2. 中华人民共和国晋阳海关, 太原 030027
2. Jinyang Customs of the People's Republic of China, Taiyuan 030027, China
在哺乳动物皮肤组织中，黑色素的数量及类型对毛色起重要作用[1]。同时，黑色素是动物皮肤组织的“遮阳伞”，保护动物机体皮肤免受太阳紫外线辐射引起的DNA损伤和突变[2]。胚胎时期的神经嵴细胞(neural crest cells, NCC)是黑色素前体细胞的起源，前体细胞经逐步分化、发育形成黑色素细胞，黑色素由黑色素细胞中的细胞器黑色素小体产生[3]。黑色素的合成及动物皮肤组织色素沉着受到多种遗传基因和发育途径的调控[4]。Wnt信号通路在神经嵴黑色素细胞的发育过程中具有重要作用，研究证实，增强Wnt1信号能够使具有内皮素3(endothelin 3，EDN3)依赖性的神经嵴黑色素细胞数量增加，增强神经嵴黑色素细胞的色素沉着[5]。Wnt3α通过经典通路在黑色素细胞的发育过程中起重要的调控作用，可以促进神经嵴细胞分化为黑色素细胞[6]，可显著增强酪氨酸蛋白激酶活性和黑色素的合成[7]，缺乏Wnt1和Wnt3α的突变小鼠几乎完全缺失神经嵴细胞起源的黑色素细胞[8]。小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor, MITF)是黑色素细胞发育、生存和发挥功能的重要调节因子，MITF基因缺失的小鼠表现出神经嵴来源的黑色素细胞丢失[9-10]。这些因子之间存在相互作用，Wnt3α通过作用于黑色素母细胞维持MITF的表达，从而促进黑色素母细胞分化形成黑色素细胞[11]，也可通过上调MITF的表达，增加酪氨酸酶活性，促进黑色素合成[6]。经典Wnt通路通过β-catenin的积累实现，因此也称作Wnt/β-catenin通路[12]，β-catenin与MITF的近端启动子存在相关性[13]，提示β-catenin在黑色素生成中发挥关键作用。
色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)是一种50 ku的分泌型糖蛋白，属于非抑制性丝氨酸家族[14]。研究证实，在人黑色素细胞中，存在PEDF的表达，且PEDF蛋白在健康皮肤组织的表达量最高，其次是色素痣，在黑色素瘤的表达量最低[15]；PEDF对黑色素细胞的过度增殖有抑制作用[16]。
虽然PEDF对黑色素细胞的生物学活性和黑色素的合成具有调控作用，但具体的调控机制尚不清楚，调控黑色素合成的关键因子与PEDF之间是否存在互作关系也尚不明确。因此，本研究选取小鼠黑色素细胞，探索PEDF与黑色素合成相关因子之间是否存在互作关系，以期探索PEDF对哺乳动物皮肤组织黑色素合成的调控作用。为进一步研究动物毛色形成提供基础，同时也为动物经济性状育种提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验动物选取出生1 d以内的野生型C57BL/6小鼠，雄性和雌性各3只，取下整块背部皮肤(经山西农业大学实验动物伦理委员会审批)，用于黑色素细胞的分离培养。
1.2 主要试剂RNA提取试剂盒(上海生工生物技术股份有限公司)，反转录试剂盒、荧光定量试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂PMSF(上海碧云天生物技术有限公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL显色液、DAPI试剂(中杉金桥生物技术有限公司)，siRNA(通用生物股份有限公司)；脂质体2000(Invitrogen公司)；腺病毒穿梭质粒pDC316-mCMV-EGFP(Stratagene)、腺病毒辅助质粒pBHGlox(delta)E1, 3Cre(Microbix)、DH5α感受态细胞(Thermo公司)。
多克隆兔抗PEDF抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，Wnt1和Wnt3α兔抗多克隆抗体、MITF、β-catenin和GAPDH兔抗单克隆抗体(Abcam)、HRP-驴抗兔IgG(北京索莱宝科技有限公司)，驴抗兔Alexa Fluor TM Plus 594荧光二抗(Thermo公司)。
1.3 小鼠黑色素细胞的分离培养分别取小鼠整块背部皮肤，置入含双抗的PBS中，0.25%的Dispase Ⅱ酶4 ℃过夜消化。分离表皮与真皮，将表皮剪碎置于0.25%的胰蛋白酶中37 ℃水浴消化。加终止液终止消化，过滤并离心。弃上清，加入DMEM培养基，部分进行细胞计数。剩余部分置入6孔培养板中37 ℃ 5% CO2培养1 h，更换黑色素细胞专用培养基。培养至小鼠黑色素细胞的细胞密度达到90%左右时，0.25%胰蛋白酶消化液37 ℃消化，终止。离心弃上清，加入RPMI-1640培养基重悬培养。
1.4 siRNA的合成与转染黑色素细胞根据GenBank中已登录的小鼠PEDF mRNA序列(NM_011340.3)，参考siRNA设计原则，设计合成3对siRNA及阴性对照。用于PEDF基因沉默的siRNA由通用生物技术有限公司通过常规化学合成，详细的序列信息见表 1。黑色素细胞生长到占六孔板面积60%~80%，进行转染。设置阴性对照组(negative control, NC)、PEDF-siRNA组(包括PEDF-siRNA1、PEDF-siRNA2、PEDF-siRNA3)。首先，制备NC、siRNA稀释液：用100 μL不含血清双抗的培养基分别稀释NC、PEDF-siRNA1、PEDF-siRNA2、PEDF-siRNA3，终浓度为100 nmol·L-1。其次，制备转染试剂：用100 μL不含血清双抗的培养基稀释2 μL脂质体2000转染试剂，混匀，常温静置5 min。最后，将转染试剂与NC、siRNA稀释液混匀，室温静置20 min。将转染复合物加入6孔板中，200 μL·孔-1，前后轻摇细胞板混合均匀，细胞板置于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养48 h，提取总蛋白和RNA进行测定。
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表 1 PEDF-siRNA序列 Table 1 PEDF-siRNA sequences |
提取小鼠黑色素细胞RNA，反转录合成cDNA，根据GenBank中已登录的小鼠PEDF mRNA序列(NM_011340.3)，设计合成一对PEDF特异性引物，引物序列为F：5′-ATGCAGGCCCTGGTGCTACT-3′；R：5′-TTAAGTACTACTGGGGTCCA-3′。以小鼠黑色素细胞cDNA为模板扩增获得PEDF cDNA片段，将该片段亚克隆于质粒pDC316-EGFP-cmv中，获得重组的腺病毒穿梭质粒：pDC316-EGFP-cmv-PEDF。通过双酶切的方式对重组质粒进行鉴定，鉴定正确后共转染：通过脂质体2000，将重组腺病毒穿梭质粒pDC316-EGFP-cmv-PEDF与腺病毒辅助质粒pBHGlox(delta)E1, 3Cre，共转染至DH5α感受态细胞。在DH5α感受态细胞中，两质粒发生同源重组，即可获得重组腺病毒rAd-PEDF。制备高滴度病毒液，TCID50法测定病毒滴度，将病毒滴度调整为1012 copies·mL-1。取5×106个状态良好的对数生长期黑色素细胞悬液，1 000 r·min-1离心4 min。将细胞沉淀悬浮于210 μL DPBS，并转移至1.5 mL EP管中，分别加入空载病毒(overexpression control, OE-con)、PEDF基因过表达腺病毒(overexpression PEDF, OE-PEDF)，轻轻混匀。转移至电击杯中，确定电击杯中溶液无气泡，且液面凸起后，盖上电击杯盖并置于电转仪，设定好电转条件后进行电转。待显示峰图正常后取出细胞液转移至六孔板培养基中。细胞板置于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养48 h，提取总蛋白和RNA进行测定。
1.6 黑色素细胞活力和黑色素含量检测MTT法检测每组黑色素细胞活力；每组黑色素细胞用0.25%胰酶消化后收集，PBS冲洗2~3次，细胞计数后，用0.2 mol·L-1 NaOH溶解黑色素细胞，使用475 nm波长的分光光度计检测黑色素含量，每组重复3次。
1.7 RNA的提取和qRT-PCR检测参照NCBI小鼠PEDF、GAPDH、Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin基因序列，利用primer premier 5.0软件设计PCR扩增引物，送北京华大基因公司合成。引物序列见表 2。参照RNA提取试剂盒说明书提取黑色素细胞的总RNA，测定浓度，参照反转录试剂盒说明书合成cDNA。反转录体系包括(20 μL)：Total RNA 500 ng、Random Primer 1 μL，2×ES reaction Mix 10 μL，EasyScript Ⓡ RT/RI Enzyme Mix 1 μL，gDNA Remover 1 μL，加入无RNase-free Water至20 μL后，25 ℃孵育10 min, 42 ℃孵育15 min, 85 ℃孵育5 s。
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表 2 本试验中所用的引物 Table 2 Primers used in the test |
以沉默和过表达PEDF后小鼠黑色素细胞cDNA为模板，检测PEDF、Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin mRNA水平的表达情况。按照SYBR Premix Ex Tap TMⅡ试剂盒说明书进行qRT-PCR，通过2-ΔΔCt法计算目的mRNA相对表达量。
1.8 蛋白表达水平检测根据蛋白提取试剂盒说明书提取黑色素细胞的总蛋白，使用BCA检测试剂盒检测蛋白浓度。制备目的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束，转移至PVDF膜上。PVDF膜经5%脱脂奶粉室温封闭2 h；加入PEDF、Wnt1、Wnt3α、MITF、β-catenin和内参GAPDH(1:3 000稀释)一抗4 ℃过夜孵育；次日取出PVDF膜，用TBST清洗3×10 min，分别加入1:3000稀释的驴抗兔IgG-HRP，37 ℃孵育1 h，TBST反复清洗6×5 min，使用ECL试剂盒显色，并使用ChemiDOC XRS+成像仪扫描膜。使用Image-Pro Plus软件对目的蛋白和GAPDH免疫印迹结果进行分析。蛋白含量=条带面积×平均灰度；目的蛋白半定量值=目的蛋白含量/GAPDH蛋白含量。
1.9 细胞免疫荧光(IF)检测将各组小鼠黑色素细胞去除培养基，PBS漂洗3×5 min，4%的甲醛固定15 min。丢弃固定液，PBS漂洗3×5 min。封闭液封闭1 h，按照1:200的比例稀释一抗(PEDF、Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin)，4 ℃孵育过夜。PBS漂洗3×5 min。1:500的比例稀释驴抗兔Alexa Fluor TM Plus 594荧光二抗，室温避光孵育1 h，PBS漂洗3×10 min，滴加DAPI，激光共聚焦显微镜观察并拍照。
1.10 数据分析所有数据均用SPSS19.0软件进行单因素方差分析，所有结果均用“x±s”表示，所有柱形图均用GraphPad Prism TM (GraphPad Software, Inc. California, USA)处理。
2 结果 2.1 siRNA对PEDF表达的影响与NC组相比，3组PEDF-siRNA组PEDF表达量均极显著(P < 0.001)下降，其中PEDF-siRNA 2的沉默效率最佳，因此选择PEDF-siRNA 2进行后续试验(图 1)。
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CON.空白对照组；NC.阴性对照组；***. P < 0.001 CON. Blank control; NC. Negative control; ***. P < 0.001 图 1 PEDF mRNA的相对表达量 Fig. 1 The relative expression quantity of PEDF mRNA |
电转染结果表明，在540 V(30 ms，1pulse)条件下，PEDF过表达载体组荧光强度明显高于空载组，故在后续PEDF过表达载体转染黑色素细胞试验中选择540 V(30 ms，1pulse)条件下转染(图 2)。
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Control组为正常培养的黑色素细胞；OE-con组为转染空载体的黑色素细胞；OE-PEDF为转染PEDF过表达载体的黑色素细胞。标尺=25 μm The Control group. Normal melanocytes; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector; OE-PEDF. The melanocytes transfected with PEDF overexpression vector. Bar=25 μm 图 2 PEDF过表达载体转染黑色素细胞的效率 Fig. 2 The efficiency of transfected melanocytes with PEDF overexpression vector |
检测沉默及过表达PEDF后小鼠黑色素细胞的细胞活力，结果显示：PEDF-siRNA转染小鼠黑色素细胞后，黑色素细胞活力极显著(P < 0.001)高于NC组；OE-PEDF组黑色素细胞活力极显著(P < 0.001)低于OE-con组，在PEDF高表达的情况下，黑色素细胞活力受到显著抑制(图 3)。
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NC.阴性对照组；OE-con.转染空载体的黑色素细胞；***. P < 0.001 NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector. ***. P < 0.001 图 3 沉默和过表达PEDF对黑色素细胞活力的影响 Fig. 3 Effect of silencing and overexpression of PEDF on melanocyte activity |
测定沉默及过表达PEDF后黑色素细胞中的黑色素含量，结果显示：siRNA-PEDF组黑色素含量极显著(P < 0.001)高于NC组；OE-PEDF组黑色素含量极显著(P < 0.01)低于OE-con组。PEDF基因表达情况与黑色素含量的关系说明：PEDF对黑色素合成存在抑制作用(图 4)。
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NC.阴性对照组；OE-con.转染空载体的黑色素细胞；***. P < 0.001；**. P < 0.01 NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector. ***. P < 0.001; **. P < 0.01 图 4 沉默及过表达PEDF对黑色素细胞黑色素合成的影响 Fig. 4 Effect of silencing and overexpression of PEDF on melanin synthesis in melanocytes |
qRT-PCR检测沉默及过表达PEDF后黑色素细胞中PEDF及相关基因Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表达情况，结果显示：沉默PEDF基因后，黑色素细胞中PEDF mRNA的表达量是NC组的47%，极显著(P < 0.001)低于NC组，进一步说明用于基因沉默的siRNA构建成功(图 5A)；Wnt1 mRNA表达量是NC组的2.29倍，极显著(P < 0.001)高于NC组(图 5B)；Wnt3α mRNA表达量是NC组的1.11倍，极显著(P < 0.001)高于NC组(图 5C)；MITF mRNA表达量是NC组的1.11倍，极显著(P < 0.001)高于NC组(图 5D)；β-catenin mRNA表达量是NC组的1.79倍，极显著(P < 0.001)高于NC组(图 5E)。说明在RNA水平上，PEDF负调控Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表达。
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NC.阴性对照组；OE-con.转染空载体的黑色素细胞；A. PEDF基因表达量分析；B. Wnt1基因表达量分析；C. Wnt3α基因表达量分析D. MITF基因表达量分析；E. β-catenin基因表达量分析。***. P < 0.001 NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector. A. PEDF gene expression analysis; B. Wnt1 gene expression analysis; C. Wnt3α gene expression analysis; D. MITF gene expression analysis; E. β-catenin gene expression analysis. ***. P < 0.001 图 5 相关基因的qRT-PCR检测 Fig. 5 qRT-PCR detection of related genes |
PEDF基因过表达后，黑色素细胞中PEDF mRNA的表达量极显著(P < 0.001)高于OE-con组，是OE-con组的1.5倍(图 5A)；Wnt1 mRNA表达量极显著(P < 0.001)低于OE-con组，是OE-con组的42%(图 5B)；Wnt3α mRNA表达量极显著(P < 0.001)低于OE-con组，是OE-con组的79%(图 5C)；MITF mRNA表达量极显著(P < 0.001)低于OE-con组，是OE-con组的78%(图 5D)；β-catenin mRNA表达量极显著(P < 0.001)低于OE-con组，是OE-con组的57%(图 5E)。说明在RNA水平上，PEDF负调控Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表达。PEDF沉默和过表达后相关基因的表达情况相符，均说明PEDF负调控Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表达。
2.6 沉默及过表达PEDF后相关蛋白表达水平检测试验结果显示(图 6)：沉默及过表达PEDF后PEDF、Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的蛋白表达变化趋势与mRNA表达变化趋势基本一致。
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NC.阴性对照组；OE-con.转染空载体的黑色素细胞 NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector 图 6 沉默及过表达PEDF后黑色素细胞内相关蛋白表达水平检测 Fig. 6 Detection of related protein expression levels in melanocytes after PEDF silencing and overexpression |
对Western blotting结果进行灰度值分析可知：沉默PEDF基因后，黑色素细胞中PEDF蛋白的表达量极显著(P < 0.001)低于NC组，是NC组的50%(图 7A)；Wnt1蛋白表达量极显著(P < 0.001)高于NC组，是NC组的2.38倍(图 7B)；Wnt3α蛋白表达量极显著(P < 0.001)高于NC组，是NC组的2.50倍(图 7C)；MITF蛋白表达量极显著(P < 0.001)高于NC组，是NC组的4.67倍(图 7D)；β-catenin蛋白表达量极显著(P < 0.001)高于NC组，是NC组的1.99倍(图 7E)。PEDF基因过表达后，黑色素细胞中PEDF蛋白的表达量极显著(P < 0.01)高于OE-con组，是OE-con组的1.30倍，与mRNA表达情况一致(图 7A)；Wnt1蛋白表达量极显著(P < 0.001)低于OE-con组，是OE-con组的69%(图 7B)；Wnt3α蛋白表达量极显著(P < 0.001)低于OE-con组，是OE-con组的24%(图 7C)；MITF蛋白表达量极显著(P < 0.001)低于OE-con组，是OE-con组的56%(图 7D)；β-catenin蛋白表达量显著(P < 0.05)低于OE-con组，是OE-con组的82%(图 7E)。PEDF沉默和过表达后相关蛋白的表达情况与mRNA表达情况相符，均说明PEDF负调控Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表达。
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NC.阴性对照组；OE-con.转染空载体的黑色素细胞；A. PEDF蛋白表达量分析；B. Wnt1蛋白表达量分析；C. Wnt3α蛋白表达量分析；D. MITF蛋白表达量分析；E. β-catenin蛋白表达量分析。***. P < 0.001；**. P < 0.01；*. P < 0.05 NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector; A. PEDF protein expression analysis; B. Wnt1 protein expression analysis; C. Wnt3α protein expression analysis; D. MITF protein expression analysis; E. β-catenin protein expression analysis. ***. P < 0.001;;**. P < 0.01; *. P < 0.05 图 7 相关蛋白表达水平检测 Fig. 7 The expression levels of related proteins |
沉默及过表达PEDF后，细胞免疫荧光法检测黑色素细胞内PEDF、Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表达及定位，结果显示PEDF表达于黑色素细胞的细胞质(图 8A)；黑色素细胞沉默PEDF后，PEDF荧光强度极显著(P < 0.001)低于NC组(图 8B)；过表达PEDF后，黑色素细胞内PEDF荧光强度极显著(P < 0.001)高于OE-con组(图 8B)。Wnt1表达于黑色素细胞的细胞质(图 9A)；黑色素细胞沉默PEDF后，Wnt1荧光强度与NC组相比无显著差异(图 9B)；过表达PEDF后，Wnt1荧光强度极显著(P < 0.01)低于OE-con组(图 9B)。Wnt3α表达于黑色素细胞的细胞质和细胞膜(图 10A)；黑色素细胞沉默PEDF后，Wnt3α荧光强度极显著(P < 0.001)高于NC组(图 10B)；过表达PEDF后，Wnt3α荧光强度极显著(P < 0.01)低于OE-con组(图 10B)。MITF表达于黑色素细胞的细胞质(图 11A)；黑色素细胞沉默PEDF后，MITF荧光强度极显著(P < 0.001)高于NC组(图 11B)；过表达PEDF后，MITF荧光强度极显著(P < 0.001)低于OE-con组(图 11B)。β-catenin表达于黑色素细胞的细胞质(图 12A)；黑色素细胞沉默PEDF后，β-catenin荧光强度极显著(P < 0.001)高于NC组(图 12B)；过表达PEDF后，β-catenin荧光强度极显著(P < 0.001)低于OE-con组(图 12B)。
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NC.阴性对照组；OE-con.转染空载体的黑色素细胞；A. 细胞免疫荧光技术检测沉默及过表达PEDF后黑色素细胞中PEDF的表达与定位；B. 沉默及过表达PEDF后黑色素细胞中PEDF的光密度值分析。CP.细胞质；PEDF在黑色素细胞胞质中表达，圆圈代表阳性表达，圆圈个数越多，阳性表达越强；标尺=25 μm。***. P < 0.001 NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector; A. The expression and localization of PEDF in melanocytes after PEDF silencing and overexpression were detected by cellular immunofluorescence; B. Optical density analysis of PEDF in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF. CP. Cytoplasm; PEDF was expressed in the cytoplasm of melanocytes, circles represent positive expression, and the more circles, the stronger the positive expression; Scale =25 μm. ***. P < 0.001 图 8 沉默及过表达PEDF后黑色素细胞中PEDF的表达与定位 Fig. 8 Expression and localization of PEDF in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF |
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NC.阴性对照组；OE-con.转染空载体的黑色素细胞；A. 细胞免疫荧光技术检测沉默及过表达PEDF后黑色素细胞中Wnt1的表达与定位；B. 沉默及过表达PEDF后黑色素细胞中Wnt1的光密度值分析。CP.细胞质；Wnt1在黑色素细胞胞质中表达，圆圈代表阳性表达，圆圈数越多，阳性表达越强；标尺=25 μm。**. P < 0.01 NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector; A. The expression and localization of Wnt1 in melanocytes after PEDF silencing and overexpression were detected by cellular immunofluorescence; B. Optical density analysis of Wnt1 in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF. CP. Cytoplasm; Wnt1 was expressed in the cytoplasm of melanocytes, circles represent positive expression, and the more circles, the stronger the positive expression; Scale =25 μm. **. P < 0.01 图 9 沉默及过表达PEDF后黑色素细胞中Wnt1的表达与定位 Fig. 9 Expression and localization of Wnt1 in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF |
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NC.阴性对照组；OE-con.转染空载体的黑色素细胞；A. 细胞免疫荧光技术检测沉默及过表达PEDF后黑色素细胞中Wnt3α的表达与定位；B. 沉默及过表达PEDF后黑色素细胞中Wnt3α的光密度值分析。CP.细胞质；PM.细胞膜；Wnt3α在黑色素细胞细胞质和细胞膜表达，圆圈代表阳性表达，圆圈数越多，阳性表达越强；标尺=25 μm。***. P < 0.001；**. P < 0.01 NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector; A. The expression and localization of Wnt3α in melanocytes after PEDF silencing and overexpression were detected by cellular immunofluorescence; B. Optical density analysis of Wnt3α in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF. CP. Cytoplasm; PM. Cell membrane; Wnt3α was expressed in the cytoplasm and cell membrane of melanocytes, circles represent positive expression, and the more circles, the stronger the positive expression; Scale =25 μm. ***. P < 0.001; **. P < 0.01 图 10 沉默及过表达PEDF后黑色素细胞中Wnt3α的表达与定位 Fig. 10 Expression and localization of Wnt3α in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF |
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NC.阴性对照组；OE-con.转染空载体的黑色素细胞；A. 细胞免疫荧光技术检测沉默及过表达PEDF后黑色素细胞中MITF的表达与定位；B. 沉默及过表达PEDF后黑色素细胞中MITF的光密度值分析。CP.细胞质，MITF在黑色素细胞细胞质表达，圆圈代表阳性表达，圆圈数越多，阳性表达越强。标尺=25 μm。***. P < 0.001 NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector; A. The expression and localization of MITF in melanocytes after PEDF silencing and overexpression were detected by cellular immunofluorescence; B. Optical density analysis of MITF in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF. CP. Cytoplasm, MITF was expressed in the cytoplasm of melanocytes, circles represent positive expression, and the more circles, the stronger the positive expression. Scale =25 μm. ***. P < 0.001 图 11 沉默及过表达PEDF后黑色素细胞中MITF的表达与定位 Fig. 11 Expression and localization of MITF in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF |
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NC.阴性对照组；OE-con.转染空载体的黑色素细胞；A. 细胞免疫荧光技术检测沉默及过表达PEDF后黑色素细胞中β-catenin的表达与定位；B. 沉默及过表达PEDF后黑色素细胞中β-catenin的光密度值分析。CP.细胞质；β-catenin在黑色素细胞胞质中表达，圆圈代表阳性表达，圆圈数越多，阳性表达越强；标尺=25 μm。***. P < 0.001 NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector; A. The expression and localization of β-catenin in melanocytes after PEDF silencing and overexpression were detected by cellular immunofluorescence; B. Optical density analysis of β-catenin in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF. CP. Cytoplasm; β-catenin was expressed in the cytoplasm of melanocytes, circles represent positive expression, and the more circles, the stronger the positive expression; Scale =25 μm. ***. P < 0.001 图 12 沉默及过表达PEDF后黑色素细胞中β-catenin的表达与定位 Fig. 12 Expression and localization of β-catenin in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF |
该结果与mRNA和蛋白水平结果趋势相符，均证明在黑色素合成过程中，PEDF对促进黑色素合成的相关基因Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin具有负调控作用。
3 讨论哺乳动物毛色多样性的遗传与分子机制长期受到关注。一种发现于黑色素瘤的黑色素生成调控因子PEDF如何调控色素形成，其机制尚不清楚。本研究成功分离培养小鼠黑色素细胞，发现PEDF表达和定位于小鼠黑色素细胞；通过沉默小鼠黑色素细胞PEDF，发现黑色素细胞的活力和黑色素生成升高，黑色素生成正调控因子Wnt1、Wnt3α、MITF、β-catenin mRNA和蛋白表达水平上调；小鼠黑色素细胞过表达PEDF致黑色素细胞的活力减弱，黑色素生成减少，色素生成正调控因子Wnt1、Wnt3α、MITF、β-catenin mRNA和蛋白表达水平下降。qRT-PCR结果与Western blotting、细胞免疫荧光结果趋势一致。
黑色素细胞和胚胎视网膜色素上皮细胞均来源于神经嵴细胞[15, 17]，且胚胎色素上皮细胞可产生PEDF[17]，推测黑色素细胞也可能产生PEDF。本研究显示黑色素细胞中存在PEDF的表达，且PEDF的表达与黑色素的合成存在关联。研究报道，PEDF在黑色素瘤中表达缺失或下调[14]，认为PEDF对黑色素瘤细胞施加了抗增殖作用，诱导黑色素瘤细胞凋亡[18]，本试验结果与之相符，在PEDF表达下降时，黑色素细胞活力提高，PEDF高表达的情况下，黑色素细胞活力受到显著抑制，提示PEDF对黑色素细胞活力有抑制作用，PEDF抑制黑色素细胞增殖或迁移。
先前研究发现，PEDF在健康的皮肤中高度表达，在色素痣中的表达水平低于在健康皮肤中，在黑色素瘤细胞中的表达量最低，PEDF的表达量与黑色素合成量成反比[15]，结合本试验结果中PEDF表达情况与黑色素含量的关系，提示PEDF对黑色素合成存在抑制作用。
Wnt信号在黑色素细胞发育中起着关键作用，通过KEGG信号通路生物信息学分析提示，PEDF对Wnt信号通路具有调控作用，且与Wnt通路抑制剂Dickkopf等类似，调控位点位于Wnt家族与Frizzled受体结合域之间，提示PEDF可能通过抑制Wnt与受体的结合来抑制Wnt信号通路功能的发挥。因此，检测沉默和过表达PEDF后Wnt通路中黑色素合成相关基因的表达情况，可以明确PEDF与调控黑色素合成的候选基因之间的互作关系，推测PEDF在Wnt通路中的位置，以及对黑色素合成的调控机制。Wnt1和Wnt3α是激活Wnt经典通路的重要成员[19]；在Wnt1和Wnt3α表达缺失的胚胎中，黑色素母细胞明显缺乏[8]；Wnt1和Wnt3α促进神经嵴细胞向黑色素细胞的发育[11]；Wnt1向成黑素细胞发出信号以增加黑色素细胞的数量。Wnt3α蛋白与受体的结合可以提高β-catenin的稳定性，β-catenin进入细胞核后调节MITF的转录[20-21]，上调MITF及其下游基因促进黑色素合成[7]，相反，抑制Wnt/β-catenin信号通路能够强烈抑制黑色素合成[22-23]；先前研究发现，在肝中，PEDF对Wnt/β-catenin信号存在抑制[24]。本研究发现小鼠黑色素细胞沉默PEDF导致Wnt下游分子β-catenin、MITF的表达上调，解除了PEDF对Wnt信号的抑制，黑色素细胞活力和黑色素合成增加。小鼠黑色素细胞过表达PEDF导致Wnt下游分子β-catenin、MITF的表达下降，加剧了PEDF对Wnt信号的抑制，黑色素细胞活力和黑色素合成减少。PEDF与Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表达负相关，提示PEDF在Wnt信号通路中位于以上4种基因的上游，下调Wnt信号通路中促进黑色素合成因子的表达，抑制Wnt信号通路，从而抑制黑色素的合成。
本研究初步阐释了PEDF与黑色素生成调节因子之间的互作关系，为进一步明确PEDF在黑色素合成过程中的调控机制提供了基础；丰富了色素生产调控的分子机制，以期为人工调控动物毛色和肤色的深浅提供借鉴。
4 结论本研究发现，色素上皮衍生因子对小鼠黑色素细胞活力存在抑制作用，通过抑制Wnt信号通路中Wnt1、Wnt3α、MITF、β-catenin的表达，从而减少黑色素的合成。
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(编辑 白永平)