动物养殖业是抗菌药物排放和细菌耐药性产生的源头之一[1]，坚持“人病兽防、关口前移”，更应加强细菌耐药性的基础研究[2-3]。鉴于哺乳动物不存在与病原细菌类似的生物素代谢调控机制，这使得“阻断细菌生物素的合成和转运途径”可作为一类崭新的抗细菌药物靶标[4-5]。牛支原体(Mycoplasma bovis)是一种能引起牛发生肺炎、乳房炎和关节炎等疾病的高度传染性病原体，在全球范围内分布和流行，为目前发现的能在无细胞培养基生长的最简单原核生物，其感染与生存依赖于外界微环境提供的各类营养代谢因子[6-7]。目前，世界范围内M. bovis疫苗的研制尚无显著成果[8]，临床中只能采用抗生素治疗和综合防控措施相结合的方法进行防控，M. bovis菌株严重耐药，是该病防控中全球面临的共同难题[9-11]。生物素(Vitmin H或B7)是一个具有7个碳原子骨架的含硫脂肪酸衍生物，是所有生物体所必需的微营养辅助因子[12]。基于此，开展M. bovis的B7转运机制研究，以期拓宽对细菌B7代谢调控领域的认知，揭示介导细菌B7代谢调控的多样性和复杂性，将对M. bovis防控具有极其重要的意义[13-14]。
从自然选择的能量最优化的角度来看，B7对细菌的生理代谢起着关键作用[12]。科学家发现存在于革兰阳性菌(乳酸菌、链球菌属、金黄色葡萄球菌、荚膜红细菌)之中的能量耦合转运蛋白(energy-coupling factor transporter，ECF)负责摄入一些维生素及其他微量元素[15-19]，是近年来新鉴定的一类ATP结合盒(ABC)转运蛋白家族。通常，ECF转运蛋白复合物包含三个原件：S成分(一个识别和转运底物的膜蛋白)，A/A′成分(能量耦合模块，包括两个结合并水解ATP提供能量的亲水蛋白)，以及T组分(一个传递能量的跨膜蛋白)。研究显示，ECF转运蛋白的S组件BioY搬运蛋白[20-21]能积极地发挥B7的吸收功能[22]，并且仅表达BioY搬运蛋白就可以从环境中摄入足够的生物素，以支持这类B7缺陷型细菌的存活[16, 19]。近年来，原核生物中B7代谢调控的研究已逐步深入，但还有很多问题亟待解决[5, 23-24]。从作者对M. bovis生长所需的营养丰富型培养基(需额外添加B7)，到对M. bovis生理学的初步了解，暗示其可能存在生物素转运代谢相关的系统，但有关M. bovis代谢调控的研究甚少[25-26]，迄今更未见到M. bovis B7代谢相关的研究报道[6-7, 27-29]。
近期全基因组重测序和比较基因组学分析发现M. bovis PG45染色体上的基因MbBioY(MBOVPG45_0349)与ECF转运蛋白S成分中的BioY基因同源。明确MbBioY具有摄取外源B7的功能，可作为一类潜在的抗牛支原体药物靶标，为缓解M.bovis耐药性的严峻形势提供独特视角和解决方案。
1 材料与方法 1.1 菌株与质粒牛支原体PG45株、PG45株荧光突变体库由本实验室构建、阿拉伯糖诱导性表达的pBAD表达载体，均由中国农业科学院兰州兽医研究所草食动物细菌病团队保存。大肠杆菌MG1655(ΔbioC、ΔbioH、ΔbioHΔyigM)的缺失株由浙江大学赠送，大肠杆菌Red同源重组系统由南京农业大学赠送；大肠杆菌ATCC25922购自美国菌种保藏中心，大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司。pMD19-T载体购自宝生物大连工程有限公司。
1.2 主要材料DL2000 DNA Marker(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)。细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)。质粒小提试剂盒(美国Omega)、DNA凝胶回收试剂盒(美国Omega)。2×Taq Master Mix (Thermo Fisher)。胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)、胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)均购自美国BD difcoTM公司；LB肉汤(英国Oxoid)；琼脂粉(北京Solarbio公司)；0.22 μm无菌硝酸纤维素膜和过滤器购自美国Millipore公司；限制性内切酶，T4 DNA连接酶，质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司。改良Thiaucourt’s液体培养基或固体培养基: PPLO肉汤(21 g·L-1)或PPLO琼脂(35 g·L-1)、丙酮酸钠(2 g·L-1)、灭活马血清(200 mL·L-1)、酵母浸出液(100 mL·L-1)、葡萄糖(2 g·L-1)、1% 酚红(2. 5 mL·L-1)、青霉素(20万U·L-1)、10% 醋酸铊(1 mL·L-1)，调节pH至7. 2~7. 4。紫外分光光度计购于美国Backman公司；台式高速离心机购自Beckman公司；PCR热循环仪(杭州博日科技公司)；CO2恒温培养箱(美国Thermo公司)；摇床(上海苏坤实业有限公司)；凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；全自动化学发光成像仪(天能科技有限公司)。
根据M. bovis PG45株MBOVPG45_0349基因序列(GenBank登录号：NC_014 760.1)，利用NCBI在线设计引物，其中上游引物0349-F序列：5′-cggaattcCTAATATGAAACTTTGTTTCTTT-CA-3′；下游引物0349-R序列：5-gcgtcgacATGGAGGGTATATATAGTAGCAAAGAATT-3′，产物大小966 bp，引物由西安擎科生物科技有限公司合成。
1.3 突变株的筛选取出已成功构建的M. bovis PG45荧光突变体库，利用Southern blot鉴定出基因插入的次数，目前的库容量含有约1 368株突变株。将待测转座突变菌分别接种在Thiaucourt’s培养基和不含生物素的Thiaucourt’s筛选培养基(利用海狸生物科技有限公司链霉亲和素BeaverBeadsTM Streptavidin试剂盒去除培养基中的生物素，即取50 mL改良Thiaucourt’s培养基加入500 μL的链霉亲和素磁珠，放置于4 ℃摇床上，结合16 h后，在超净台中用磁性分离架去除磁珠，将上清液倒于新的离心管中。为防止污染，可再用0.22 μmol·L-1过滤器进行过滤一次)平板上连续培养，通过平行比较，当同一单克隆菌落在改良Thiaucourt’s培养基上能正常生长，而在去除生物素的Thiaucourt’s筛选培养基上无法生长时，即初步判定该单克隆菌株为生长缺陷突变株，通过对靶基因MBOVPG45_0349进行PCR扩增鉴定，最终筛选出MbBioY基因突变株。
1.4 功能性克隆取出-80 ℃冻存的MG1655(ΔbioC、ΔbioH、ΔbioHΔyigM)的缺失株复苏。同时从MG1655中提取pBAD质粒，并对提取的质粒进行质量浓度测定。用EcoR Ⅰ/Sal Ⅰ对质粒进行双酶切鉴定。酶切体系如下：pBAD质粒1 μg，EcoR Ⅰ/Sal Ⅰ酶各1 μL，buffer 3 μL，去离子水补足至30 μL。放置于37 ℃水浴锅中2~3 h，核酸电泳进行产物分离。按照Omega的琼脂糖凝胶回收试剂盒对核酸产物进行回收，得到线性化的pBAD质粒。以PG45基因组为模板，以0349-F/0349-R为引物，扩增MBOVPG45_0349基因全长。进行琼脂糖核酸电泳，胶回收，并测定基因片段的浓度。基因片段进行EcoR Ⅰ/Sal Ⅰ双酶切，酶切体系如上。将酶切完成的质粒pBAD和MBOVPG45_0349片段，进行连接。连接体系如下：2×ligation mix 5 μL，酶切质粒pBAD 1 μL，酶切片段MBOVPG45_0349 4 μL。25 ℃连接2 h。将连接完成的体系加入到MG1655感受态细胞，具体操作：冰浴30 min，42 ℃热激60 s，立即转回冰上放置2 min左右，加入1 mL LB培养基37 ℃，220 r·min-1振荡培养1 h。5 000 r·min-1，离心3 min，收集菌体，弃上清(保留底部200 μL)，重悬菌体，全部涂布于Amp+LB平板。37 ℃培养箱静置培养16 h后，挑菌接种于Amp+LB液体培养基，37 ℃ 220 r·min-1振荡培养4 h以上至菌液浑浊，PCR鉴定，标记为MG1655(ΔbioC+pMbBioY、ΔbioH+pMbBioY、ΔbioHΔyigM+pMbBioY)。
1.5 生物素敏感性检测复苏野生株PG45，突变株PG45ΔMbBioY，利用CFU计数法绘制M. bovis PG45株的生长曲线，开展MG1655及其缺失株，PG45ΔMbBioY与PG45亲本株生物素敏感性检测，评价PG45ΔMbBioY和PG45亲本株在不同生物素浓度下对其生长的影响。复苏MG1655(ΔbioC、ΔbioH、ΔbioHΔyigM)缺失株及MG1655(ΔbioC+pMbBioY、ΔbioH+pMbBioY、ΔbioHΔyigM+pMbBioY)构建的回补株，转接于10 mL LB培养基或者去除生物素的LB培养基(方法同上)，放置于37 ℃，220 r·min-1摇床每2 h取出200 μL测定OD600 nm，记录OD600 nm，绘制生长曲线。同时制备包含0.2%阿拉伯糖的0 nmol·L-1生物素和4 nmol·L-1生物素的LB平板，进行划线培养，评估MbBioY对生物素代谢营养缺陷大肠杆菌缺失株的生长影响。
2 结果 2.1 牛支原体PG45和PG45ΔMbBioY生物素敏感性检测利用Southern blot及PCR鉴定出实验室筛选获得的MbBioY(MBOVPG45_0349)基因突变株，同时利用CFU计数法绘制的M. bovis PG45株的生长曲线，开展PG45ΔMbBioY与PG45亲本株生物素敏感性检测，评价PG45ΔMbBioY和PG45亲本株在不同生物素浓度下对其生长的影响(图 1)。
|
A.亲本株PG45与PG45ΔMbBioY在不添加生物素的培养基中均无法生长；B.亲本株PG45在添加1 nmol·L-1生物素的培养基中可正常生长，而PG45ΔMbBioY在添加1 nmol·L-1生物素的培养基中无法生长；C.亲本株PG45在添加10 nmol·L-1生物素的培养基中可正常生长，而PG45ΔMbBioY在添加10 nmol·L-1生物素的培养基中无法生长；D.亲本株PG45在添加100 nmol·L-1生物素的培养基中可正常生长，而PG45ΔMbBioY在添加100 nmol·L-1生物素的培养基中可以缓慢生长；E.亲本株PG45和PG45ΔMbBioY在添加1 μmol·L-1生物素的培养基中均可正常生长 A. Neither PG45 nor PG45ΔMbBioY could grow in the absence of biotin; B. The parent strain PG45 could grow normally, but PG45ΔMbBioY could not grow when 1 nmol·L-1 biotin was added to the medium; C. When 10 nmol·L-1 biotin was added to the medium, the parent strain PG45 could grow normally, but PG45ΔMbBioY could not grow; D. When 100 nmol·L-1 Biotin was added to the medium, PG45 could grow normally, but PG45ΔMbBioY grew slowly; E. Both parental strains PG45 and PG45ΔMbBioYgrew normally when 1 μmol·L-1 biotin was added to the medium 图 1 PG45ΔMbBioY与PG45亲本株生物素敏感性检测 Fig. 1 Biotin sensitivity test of PG45ΔMbBioY and PG45 parental strain |
利用OD600 nm检测大肠杆菌MG1655及其MG1655(ΔbioC、ΔbioH、ΔbioHΔyigM)缺失株的生物素敏感性，绘制大肠杆菌MG1655及其MG1655(ΔbioC、ΔbioH、ΔbioHΔyigM)缺失株生长曲线，评价大肠杆菌MG1655及其MG1655(ΔbioC、ΔbioH、ΔbioHΔyigM)在不含生物素的LB培养基中的生长情况(图 2)。结果显示，在去除生物素的LB培养基中，MG1655能正常生长，而MG1655(ΔbioC、ΔbioH、ΔbioHΔyigM)缺失株均无法正常生长，在添加1 nmol·L-1生物素的LB培养基中，MG1655与MG1655(ΔbioC、ΔbioH)能缓慢生长，而MG1655ΔbioHΔyigM缺失株不能正常生长，表明yigM的缺失，影响大肠杆菌获取外源生物素的能力。
|
A. MG1655在无生物素的LB培养基中能正常生长，而MG1655(ΔbioC、ΔbioH、ΔbioHΔyigM)的缺失株在去除了生物素的LB培养基中不能正常生长；B. MG1655在无生物素的LB培养基中添加1 nmol·L-1生物素时能正常生长，而MG1655ΔbioC和MG1655ΔbioH在无生物素的LB培养基中添加1 nmol·L-1生物素时能缓慢生长，而MG1655ΔbioHΔyigM在无生物素的LB培养基中添加1 nmol·L-1生物素时无法生长，表明yigM的缺失，影响大肠杆菌获取外源生物素的能力 A. MG1655 without adding biotin LB can grow normally, and MG1655(ΔbioC, ΔbioH, ΔbioHΔyigM) were unable to grow; B. When adding 1 nmol·L-1 biotin LB, MG1655 can grow normally and MG1655(ΔbioC, ΔbioH) were slow growth, MG1655ΔbioHΔyigM cannot grow, indicating that yigM can affect the ability of E. coli to obtain exogenous biotin 图 2 大肠杆菌MG1655及其缺失株生物素敏感性检测 Fig. 2 E. coli MG1655 and its deletion strains detected by biotin sensitivity |
根据大肠杆菌MG1655及其MG1655(ΔbioC、ΔbioH、ΔbioHΔyigM)对生物素的敏感性，将MbBioY基因异源敲入生物素代谢营养缺陷大肠杆菌MG1655(ΔbioC+pMbBioY、ΔbioH+pMbBioY、ΔbioHΔyigM+pMbBioY)后，开展M.bovis功能性克隆验证(图 3)，表明MbBioY单独存在时，就能够恢复生物素代谢营养缺陷大肠杆菌缺失株MG1655ΔbioHΔyigM的正常生长。
|
当培养基不添加生物素时，MG1655(ΔbioC、ΔbioH、ΔbioHΔyigM)的缺失株均无法生长；当培养基添加4 nmol·L-1生物素时，异源基因敲入生物素代谢营养缺陷大肠杆菌MG1655(pBAD-MbBioY)、MG1655ΔbioHΔyigM无法生长，MG1655ΔbioC+pBAD-MbBioY、MG1655ΔbioHΔyigM+pBAD-MbBioY的缺失回补株可正常生长，表明MbBioY单独存在时，就能够恢复生物素代谢营养缺陷大肠杆菌缺失株的生理功能 MG1655 without adding biotin (ΔbioC, ΔbioH, ΔbioHΔyigM) were unable to grow; When adding 4 nmol·L-1 biotin, heterologous genes knock into biotin metabolically deficient E. coli MG1655 (pBAD-MbBioY), MG1655ΔbioH ΔyigM cannot grow, MG1655 ΔbioC+pBAD-MbBioY, MG1655 Δ bioH ΔyigM+pBAD-MbBioY can grow normally, indicating that MbBioYalone can restore the physiological function of the deficient strain of Escherichia coli with biotin metabolism and nutrition deficiency 图 3 MbBioY功能性克隆验证 Fig. 3 MbBioY functional clone verification |
M. bovis作为极简微生物的代表，介于细菌和病毒之间，无细胞壁，是一种最小的有细胞结构的微生物[6]。因基因组很小，研究证实其编码基因主要与分解代谢有关，而缺失大量涉及生物合成的相关基因[6, 9]。通过对M.bovis PG45株全基因组重测序和比较基因组学分析，发现M. bovis不具有完整的生物素代谢合成途径(BioFADB)，生物素敏感性检测后发现M. bovis在去除生物素的培养基中不能正常生长，只有在添加了生物素的培养基中，通过从外界摄取生物素来维持正常的生理功能，说明生物素是M. bovis生长的必须元素(图 1)。PG45染色体上存在能量偶合因子(ECF)转运蛋白复合物，包含三个完整的原件，其中与能量偶合因子(ECF)转运蛋白S成分的BioY同源的基因MbBioY(MBOVPG45_0349)，全长996 bp，GC含量30.95%，预测编码产物MbBioY蛋白长度为332个氨基酸，是一个识别和转运底物的膜蛋白，MbBioY与目前已知的能量偶合因子(ECF)转运蛋白家族的S成分亲缘关系都很近，在支原体种属中的氨基酸相似性为23.58%~100.00%，在不同种属细菌中的氨基酸相似性为10.41%~79.01%，属于ECF转运蛋白家族的S成分一员，由7个跨膜结构域组成，与之前发现的能够转运外源生物素的S成分BioY蛋白(6个跨膜结构域)不同，提示该蛋白结构更复杂有待进一步探索；同时，分子对接(UCSF DOCK 6)显示(与乳酸乳杆菌Lactococcus lactis BioY PDB 4DVE比较)，MbBioY蛋白转运生物素的结合位点位于几个跨膜片段的周质部分，表明可能是一种崭新的生物素膜转运蛋白。试验验证后发现，当M.bovis缺失能量偶合因子转运蛋白S组件MbBioY会影响其生长，表现出生物素代谢营养缺陷的表型(图 1)。通过构建生物素代谢营养缺陷大肠杆菌，检测大肠杆菌MG1655及其缺失株生物素敏感性，发现MG1655ΔbioC、MG1655ΔbioH的缺失，主要与MG1655的生物素合成相关，所以在添加了生物素的培养基中可以恢复正常的生长，而yigM是大肠杆菌生物素外源转运的关键基因，yigM的缺失影响大肠杆菌获取外源生物素的能力，MG1655ΔbioHΔyigM缺失株既不能自身合成生物素也不能从外源获得生物素(图 2)，因此MG1655ΔbioHΔyigM缺失株在无生物素的环境下无法正常生长，当开展MbBioY异源功能性克隆验证时，通过将MbBioY异源敲入生物素代谢营养缺陷大肠杆菌MG1655ΔbioHΔyigM+pBAD-MbBioY后，发现MbBioY在添加了生物素的培养基中，能够恢复MG1655ΔbioHΔyigM缺失株的正常生长，MbBioY与大肠杆菌生物素合成的关键基因bioC、bioH不同，而与yigM一样，具有获取外源生物素的能力，表明MbBioY单独存在时就能够恢复生物素代谢营养缺陷大肠杆菌缺失株MG1655ΔbioHΔyigM的生理功能(图 3)。
4 结论通过MbBioY在大肠杆菌生物素代谢合成障碍缺失株中的异源表达，初步证明，MbBioY编码的是能量偶合因子(ECF)转运蛋白的S成分，具有摄取外源生物素的能力，揭示了一种潜在的ECF转运蛋白运输新机制。这些结果将有助于完善细菌生物素代谢调控的复杂网络，对M. bovis防控提供独特视角。
| [1] |
O'LEARY K. The global burden of antimicrobial resistance[J/OL]. Nat Med, 2022, doi: 10.1038/d41591-022-00033-z.[2023-07-10].https://www.nature.com/articles/d41591-022-00033-z.
|
| [2] |
TACCONELLI E, SIFAKIS F, HARBARTH S, et al. Surveillance for control of antimicrobial resistance[J]. Lancet Infect Dis, 2018, 18(3): e99-e106. DOI:10.1016/S1473-3099(17)30485-1 |
| [3] |
BURKI T K. Tackling antimicrobial resistance in food-producing animals[J]. Lancet Respir Med, 2018, 6(2): 93-94. DOI:10.1016/S2213-2600(18)30017-1 |
| [4] |
CARFRAE L A, MACNAIR C R, BROWN C M, et al. Mimicking the human environment in mice reveals that inhibiting biotin biosynthesis is effective against antibiotic-resistant pathogens[J]. Nat Microbiol, 2020, 5(1): 93-101. |
| [5] |
BOCKMAN M R, MISHRA N, ALDRICH C C. The biotin biosynthetic pathway in mycobacterium tuberculosis is a validated target for the development of antibacterial agents[J]. Curr Med Chem, 2020, 27(25): 4194-4232. DOI:10.2174/0929867326666190119161551 |
| [6] |
ASKAR H, CHEN S L, HAO H F, et al. Immune evasion of Mycoplasma bovis[J]. Pathogens, 2021, 10(3): 297. DOI:10.3390/pathogens10030297 |
| [7] |
DUDEK K, NICHOLAS R A J, SZACAWA E, et al. Mycoplasma bovis infections-occurrence, diagnosis and control[J]. Pathogens, 2020, 9(8): 640. DOI:10.3390/pathogens9080640 |
| [8] |
DUDEK K, BEDNAREK D, AYLING R D, et al. Analysis of the immune response of calves to various saponin-based adjuvants for an experimental Mycoplasma bovis vaccine[J]. Acta Vet Hung, 2018, 66(2): 226-240. DOI:10.1556/004.2018.021 |
| [9] |
BOKMA J, VEREECKE N, NAUWYNCK H, et al. Genome-wide association study reveals genetic markers for antimicrobial resistance in Mycoplasma bovis[J]. Microbiol Spectr, 2021, 9(2): e26221. |
| [10] |
KINNEAR A, MCALLISTER T A, ZAHEER R, et al. Investigation of macrolide resistance genotypes in Mycoplasma bovis isolates from Canadian feedlot cattle[J]. Pathogens, 2020, 9(8): 622. DOI:10.3390/pathogens9080622 |
| [11] |
LYSNYANSKY I, AYLING R D. Mycoplasma bovis: mechanisms of resistance and trends in antimicrobial susceptibility[J]. Front Microbiol, 2016, 7: 595. |
| [12] |
SIRITHANAKORN C, CRONAN J E. Biotin, a universal and essential cofactor: synthesis, ligation and regulation[J]. FEMS Microbiol Rev, 2021, 45(4): fuab003. |
| [13] |
LAMBRAKI I A, MAJOWICZ S E, PARMLEY E J, et al. Building social-ecological system resilience to tackle antimicrobial resistance across the one health spectrum: protocol for a mixed methods study[J]. JMIR Res Protoc, 2021, 10(6): e24378. DOI:10.2196/24378 |
| [14] |
WERNLI D, JØRGENSEN P S, PARMLEY E J, et al. Evidence for action: a one health learning platform on interventions to tackle antimicrobial resistance[J]. Lancet Infect Dis, 2020, 20(12): e307-e311. DOI:10.1016/S1473-3099(20)30392-3 |
| [15] |
BAO Z H, QI X F, HONG S, et al. Structure and mechanism of a group-Ⅰ cobalt energy coupling factor transporter[J]. Cell Res, 2017, 27(5): 675-687. DOI:10.1038/cr.2017.38 |
| [16] |
WANG T L, FU G B, PAN X J, et al. Structure of a bacterial energy-coupling factor transporter[J]. Nature, 2013, 497(7448): 272-276. DOI:10.1038/nature12045 |
| [17] |
MAJSNEROWSKA M, HÄNELT I, WUNNICKE D, et al. Substrate-induced conformational changes in the S-component ThiT from an energy coupling factor transporter[J]. Structure, 2013, 21(5): 861-867. DOI:10.1016/j.str.2013.03.007 |
| [18] |
THANGARATNARAJAH C, RHEINBERGER J, PAULINO C, et al. Insights into the bilayer-mediated toppling mechanism of a folate-specific ECF transporter by cryo-EM[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2021, 118(34): e2105014118. DOI:10.1073/pnas.2105014118 |
| [19] |
ZHANG P, WANG J W, SHI Y G. Structure and mechanism of the S component of a bacterial ECF transporter[J]. Nature, 2010, 468(7324): 717-720. DOI:10.1038/nature09488 |
| [20] |
YE H Y, CAI M Z, ZHANG H M, et al. Functional definition of BirA suggests a biotin utilization pathway in the zoonotic pathogen Streptococcus suis[J]. Sci Rep, 2016, 6: 26479. DOI:10.1038/srep26479 |
| [21] |
ZHANG H M, WANG Q J, FISHER D J, et al. Deciphering a unique biotin scavenging pathway with redundant genes in the probiotic bacterium Lactococcus lactis[J]. Sci Rep, 2016, 6: 25680. DOI:10.1038/srep25680 |
| [22] |
HEBBELN P, RODIONOV D A, ALFANDEGA A, et al. Biotin uptake in prokaryotes by solute transporters with an optional ATP-binding cassette-containing module[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(8): 2909-2914. DOI:10.1073/pnas.0609905104 |
| [23] |
SHI Y, ZANG N, LOU N J, et al. Structure and mechanism for streptococcal fatty acid kinase (Fak) system dedicated to host fatty acid scavenging[J]. Sci Adv, 2022, 8(35): eabq3944. DOI:10.1126/sciadv.abq3944 |
| [24] |
XU Y C, YANG J, LI W H, et al. Three enigmatic BioH isoenzymes are programmed in the early stage of mycobacterial biotin synthesis, an attractive anti-TB drug target[J]. PLoS Pathog, 2022, 18(7): e1010615. DOI:10.1371/journal.ppat.1010615 |
| [25] |
DEVI K R, LEE L J, YAN L T, et al. Occupational exposure and challenges in tackling M. bovis at human-animal interface: a narrative review[J]. Int Arch Occup Environ Health, 2021, 94(6): 1147-1171. DOI:10.1007/s00420-021-01677-z |
| [26] |
SALGADU A, FIRESTONE S M, WATT A, et al. Evaluation of the MilA ELISA for the diagnosis of herd infection with Mycoplasma bovis using bulk tank milk and estimation of the prevalence of M. bovis in Australia[J]. Vet Microbiol, 2022, 270: 109454. DOI:10.1016/j.vetmic.2022.109454 |
| [27] |
XU Q Y, PAN Q, WU Q, et al. Mycoplasma bovis adhesins and their target proteins[J]. Front Immunol, 2022, 13: 1016641. DOI:10.3389/fimmu.2022.1016641 |
| [28] |
GELGIE A E, KORSA M G, DEGO O K. Mycoplasma bovis mastitis[J]. Curr Res Microb Sci, 2022, 3: 100123. |
| [29] |
PEREZ-CASAL J. Pathogenesis and virulence of Mycoplasma bovis[J]. Vet Clin North Am Food Anim Pract, 2020, 36(2): 269-278. DOI:10.1016/j.cvfa.2020.02.002 |
(编辑 白永平)