2. 安徽省动物疫病预防与控制中心, 合肥 230091;
3. 安徽省农业科学院畜牧兽医研究所, 合肥 230031
, YIN Dongdong3, SHAO Ying1, SONG Xiangjun1, WANG Zhenyu1, PAN Xiaocheng3, TU Jian1, HE Changsheng2, ZHU Liangqiang2
, QI Kezong1
2. Anhui Animal Disease Prevention and Control Center, Hefei 230091, China;
3. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230031, China
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的接触性传染病[1]。PED于1971年首次在英国报道，随后在整个欧洲流行[2]。2010年前，PED在我国区域性流行，但在2010年10月以后，PED在我国南方开始大规模流行，并很快在全国各地流行，严重损害了我国的养猪业健康发展[3-4]。
PEDV属于冠状病毒属成员，为单链正义RNA，基因组全长约为28 kb，包含5′、3′端非编码区、ORF1a、ORF1b、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6等非结构蛋白及S、M、E和N等结构蛋白[5]。其中，N基因在不同的PEDV毒株之间高度保守，可以作为PEDV感染诊断的靶标[4]。
目前，通常采用病毒分离、定量实时PCR、环介导等温扩增和ELISA等方法来检测猪是否感染PEDV[6-7]，但这些方法操作相对复杂，工作量较大。因此，需要一种新的技术方案来解决上述问题。研究发现，CRISPR/Cas13a在特异性crRNA的引导下切割目标RNA后，其“附属切割”活性被激活，可高效切割体系中非特异单链RNA[8-9]。基于这一原理，通过设计两端标记荧光基团的RNA探针，可使CRISPR/Cas13对RNA模板的检测和信号放大，实现对目标分子的特异性检测。重组酶辅助扩增(recombinase aided amplification, RAA) 技术是一种恒温快速扩增核酸的技术。该技术在37~42 ℃等温条件下可短时间内对模板进行指数级扩增，但常规RAA需要琼脂糖凝胶电泳，结果判读复杂[10]。基于CRISPR/cas13a技术的检测方法已被应用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)、埃博拉病毒(Ebola virus, EBOV)及登革热病毒(dengu evirus, DENV)等病毒[11-13]。因此，本研究将CRISPR/Cas13a与RAA技术相结合，针对PEDV N基因设计特异性引物和探针，建立操作简单，特异性强，灵敏度高的PEDV检测方法，以期为PED的防控提供技术支持。
1 材料与方法 1.1 毒株与临床样本猪圆环病毒1型(porcine circovirus type 1, PCV1)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)、猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3, PCV3)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)及伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)等阳性病料均由作者所在实验室保存。40份腹泻哺乳仔猪肠道和肛门拭子样品由第三方检测机构收集并提供。
1.2 主要试剂病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；LwCas13a和RAA检测试剂盒购自安徽微分基因科技有限公司；HiScribe T7 Quick High Yield RNA合成试剂盒、T7 RNA聚合酶及RNase酶抑制剂购自NEB公司；NucawayTM离心柱购自Invitrogen公司；RNAXP磁珠购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
1.3 引物设计与合成N基因长度为1 326 bp，其在不同的PEDV毒株之间高度保守，根据GenBank公布的PEDV毒株N基因序列(登录号：KU646831、JN173276、MK584552、KM089829、MZ364314、JX647847、ON571549、MN759311、ON649885、MH726391)，参照RAA引物设计原则，设计N基因特异性RAA引物见表 1(单下划线为T7启动子序列)。此外，根据Cas13a蛋白crRNA识别靶序列的特性，在PEDV的N基因序列上设计3对特异性的crRNA探针(PEDV-crRNA1-3)，引物序列如表 1所示(双下划线为茎环结构序列)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
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表 1 PEDV crRNA引物序列 Table 1 PEDV crRNA primer sequences |
根据GenBank公布的PEDV AH2012/12株(登录号：KU646831)，由生工生物工程(上海)股份有限公司将N基因合成，并连接至载体pUC57，重组质粒分别命名为pUC-N，测序正确的重组质粒即为质粒标准品。将“1.3”中合成的两条PEDV-crRNA1-3的上、下游引物退火形成双链(终浓度为10 μmol ·L-1)，随后利用HiScribe T7 Quick High Yield RNA合成试剂盒进行体外转录，转录产物利用RNAXP磁珠进行纯化，-80 ℃保存备用。
1.5 RAA扩增参照RAA核酸检测试剂盒说明书配制反应体系(50 μL)：25 μL预混液，3 μL MgOAc，RAA上、下游引物(10 μmol ·L-1)各2 μL，1 μL待检样本cDNA或DNA，用RNase free H2O补至50 μL，将反应体系震荡离心，37 ℃孵育30 min，制备RAA产物。
1.6 CRISPR/Cas13a检测利用LwCas13a核酸酶(45 nmol ·L-1)，crRNA探针(22.5 nmol ·L-1)，FT-RNA报告分子(125 nmol ·L-1)，RNase inhibitor(0.25 μL)，dNTPs(1 mmol ·L-1)和T7聚合酶(0.4 μL)，检测缓冲液补充至9 μL，RAA扩增产物1 μL，在QuantStudioTM 6 Flex实时荧光定量PCR 37 ℃反应40 min，每间隔5 min收集荧光信号。
1.7 crRNA的筛选以pUC-N为模板，采用“1.5”和“1.6”中的检测方法，分别对3组crRNA进行筛选，通过扩增曲线的荧光值及起峰时间，选择最佳检测PEDV的crRNA探针。
1.8 灵敏度试验将pUC-N标准质粒稀释为1.0×108 ~ 1.0×100 copies ·μL-1等9个浓度。用已建立的RAA-Cas13a检测方法，以稀释后的各浓度阳性质粒为模板，通过扩增曲线确定该方法的灵敏度，同时设置RNase free H2O作为阴性对照，每组进行3次重复。
1.9 特异性试验选取PCV1、PCV2、PCV3、PRRSV、CSFV和PRV等病毒作为特异性检测对象，参照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书对上述病毒进行核酸提取。用已建立的RAA-Cas13a方法进行检测，同时设置阴性对照，分析该检测方法的特异性。
1.10 临床样本检测对40份临床腹泻哺乳仔猪肠道和肛门拭子样本进行检测，采用本研究建立的RAA-Cas13a检测方法和RT-qPCR检测方法[14]进行PEDV检测，并使用SPSS软件进行Kappa一致性检验，以评估该方法的临床实用性。
2 结果 2.1 crRNA的筛选将合成的N基因进行PCR验证，结果显示, 在目标大小处有特异性条带，经测序证实为PEDV N基因(图 1)。此外，由图 2A可知，RAA引物扩增产物检测峰图在222 bp处有单峰，表明引物特异性良好。通过建立的RAA-Cas13a方法比较和筛选已制备的3组PEDV-crRNA，结果如图 2B所示crRNA-2与其他2组相比，荧光值最高且起峰时间最短。因此，选择PEDV-crRNA-2用于后续试验。
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图 1 pUC-N质粒PCR扩增结果 Fig. 1 The results of PCR amplification of pUC-N plasmid |
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A. RAA引物扩增产物检测峰图；B. crRNA筛选结果 A. RAA primer amplification product detection peak; B. The screening result of crRNA 图 2 RAA引物验证及crRNA筛选 Fig. 2 The results of validation of RAA primers and crRNA screening |
RAA-Cas13a检测方法的灵敏度评价以9个梯度稀释(1.0×108 ~ 1.0×100 copies ·μL-1) 的标准质粒及RNase free H2O作为模板进行RAA-Cas13a方法的灵敏度评价。结果如图 3所示，在反应5 min时即可检测到1.0×101 copies ·μL-1的信号，表明本研究建立的RAA-Cas13a检测方法的检测限为101 copies ·μL-1。
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图 3 RAA-Cas13a灵敏度试验结果 Fig. 3 Sensitivity detection results of RAA-Cas13a |
RAA-Cas13a的分析特异性试验检测结果如图 4所示，仅PEDV出现扩增曲线，PCV1、PCV2、PCV3、PRRSV、CSFV、PRV及阴性对照均无检测信号，表明本研究建立的方法能特异性扩增检测出PEDV，而不与其他病毒核酸发生交叉反应，说明本检测方法特异性强。
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图 4 RAA-Cas13a特异性试验结果 Fig. 4 Specificity detection results of RAA-Cas13a |
RAA-Cas13a分别应用本试验建立的RAA-Cas13a方法和RT-qPCR方法，对临床上采集的40份样品进行检测。结果显示，RAA-Cas13a的阳性率为72.5%(29/40)，RT-qPCR方法的阳性率为67.5%(27/40)，阳性符合率为100%，阴性符合率为84.6%(表 2)，总一致性为95%，Kappa=0.881(Kappa≥0.75，表示可重复性极好)。
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表 2 RAA-Cas13a和RT-qPCR方法对临床样本中的PEDV检测结果 Table 2 Detection results of clinical samples in RAA-Cas13a and RT-qPCR assays |
PED是一种高度传染性的传染病，可引起哺乳仔猪的腹泻、呕吐和脱水等临床症状，有高致死率，给我国养猪业带来严重的经济损失[3, 15-16]。目前，PEDV的疫苗保护效果较差，甚至注射过疫苗都能感染。因此，建立高效、灵敏且特异性强的PEDV检测方法，对PEDV的流行病学调查和早期诊断具有重要意义。PEDV的实验室检测方法很多，但大多数检测方法需要专业操作或特殊设备，需要在专业实验室进行。CRISPR/Cas13a系统可以特异性切割目标RNA，且具有非特异性附带切割活性，基于该原理可在反应体系中加入非特异RNA报告探针，实现对靶基因的特异检测，这为CRISPR/Cas13a系统在核酸检测领域的应用提供了新思路[8, 17]。此外，RAA技术引物设计简单，扩增效率高，因此，本研究将RAA技术与CRISPR/Cas13a系统结合，实现了两种技术优势互补，提高检测系统性，增强特异性。
本研究建立的RAA-Cas13a检测方法的检测限达到101copies ·μL-1。Wang等[18]建立的实时荧光定量PCR方法仅能检测出300 copies ·μL-1的标准质粒；Liu等[6]开发的基于ORF3基因建立的TaqMan探针的荧光定量PCR的检测限为37 copies ·μL-1；翟刚等[19]基于M基因建立的TaqMan检测方法最低检测下限为1.09×101 copies ·μL-1；冉伟等[20]建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法，最低可检测102 copies ·μL-1的质粒。本研究建立的RAA-Cas13a检测法比上述方法的灵敏度更高。同时，该方法与其他6种猪源病原核酸没有交叉反应，表明建立的方法对PEDV具有强特异性。为了评估该技术在临床应用中的可靠性，计算了RAA-Cas13a检测与RT-qPCR的符合率，结果显示，40份疑似样品中，用RAA-Cas13a方法检测出29份阳性，RT-qPCR法检测出27份阳性，这27份阳性样品在RAA-Cas13a中的检测结果均为阳性，说明建立的RAA-Cas13a检测方法比RT-qPCR灵敏度更高。此外，RAA反应和CRSIRR/Cas13a检测均在37 ℃下进行，全部反应都可在一台便携的恒温荧光检测仪中完成，对硬件要求不高。
综上所述，本研究建立的PEDV RAA-Cas13a检测方法具有特异性强、灵敏度高、对实验室设备要求不高等优势，本研究结果可为PEDV检测提供一种新方法，为今后PED的诊断及流行病学调查提供技术支持。
4 结论本研究将RAA技术与CRISPR/Cas13a系统结合，建立了PEDV RAA-Cas13a检测方法，该方法特异性强、灵敏度高、对实验室设备要求不高、操作简单，可为PED的诊断及流行病学调查提供技术支持。
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(编辑 白永平)