和进一步控制哺乳动物的后代性别提供了新的技术手段[49]。迄今为止，激活精子中TLR7和TLR8受体的生理相关性尚未得到彻底探索，该方法仍需在其他哺乳动物上进一步研究与验证，并探索其作用的相关生理机制。解决这一难题后，该方法有望取代流式细胞分选技术用于高效率制备家畜性控精液[8, 50]。
1.2 受精后早期胚胎性别鉴定随着精卵结合形成胚胎，胚胎的性别已经确定，因而在胚胎移植前，通过对胚胎进行性别鉴定，可以人为筛选出所需性别的胚胎进行移植，从而生产出符合预期性别的家畜后代。目前，常用的胚胎性别鉴定方法主要有SRY-PCR法、免疫学法和细胞遗传学方法。
1.2.1 SRY-PCR法 SRY-PCR法的原理是针对Y精子的特异性SRY基因，设计特异性引物后进行PCR鉴定。近年来，随着PCR技术的快速发展和普及，SRY-PCR因其灵敏度高、速度快和可重复性好等特点，而被广泛应用于早期胚胎性别鉴定，是目前最常用的早期胚胎性别鉴定方法[3]。刘俊平等[51]采用PCR技术对牛体内胚胎和体外胚胎的性别进行鉴定，结果显示，两种胚胎移植后母牛的妊娠率无显著差异，后代犊牛的性别与鉴定结果符合率则高达100%。目前，SRY-PCR性别鉴定技术已成功应用于小鼠、兔、猪、牛和羊等哺乳动物的早期胚胎鉴定，通过使用PCR方法检测胚胎的SRY基因是否存在，进行早期胚胎的性别鉴定，胎儿出生后的性别符合率可高达100%[3, 7, 27, 52]，使用该方法鉴定早期胚胎性别的操作简便、准确率高，但由于需从胚胎分离部分细胞，可能会对胚胎后期发育造成损伤。此外，由于该方法主要使用胚胎作为样品，导致起始样品量少，扩增量大，容易造成污染产生假阳性的结果，从而影响试验结果的准确性[27, 53]。
1.2.2 免疫学法 采用免疫学法检测早期胚胎性别是利用雄性胚胎有特异性的H-Y抗原，采用H-Y抗血清或H-Y单克隆抗体进行鉴定，目前最常用的免疫学法主要是指间接免疫荧光法。间接免疫荧光法是将胚胎移入含有H-Y抗血清或H-Y单克隆抗体的液体中，再添加荧光素标记的二抗，以胚胎呈现的特异荧光为标记，荧光阳性则为雄性胚胎，否则为雌性胚胎。该鉴定方法在猪、牛、绵羊等家畜上已有成功示范，准确率均在85% 左右。但是由于H-Y抗原的特异性弱，荧光强度的判断易受主观性影响，从而容易导致该鉴定方法的准确性偏低[3]。
1.2.3 细胞遗传学方法 由于雌性胚胎有一条失活的特异性X染色体即巴氏小体，而雄性胚胎没有，因而可以通过有无巴氏小体来判断早期胚胎的性别。但该方法首先要用秋水仙素处理胚胎后再进行核型分析，因而会对胚胎造成不可逆转的损伤，所以不适用于家畜的生产，目前仅仅用于验证其他性别筛选方法的准确性[3]。
2 TLR7和TLR8在性控技术中的研究进展 2.1 TLR7和TLR8受体在小鼠及家畜睾丸和精子中的定位表达2019年，Umehara等[8]通过蛋白质免疫印迹分析(Western blot)、流式细胞术(flow cytometry，FCM)和免疫荧光染色(immunofluorescence，IF)分析了TLR7和TLR8在小鼠睾丸、附睾及精子中的表达，发现TLR7和TLR8存在于小鼠附睾精子、睾丸精子细胞和睾丸间质细胞(leydig cell)中，但在睾丸支持细胞(sertoli cell)中表达较弱。通过从附睾尾部收集的小鼠成熟精子中研究发现TLR7和TLR8是小鼠X染色体编码的蛋白，在小鼠X精子中特异性表达，并定位于小鼠精子中段和鞭毛部分，且阳性精子的比例接近50%[8]。Ren等[54]研究发现, TLR7和TLR8也是关中奶山羊X染色体的编码基因，通过对奶山羊睾丸组织和附睾组织进行PNA染色，发现TLR8+信号主要定位在奶山羊精子中段及尾部的连接部分，而TLR7+信号主要定位在奶山羊精子的整个尾部。通过免疫组织化学染色发现, TLR7和TLR8蛋白在睾丸圆形精子细胞、附睾精子和成熟精子中均有表达，且TLR7和TLR8阳性精子比例接近50%[50, 54]。基于Umehara等[55]的研究结果：TLR7和TLR8蛋白在公牛X精子中均定位于精子尾部。刘伟东[40]推测，TLR7和TLR8在秦川牛X精子中特异表达，通过对秦川牛睾丸圆形精子、附睾精子和成熟精子分别进行TLR7和TLR8免疫荧光染色，发现TLR7和TLR8在秦川牛的睾丸圆形精子、附睾精子和成熟精子中均有表达，且TLR7和TLR8阳性精子比例接近50%。与上述研究有所不同的是，吴昌华等[56]利用免疫组化检测公猪睾丸和附睾中的TLR7和TLR8的定位表达，发现TLR7和TLR8 mRNA在公猪睾丸、附睾头、附睾体、附睾尾组织以及精子中均有表达。然而，通过细胞免疫荧光验证发现TLR7和TLR8蛋白在公猪X精子和Y精子中均有表达且表达模式无显著差异：TLR7蛋白主要表达于猪精子头部顶体区域，TLR8蛋白主要表达于猪精子尾部。上述研究表明，小鼠、牛和奶山羊TLR7和TLR8在精子中的定位表达相似，均在X染色体上特异性表达。但在猪中的定位表达并未表现出与前者的一致性，且未有特异性表达结果。
2.2 TLR7和TLR8激动剂R848对小鼠及家畜精子活力及运动性能的影响Umehara等[8, 55]研究发现，在X染色体上的TLR7和TLR8在小鼠精子中表达且具有相同的配体雷西莫特(R848)，通过将小鼠精子与R848或TLR7的特异性配体咪喹莫特(R837)共同孵育后，使用精子质量检测系统分析(CASA)，结果表明，用TLR7和TLR8特异性配体(R848/R837)处理小鼠精子后显著降低了小鼠X精子的运动速度而不影响Y精子的运动速度，导致下层X精子百分比显著降低(P < 0.05)，上层Y精子的百分比显著增加(P < 0.05)。并通过试验证明，在去除R848后小鼠精子活力恢复，即R848对精子活力的抑制是可逆的[40, 54-55]，R848处理后的小鼠精子保持受精能力[8]。由于平均路径速度(average path velocity，VAP)与顶体反应精子的数量之间存在显著相关性[57]；VAP和平均直线运动速率(average straight line velocity，VSL)与生育率呈正相关[58]；平均曲线运动速率(average curve line velocity，VCL)与精子浓度相关并影响生育能力[59]，Ren等[54]向奶山羊精液中加入TLR7和TLR8的配体(激活剂)R848，探究其对奶山羊精子运动性能的影响，试验表明，在添加R848孵育后，奶山羊的下层精子活力以及VAP、VSL和VCL等精子运动相关参数均显著下降(P < 0.05)，而上下层精子的质膜完整率和顶体完整率均无显著变化(P>0.05)。与该研究结果相似的是，刘伟东[40]为探究TLR7和TLR8激动剂R848对牛精子运动性能的影响，将不同浓度TLR7和TLR8激动剂R848与秦川牛精子共同孵育，分析上游精子的比例, 结果显示，R848处理组处理后上层X精子比例显著低于对照组(P < 0.05)，此外，下层X精子VAP、VSL和VCL均显著低于上层Y精子和对照组(P < 0.05)，且下层X精子运动轨迹变短；同时下层X精子的活力较上层Y精子和对照组有显著下降(P < 0.05)，而上、下层精子的质膜完整率和顶体完整率与对照组相比无显著变化(P>0.05)，表明TLR7和TLR8激动剂R848抑制了下层X精子的运动性能，但对上、下层的精子质量无明显影响。与上述研究结果不同，吴昌华等[56]用TLR7和TLR8配体R848孵育猪精子后，精子活力降低，但上层两种性别精子的比例没有显著变化且与对照组相比无显著差异(P>0.05)。究其原因，可能是精子的糖酵解途径被抑制，产生的ATP减少，影响了精子运动，从而使处理后的精子活力降低。由于TLR7和TLR8在猪的X/Y精子中均有表达，使R848孵育猪X/Y精子后两种精子的活力均受到影响，但X/Y精子无法分离。基于猪不同于小鼠、奶山羊、秦川牛的特点，印证了TLR7和TLR8激动剂分离其他家畜X/Y精子的可能性。
2.3 TLR7和TLR8激动剂R848对小鼠及家畜精子活力及运动的作用机制由于精子运动速度受精子细胞内ATP水平的调节，Umehara等[8]探究了TLR7和TLR8配体对精子中ATP产生的影响，用两种TLR7和TLR8配体(R848、R837)孵育小鼠精子后，精子中的ATP水平显著降低[8, 60]。由于ATP的产生受线粒体三羧酸循环、β氧化和/或细胞质糖酵解的调节[61-62]，Umehara等[8]对小鼠精子的线粒体活性和糖酵解活性进行了测定。试验表明，定位在小鼠X精子中段的TLR8的激活抑制了精子线粒体活性，而定位在小鼠X精子尾部的TLR7的激活抑制了精子细胞质的糖酵解。此外，该研究还表明R848能促进核因子κB(NF-κB)和糖原合成酶激酶3α/β(glycogen synthase kinase 3α/β，GSK 3α/β)的磷酸化，通过GSK 3α/β-己糖激酶途径抑制X精子产生ATP，从而降低X精子运动性能[8]。
基于TLR7和TLR8激活剂影响奶山羊下层精子(X精子)活力且对精子的质膜和顶体完整率无显著影响的研究结果，Ren等[54]进一步探究了R848对奶山羊精子ATP水平和线粒体活性的影响，结果表明，添加TLR7和TLR8激活剂(R848)孵育奶山羊精子后，精子ATP水平和线粒体活性均显著降低(P < 0.05)。经检测发现，R848处理奶山羊精子后，精子中的NF-κB和GSK 3α/β的磷酸化水平显著增加(P < 0.05)；并且下层精子(X精子)的NF-κB和GSK 3α/β的磷酸化水平相较于上层精子(Y精子)有显著增加(P < 0.05)。此外，任发[50]利用流式细胞仪对分选后的上、下层精子分别进行鉴定，发现上层中Y精子和下层中X精子所占比例均在80% 以上。该结果进一步证明了TLR7和TLR8在奶山羊X精子中特异性表达，且R848通过特异性激活TLR7和TLR8信号通路影响奶山羊精子的己糖激酶途径，从而抑制了X精子的运动性能。该研究通过鉴定出特异表达在奶山羊X精子上的TLR7和TLR8蛋白，初步建立了一种奶山羊精子分离的方法，为奶山羊性别控制技术提供了理论参考，同时也为家畜的性控技术提供了新的理论技术参考。
与上述研究结果相似，刘伟东[40]在确定TLR7和TLR8激动剂R848可以抑制X精子运动性能后，将牛精子与TLR7和TLR8激动剂R848共孵育后，检测上、下层精子ATP、线粒体膜电位后发现，下层X精子的ATP和线粒体膜电位均显著低于上层Y精子和对照组(P < 0.05)；对上层精子和下层精子进行Western blot检测后发现，下层X精子NF-κB和GSK3α/β的磷酸化水平相较于上层Y精子有显著增加(P < 0.05)。刘伟东[40]推测，R848通过与X精子TLR7和TLR8受体结合后，可分别通过GSK 3α/β和NF-κB信号通路提高GSK 3α/β和NF-κB蛋白磷酸化水平，进而抑制精子线粒体和己糖激酶活性，降低X精子的ATP水平和线粒体膜电位，从而导致X精子的活力降低。但其具体的分子调控机制仍有待进一步深入研究。同样，刘伟东[40]同样验证了分选后X精子和Y精子的纯度，发现上层的Y精子百分比为88.6%，而下层的X精子百分比为72.5%。由该研究结果可知，用TLR7和TLR8特异蛋白激活分选技术能够有效分离牛的X精子和Y精子，为研发性控精液新技术提供理论参考。同时有助于促进我国肉牛种业发展，加速良种肉牛繁育进程。
上述研究分别发现, TLR7和TLR8激活剂可通过调控小鼠、关中奶山羊和秦川牛X精子的线粒体活性和ATP水平抑制X精子的运动性能，激活TLR信号通路，通过GSK 3α/β-己糖激酶途径增加NF-κB和GSK 3α/β磷酸化，从而降低精子活力，但对Y精子无影响[40]。然而，对于TLR7和TLR8调节精子中己糖激酶活性的机制仍有待进一步研究[55]。
3 总结与展望在精子分离技术的研究中，上游法是一种简单、经济的精子分离方法，可使高活力精子上游而聚集在上层，低活力精子或死精子则留于下层，上游法分离出的精子具有更高的活力[63]。然而，该方法的分离结果在物种上存在一定差异[64]。在Umehara等[55]和Ren等[54]研究的基础上，刘伟东[40]通过改进上游法，并加入TLR7和TLR8激动剂R848，与牛精子共孵育使得上层精子比例显著降低，从而使X/Y精子分离。该方法利用TLR7和TLR8激动剂激活TLR7和TLR8受体，使X精子的活力及运动性能降低，从而分离出X/Y精子。这使得激活TLR7和TLR8成为分离出家畜X/Y精子的一种可能，有望为家畜的性控技术提供新方法。该方法目前在牛、奶山羊及猪中有进一步的研究，发现该方法在家畜生产中可能适用于牛和羊的X/Y精子分离，但并不适用于猪的X/Y精子分离。吴昌华等[56]研究结果表明, TLR7和TLR8蛋白在猪的两种性别精子中都有表达，说明在精子发生过程中，由X染色体编码的TLR7和TLR8蛋白在两种性别精子中可能得到了共享，从而使二者对TLR7和TLR8的定位表达表现出相似性。另外，将猪精子经R848孵育后，X/Y精子的活力均降低，但上层两种性别精子的比例没有显著变化[56]。李志强[65]关于猪X精子和Y精子蛋白质组学的研究显示，在公猪的X/Y精子差异蛋白中并未发现TLR7和TLR8蛋白，即TLR7和TLR8在猪的两种性别精子中都有表达，因此使得R848孵育后X/Y精子活力都受到影响而无法将其分离[56]。猪精子的TLR7和TLR8蛋白表达模式与小鼠、牛和奶山羊精子存在着很大的差异，这可能是不同物种间的差异性导致同一蛋白表达模式差异的结果，因而使得该方法在不同物种之间的应用有所差异。因此，利用该方法分离X/Y精子目前有待进一步研究，在不同家畜中的应用仍具有较高的研究价值。由于TLR7和TLR8基因的表达在哺乳动物X染色体上高度保守[66]，因此使用TLR7和TLR8配体活化的新型方案有望适应哺乳动物生殖技术，以便在短时间内分离X/Y精子，且无需使用昂贵、有害和耗时的细胞分选系统。
随着科学技术的不断发展和人类对畜产品经济效益追求的提升，人们对特定性别家畜的需求量不断增加，将来，对X/Y精子进行准确、完全、无损害的分离和对家畜进行简便、经济、安全、快速的性别筛选将会成为动物生产的未来趋势。因此，研究和发展性控技术将为高效、快速培养新的优良品种和高效的动物生产提供更有力的技术手段。后续，课题组将展开对激活TLR7和TLR8受体分离滩羊X/Y精子后X精子的代谢途径以及X/Y精子染色质开放性研究，以期取得进一步研究成果，为TLR7和TLR8分离X/Y精子的进一步研究做出贡献。目前，利用TLR7和TLR8进行X/Y精子分离成为具有极大前景的研究方向。本综述将为接下来在家畜中激活TLR7和TLR8进行精子分离技术提供更多的理论参考，以促进现代畜牧产业快速高质量发展。
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(编辑 郭云雁)