畜牧兽医学报  2024, Vol. 55 Issue (1): 395-400. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.01.037    PDF    
引用本文
杨恒, 李占鸿, 宋子昂, 高林, 李卓然, 廖德芳, 肖雷, 李华春. 帕利亚姆病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用[J]. 畜牧兽医学报, 2024, 55(1): 395-400.  
YANG Heng, LI Zhanhong, SONG Zi'ang, GAO Lin, LI Zhuoran, LIAO Defang, XIAO Lei, LI Huachun. Development and Application of Serotyping Real-time Quantitative RT-PCR Methods for Palyam Virus[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2024, 55(1): 395-400.  
帕利亚姆病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用
杨恒1,2, 李占鸿2, 宋子昂3, 高林2, 李卓然2, 廖德芳2, 肖雷2, 李华春2     
1. 昆明学院农学与生命科学学院, 昆明 650214;
2. 云南省畜牧兽医科学院 云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室, 昆明 650224;
3. 南京农业大学动物医学院, 南京 210095
收稿日期：2023-01-31
基金项目：昆明学院引进人才科研项目（YJL2210）；国家公益性行业（农业）科研专项（201303035）
作者简介：杨恒(1978-), 男, 四川西昌人, 研究员, 博士, 主要从事牛羊虫媒病毒研究, E-mail: yangheng2008.cool@163.com; 李占鸿(1989-), 男, 大理人, 助理研究员, 硕士, 主要从事牛羊虫媒病毒研究, E-mail: dy081lzh@163.com, Tel: 0871-65897407.
杨恒和李占鸿为同等贡献作者
通信作者：李华春, 主要从事牛羊虫媒病毒研究, E-mail: Li_huachun@hotmail.com; 肖雷, 主要从事牛羊虫媒病毒研究, E-mail: XL914204@126.com.
摘要：本研究拟建立帕利亚姆病毒（Palyam virus，PALV）血清型特异性实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）方法用于临床样本或媒介中PALV血清型鉴定。根据我国流行PALV毒株的基因节段2序列，设计扩增引物和TaqMan探针，建立PALV血清型特异型qRT-PCR方法，对方法的特异性、灵敏性与重复性进行评估；以我国分离的28株PALV和90份核酸阳性血液样本评估检测方法的可靠性；利用建立的方法对采集库蠓样本中携带的PALV进行血清型鉴定。结果显示，建立的PALV血清型qRT-PCR检测方法具有良好的特异性与灵敏性，可检出核酸拷贝数下限在22至28 copies·μL-1。对28株PALV的qRT-PCR检测结果与病毒测序鉴定结果一致；对PALV不同感染阶段哨兵动物血液（90份）中的qRT-PCR鉴定结果与分离病毒的血清型鉴定结果一致；建立的方法可准确鉴定库蠓中携带PALV的血清型。本研究建立的PALV血清型qRT-PCR定型方法具有良好的特异强、敏感性与重复性，可用于PALV感染动物与媒介中PALV血清型的鉴定，具有良好的应用价值。
关键词：帕利亚姆病毒    血清型鉴定    实时荧光定量RT-PCR    检测方法    
Development and Application of Serotyping Real-time Quantitative RT-PCR Methods for Palyam Virus
YANG Heng1,2, LI Zhanhong2, SONG Zi'ang3, GAO Lin2, LI Zhuoran2, LIAO Defang2, XIAO Lei2, LI Huachun2     
1. College of Agriculture and Life Sciences, Kunming University, Kunming 650214, China;
2. Yunnan Tropical and Subtropical Animal Virus Diseases Key Laboratory, Yunnan Animal Science and Veterinary Institute, Kunming 650224, China;
3. College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Corresponding author: LI Huachun, E-mail: Li_huachun@hotmail.com; XIAO Lei, E-mail: XL914204@126.com.
Abstract: The aim of present study was to develop serotyping real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) methods for serotype identification of Palyam virus (PALV) from clinical samples or insect vector. According to segment 2 (Seg-2) sequences of Chinese epidemic PALV strains, PALV serotype-specific qRT-PCR methods were established and their specificity, sensitivity and repeatability were evaluated. The reliability of the established qRT-PCR methods was assessed by 28 Chinese PALV strains and 90 PALV-positive blood samples, then the established methods were applied to identify the serotypes of PALV from the collected Culicoides samples. The established PALV serotyping qRT-PCR methods showed highly specificity and sensitivity, with the minimum copy number of detectable viral nucleic acid ranging from 22 to 28 copies·μL-1. The qRT-PCR identification results of 28 PALV strains are consistent with the results of virus sequencing. Furthermore, serotype qRT-PCR identification results of 90 PALV-positive blood samples from infected sentinel animals were consistent with serotyping results of the isolated PALVs. The established method can accurately identify the serotype of PALV collected from Culicoides samples. With features of strong specificity, high sensitivity and positive repeatability, the PALV serotype-specific qRT-PCR methods established in this study could be used for rapid and accurate diagnosis of the serotypes of PALV in vectors and animals.
Key words: Palyam virus    serotype identification    real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction    detection method    

帕利亚姆血清群病毒(Palyam virus, PALV)隶属呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)，广泛分布于世界范围的热带、亚热带与温带地区。病毒通过库蠓(Culicoides spp.)对动物的叮咬传播，主要感染牛、羊等反刍动物，引起妊娠期家畜出现生产异常(流产、死胎或脑组织发育不全的畸形胎)[1-2]。1985—1986年，日本爆发妊娠牛感染PALV导致的分娩异常，给日本养牛业造成了严重的经济损失[3-4]。对牛、羊等反刍动物的血清学调查结果显示，PALV在我国由南(海南)至北(内蒙)，由东(江苏)至西(新疆)的广泛区域流行[5-7]，建立PALV诊断方法，对防止疫情的发生十分重要。

本实验室于2012年首次从我国云南省的哨兵牛上分离出Chuzan virus(CHUV)[8]，随后在云南、广东与广西设立的哨兵牛中开展PALV的监测与病毒分离工作，除分离获得多株CHUV外，还在我国首次分离出D’Aguilar Virus(DAV)与Bunyip Creek virus(BCV)[9]，表明多种血清型的PALV流行于我国南方地区，对我国牛羊养殖业的健康发展构成了潜在威胁。实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)具有特异性强、灵敏度高与重复性好的优势，目前国内外尚未见PALV血清型实时荧光定量RT-PCR检测方法的报道。本研究根据我国流行PALV毒株基因节段2(Seg-2)序列特征，首次报道了我国流行PALV三种血清型(CHUV、BCV与DAV)的qRT-PCR检测方法，为开展PALV诊断与流行病学监测提供了技术手段。

1 材料与方法 1.1 病毒、血液样品与核酸样品

自我国云南省、广西壮族自治区与广东省分离到的CHUV(14株)、BCV(8株)与DAV(6株)共计28株PALV由本实验室分离保存。蓝舌病毒(BTV)、流行性出血症病毒(EHDV)、西藏环状病毒(TIBOV)与阿卡斑病毒(AKAV)由本实验室从设立于云南省的哨兵牛上分离保存。CHUV、BCV与DAV阳性血液样本各30份，采集自云南省设立的哨兵动物。PALV基因节段7全长序列克隆质粒PLB-CHUV/V144/Seg-7质粒由本实验室构建[10]。

1.2 主要试剂

磁珠法病毒RNA抽提试剂盒MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit购自美国Thermo-Fisher公司；RNAiso-Plus、病毒DNA/RNA提取试剂盒、实时荧光定量RT-PCR试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒与逆转录酶等购自大连宝生物公司。

1.3 引物和探针的设计与合成

从GenBank中下载PALV的Seg-2序列，与本实验室获取中国流行CHUV、BCV与DAV毒株Seg-2全长序列进行序列比对，选择序列保守区域，使用Beacon Designer 8.0软件进行特异性扩增引物与TaqMan探针的设计(表 1)。

表 1 CHUV、BCV与DAV检测用qRT-PCR引物与探针信息 Table 1 Information of qRT-PCR primers and probes for CHUV, BCV and DAV detection
1.4 标准曲线的绘制和敏感性试验

以10倍梯度稀释的PLB-CHUV/V144/Seg-7质粒为模板(核酸拷贝数1.2×102~1.2×108 copies ·μL-1) 建立标准曲线，取1 μL合成的CHUV、BCV与DAV参考毒株cDNA为模板，通过PALV群特异性qRT-PCR[10]进行绝对定量qPCR反应，计算参考毒株cDNA拷贝数。将cDNA稀释为101~108 copies ·μL-1，使用设计的血清型特异性荧光定量引物(表 1)，每个稀释度重复进行3次qPCR反应。以病毒核酸拷贝数的对数值为横坐标，以荧光信号值为纵坐标建立标准曲线，计算相关系数(R2)和扩增效率(E值)，分析PALV血清型qRT-PCR方法可检测核酸拷贝数的下限。

1.5 重复性试验

分别取低浓度(102 copies ·μL-1)、中浓度(105 copies ·μL-1)与高浓度(108 copies ·μL-1)的CHUV、BCV与DAV参考毒株cDNA 1 μL为模板，进行3次批次内和批次间平行qPCR试验，计算所得Ct值的标准差(STD)与变异系数(CV)，分析方法的重复性。

1.6 qRT-PCR检测效果的验证

提取我国分离28株PALV的核酸，取1 μL核酸为模板进行PALV血清型qRT-PCR检测。取90份PALV感染阳性动物的血液样本，使用MagMax Express核酸自动提取仪提取病毒核酸，取5 μL提取的核酸为模板，进行PALV血清型的qRT-PCR验证，将反应产生扩增曲线，而且Ct值＜38.0判定为阳性结果。

1.7 PALV血清型qRT-PCR检测方法的应用

取2019年在云南省师宗县五龙乡采集的库蠓样本，将50~60只库蠓分为一批。在库蠓样本中加入200 μL PBS，使用TissueLyser Ⅱ匀浆器(Qiagen)进行匀浆，使用RNAiso-Plus提取匀浆样本的核酸，使用PALV群特异性qRT-PCR检测样本中PALV核酸，对阳性样本进行病毒血清型qRT-PCR鉴定。

2 结果 2.1 PALV血清型特异性qRT-PCR的灵敏度性分析

反转录合成CHUV、BCV与DAV参考毒株的cDNA，进行绝对定量qPCR分析，显示其拷贝数分别为2.45×108、2.28×108与2.85×108 copies ·μL-1。将合成的cDNA稀释为101至108 copies ·μL-1，每个稀释度设置3个重复进行qPCR反应。结果显示，3种血清型PALV的qPCR反应扩增效率(E)范围为92.53%~106.00%，相关系数(R2)值＞0.998，可检出核酸最低拷贝数均＜30 copies(图 1、表 2)，表明建立的PALV血清型qRT-PCR方法具有良好的灵敏度。

A~C. 分别为CHUV、BCV与DAV血清型特异性qRT-PCR灵敏度分析结果：1~8. 将病毒的cDNA模板进行1×10-1至1×10-8倍梯度稀释。D. 特异性分析结果。图中横坐标表示PCR循环数，纵坐标(Rn)表示荧光信号强度 A-C. Results of CHUV, BCV and DAV qRT-PCR sensitivity analysis: 1-8. cDNA templates were gradient diluted from 10-1 to 10-8. D. Results of specificity analysis. Abscissa and ordinate indicated number of PCR cycles and fluorescence signal intensity (Rn), respectively 图 1 PLAV血清型特异性qRT-PCR检测方法的灵敏度与特异性分析结果 Fig. 1 Sensitivity and specificity analysis results of PLAV serotype-specific qRT-PCR
表 2 PALV血清型特异性qRT-PCR检测方法的标准曲线和灵敏度分析 Table 2 Standard curves and sensitivity assay results of PALV serotyping qRT-PCR
2.2 PALV血清型特异性qRT-PCR的特异性与重复性试验

取1 μL提取的CHUV、BCV、DAV、BTV、EHDV、TIBOV与AKAV核酸为模板，以RNase-Free H2O为阴性对照，进行PALV血清型qRT-PCR反应，显示仅CHUV、BCV与DAV的核酸模板有相应的扩增曲线产生，而其它病毒的核酸检测结果均为阴性，表明建立PALV血清型特异性qRT-PCR检测方法具有良好的特异性(图 1)。分别以102、105和108 copies ·μL-1等3个浓度的CHUV、BCV和DAV核酸为模板，进行组内和组间的重复性试验，结果显示组内Ct值的CV值在0.42%~1.41%之间，组间Ct值的CV值在1.03%~1.88%之间，组内与组间CV值均小于2%，表明方法具有良好的重复性。

2.3 PALV血清型特异性qRT-PCR的验证结果

选择我国2012年至2020年在云南省、广西壮族自治区与广东省分离的28株PALV，进行PALV血清型qRT-PCR的回复验证。结果显示，建立的CHUV、BCV与DAV血清型特异性qRT-PCR均可检测对应血清型PALV毒株，吻合率为100%，反应的Ct值在9.9~19.7之间，表明建立的PALV血清型qRT-PCR可对我国不同时间与不同地域流行的PALV毒株进行血清型定型。

取CHUV、BCV与DAV感染哨兵动物上采集的血液样本各30份，提取核酸进行PALV的群特异性qRT-PCR检测。根据获取的Ct值，可将血液样本分为“强阳性样本”(Ct值在29.0~34.0之间)与“弱阳性样本”(Ct值在34.0~37.0之间)。建立的PALV血清型特异性qRT-PCR检测方法对“强阳性”与“弱阳性”血液样本均可产生有效的扩增曲线，获取的Ct值与PALV群特异性qRT-PCR检测结果基本保持一致，表明本研究建立的qRT-PCR方法可准确鉴定动物感染PALV的血清型。

2.4 库蠓样本中PALV血清型的检测

对2019年在师宗县采集的6批库蠓进行PALV核酸的检测。结果在4批库蠓中检测到PALV核酸，Ct值在25.7~35.3之间。对库蠓携带的PALV的血清型进行qRT-PCR检测，与预期结果一致，在不同批次的库蠓中检测到CHUV、BCV与DAV核酸。值得注意是，其中一批库蠓，虽然PALV群特型qRT-PCR的Ct值为35.3，但3种血清型PALV的qRT-PCR检测结果均为阴性，提示在师宗县还可能存在血清型未知的PALV的流行。

3 讨论

建立的PALV血清型qRT-PCR方法能否对我国不同时间与不同地域流行PALV毒株进行鉴定，是衡量方法可靠性的重要指标之一。对此，本研究选择了2012—2020年我国云南、广东与广西等地分离的28株PALV[9]进行血清型的qRT-PCR回复验证，结果显示，研究建立的PALV血清型qRT-PCR鉴定结果与分离毒株的测序鉴定结果一致，表明方法具有良好的“覆盖度”，可有效鉴定我国不同时间、不同地域流行PALV毒株的血清型。

为分析建立的血清型qRT-PCR方法能否检测PALV不同感染阶段动物血液中的病毒核酸，取CHUV、BCV与DAV感染哨兵动物抗体转阳前1周(病毒感染早期)、抗体转阳后1~2周(病毒血症高峰期)以及抗体转阳后2个月(病毒感染晚期)的血液样本进行PALV血清型qRT-PCR检测。结果显示，建立的PALV血清型qRT-PCR既可检测PALV核酸含量较高的“强阳性”样本(病毒血症高峰期)，也可检测病毒含量较低的“弱阳性”样本(感染早期与病毒感染晚期)。以上结果证实，本研究建立的PALV血清型特异性qRT-PCR检测方法具有良好的敏感度，可用于不同感染时期动物血液中PALV的血清型鉴定。

将本研究建立的PALV血清型特异性qRT-PCR方法对2019年师宗县采集库蠓样本中携带的PALV的血清型进行鉴定。在库蠓中鉴定出了CHUV、BCV与DAV。然而值得注意的是，其中一批被测库蠓虽然PALV核酸检测为阳性，但是PALV血清型qRT-PCR检测结果均为阴性。以上结果表明，建立的PALV血清型qRT-PCR方法可用于媒介中携带PALV血清型的鉴定，同时也提示在师宗县可能还存在其它血清型的PALV的流行。

4 结论

本研究建立的PALV血清型qRT-PCR定型方法具有良好的特异强、敏感性与重复性，可用于PALV感染动物与媒介中PALV血清型的鉴定，具有良好的应用价值。

参考文献
[1]
EBERSOHN K, COETZEE P, SNYMAN L P, et al. Phylogenetic characterization of the palyam serogroup orbiviruses[J]. Viruses, 2019, 11(5): 446. DOI:10.3390/v11050446
[2]
YAMAKAWA M, OHASHI S, KANNO T, et al. Genetic diversity of RNA segments 5, 7 and 9 of the Palyam serogroup orbiviruses from Japan, Australia and Zimbabwe[J]. Virus Res, 2000, 68(2): 145-153. DOI:10.1016/S0168-1702(00)00163-5
[3]
YAMAGUCHI R, TANIMOTO N, TATEYAMA S, et al. Immunohistochemical study of age-dependent brain lesions in mice infected intracerebrally with Kasba (Chuzan) virus[J]. J Comp Pathol, 2001, 124(1): 36-45. DOI:10.1053/jcpa.2000.0426
[4]
MIURA Y, GOTO Y, KUBO M, et al. Isolation of Chuzan virus, a new member of the Palyam subgroup of the genus orbivirus, from cattle and culicoides oxystoma in Japan[J]. Am J Vet Res, 1988, 49(12): 2022-2025.
[5]
张义爽, 王芳, 武瑞, 等. 我国中山病的血清流行病学调查[J]. 中国预防兽医学报, 2017, 39(1): 1-4.
ZHANG Y S, WANG F, WU R, et al. The serological epidemiological investigation of Chuzan disease by micro-neutralization test in China[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2017, 39(1): 1-4. (in Chinese)
[6]
WANG M, WANG Y, BALOCH A R, et al. Chuzan virus in yaks, Qinghai-Tibetan plateau, China[J]. Emerg Infect Dis, 2018, 24(12): 2371-2373. DOI:10.3201/eid2412.171414
[7]
杨振兴, 朱沛, 李占鸿, 等. 我国牛羊中山病血清学调查[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(8): 1715-1722.
YANG Z X, ZHU P, LI Z H, et al. Serological investigation of Chuzan disease of cattle, goat and sheep in China[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2019, 50(8): 1715-1722. (in Chinese)
[8]
YANG H, XIAO L, MENG J X, et al. Complete genome sequence of a Chuzan virus strain isolated for the first time in mainland China[J]. Arch Virol, 2016, 161(4): 1073-1077. DOI:10.1007/s00705-015-2734-2
[9]
杨恒, 肖雷, 李占鸿, 等. 2012—2016年中国南方地区帕利亚姆血清群病毒的分离与序列特征分析[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(4): 761-770.
YANG H, XIAO L, LI Z H, et al. Sequence analysis of palyam serogroup virus isolated in south China from 2012 to 2016[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2018, 49(4): 761-770. (in Chinese)
[10]
李占鸿, 李卓然, 宋子昂, 等. 帕利亚姆血清群病毒qRT-PCR检测方法的建立与应用[J]. 病毒学报, 2020, 36(1): 100-108.
LI Z H, LI Z R, SONG Z A, et al. Establishment of a qRT-PCR for the Palyam serogroup virus[J]. Chinese Journal of Virology, 2020, 36(1): 100-108. (in Chinese)

(编辑   范子娟)