2. 新疆医科大学 药学院, 乌鲁木齐 830017;
3. 新疆大蒜药用研究重点实验室, 乌鲁木齐 830013
, FANG Ci1, HUANG Jinhu1, WANG Xiaoming1, XIAO Wenjun2,3, LIU Ruiting2,3, SHI Rongmei2,3, WANG Liping1
2. College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi 830017, China;
3. Key Laboratory of Garlic Medicinal Research in Xinjiang, Urumuqi 830013, China
细胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP450)是由CYP450基因编码的重要代谢酶，广泛存在于所有生命体。CYP450在人和动物机体肝组织中含量最高，主要参与内源性和外源性化合物的Ⅰ相代谢过程。研究已证实有些外源化合物，包括一些临床常用的药物是CYP450酶的诱导剂或抑制剂[1]。因此，当这些药物与CYP450底物联用时，会因改变药物药代动力学过程导致药物临床疗效改变, 也可因代谢减少或毒性代谢物生成增多而增加药物毒性，产生不良的药物-药物间相互作用(drug-drug interaction，DDI)[2-3]。基于此，美国FDA明确要求在新药研究时增加药物对CYP450影响的研究，以避免药物间相互作用引起的临床不良反应。目前已报道CYP家族成员主要有CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6和CYP2E1等，其中CYP1A2是CYP450家族的重要成员之一，可以代谢机体约10%的药物[4]。兽医临床常用药物如喹诺酮类药物、灰黄霉素等以及动物饲料中存在的前致癌物黄曲霉毒素均是CYP1A2的底物或抑制剂[5]。因此，若动物机体的CYP1A2活性改变，则有可能导致兽医临床药物疗效下降或者外源性毒性化合物在体内的代谢过程发生改变，进而对机体产生不良影响，故研究外源性化合物对动物机体CYP1A2的影响具有重要的临床意义。
为应对细菌耐药问题，世界卫生组织及各国家均鼓励研发抗生素替代品用作动物饲料添加剂用于预防细菌感染，以减少抗菌药在畜牧养殖中的应用，故筛选和开发抗生素替代品也成为全球研究热点。大蒜(garlic)是药食同源性草本植物，大蒜碾碎时液泡中的蒜氨酸(alliin)和胞质中的蒜酶(allinase)发生催化裂解反应后产生的大蒜辣素(allicin)，被认为是天然大蒜中含量最高、最重要的活性成分[6]。已有研究表明大蒜辣素不仅具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫和预防心血管疾病等作用[7-9]，而且发现饲粮中添加蒜粉后还可以促进断奶仔猪和蛋鸡的生长发育、提高机体免疫力和改善周围环境[10-12]。本实验室前期研究也发现大蒜辣素可以通过抗氧化和抗炎作用，预防和治疗CCL4所致的小鼠急性肝损伤，并且肉鸡饲粮中添加一定量的蒜粉可以降低肉鸡脂肪肝发生率和缓解氧化应激[13]。由此可见，大蒜辣素属于典型的多靶点活性化合物，是具有良好潜质的抗生素替代品，但是蒜粉或者大蒜辣素作为饲料添加剂长期应用，对动物机体的CYP450酶系是否产生诱导或者抑制作用，尚未进行过评价。鉴于CYP1A2底物或抑制剂(如饲料中的黄曲霉毒素、常用药物恩诺沙星等)与兽医临床密切相关，因此，本研究首次采用体内外方法探讨了大蒜辣素对肉鸡CYP1A2的mRNA表达量以及CYP1A2酶活性的影响。该研究一方面可预测大蒜辣素在饲料中添加是否会引起药物代谢方面的相互作用，为兽医临床合理使用提供理论指导，另一方面为饲料添加剂的安全性评价提供研究范式和参考。
1 材料与方法 1.1 试验动物1日龄雄性AA肉鸡，体重45~55 g，购自南京特给力种植专业合作社。肉鸡饲养于南京农业大学实验室动物房，入雏前24 h将鸡舍升温至32~35 ℃，此后温度每周降低2~3 ℃，直至保持在22~24 ℃，且鸡舍采光、通风良好，保暖、饮水和采食设施完善。本研究经南京农业大学动物伦理委员会批准(NJAU.No20211130184)。动物的处死和取样等程序符合中国科技部《试验动物管理和治疗规范》(2006)398号以及《实验动物管理和治疗条例》(2008)第45号。
1.2 试剂与药品蒜粉(蒜氨酸质量分数为3.5%，产生潜在大蒜辣素质量分数为1.603%)，由新疆医科大学提供，按照蒜粉中蒜氨酸的质量分数计算其转化为大蒜辣素量(1 g蒜氨酸产生0.458 g大蒜辣素)[14]，根据试验设定大蒜辣素剂量，临用时由蒜粉加水反应10 min后过滤，滤液喷洒饲料拌匀使用。无菌生理盐水购自南京艾瑞思生物技术有限公司；非那西丁和对乙酰氨基酚标准品均购自上海安谱实验科技有限公司；α-萘黄酮标准品购自南京斐诺生物科技有限公司；乙腈购自南京巨优科学器材有限公司；HPLC用水为超纯水系统购自美国Ohaus公司；0.05 mol·L-1 Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)购自于南京迈博生物科技有限公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸还原四钠盐(NADPH)(含量＞98%)购自上海源叶生物科技有限公司；RNA-easy Isolation Reagent(R701)、Reverse-transcribed to cDNA(Vazyme R223-01)和ChamQ qPCR SYBR Green Master Mix(Q311-02/03)均购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
1.3 方法1.3.1 肉鸡分组及处理 90只1日龄AA肉鸡，适应性饲养4 d后，随机分为3组，分别为对照组、大蒜辣素处理组(40和80 mg·kg-1)，每组肉鸡等分为3批，于给药后不同时间点采集肝组织用于制备微粒体并提取肝总RNA。试验具体分组和处理情况见图 1所示。
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图 1 动物分组与处理 Fig. 1 Grouping and processing of animals |
1.3.2 鸡肝微粒体的制备 参考刘婉玉等[15]的钙离子沉淀法制备肝微粒体。将冻存的肝组织置于研钵中(液氮)研磨后称重，按照肝重∶蔗糖溶液为1 ∶4的比例加入0.25 mol·L-1蔗糖溶液后匀浆5 min(在冰上进行)。制备好的肝匀浆液于4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min，取上清液，按照体积比10 ∶1加入浓度为88 mmol·L-1的CaCl2溶液，置于冰水浴中轻搅混匀5 min，然后再于12 000 r·min-1、4 ℃离心15 min后，取沉淀，用0.05 mol·L-1、pH 7.4的Tris-HCl缓冲液冲洗沉淀(除去多余的钙离子)并重悬，12 000 r·min-1、4 ℃离心15 min，再次重悬离心后取沉淀，用含20%甘油的Tris-HCL缓冲液重悬，保存至-80 ℃冰箱备用。
1.3.3 HPLC检测鸡肝微粒体中对乙酰氨基酚1.3.3.1 样品的前处理及HPLC检测条件的确定 样品的前处理：样品加入55 μL冰乙腈后立即置于-20 ℃冰箱中终止反应，12 000 r·min-1、4 ℃，离心15 min，取上清过0.22 μm滤膜，用于HPLC分析。
优化的HPLC检测条件：色谱柱为Diamonsil砖石Ⅱ代C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)，柱温为室温，进样量为20 μL。流动相为水(A)和甲醇(B)，流速为1 mL·min-1，流动相比例为A ∶B=55 ∶45，检测波长为254 nm。
1.3.3.2 标准曲线、检测限和定量限的测定 取灭活的空白鸡肝微粒体10 μL，分别加入2.5 μL系列浓度的对乙酰氨基酚标准溶液，配制成浓度为0.005、0.01、0.02、0.04、0.1、0.2、0.4和0.8 mmoL·L-1的对乙酰氨基酚，再加入5 μL 50 mmol·L-1 NADPH溶液，最后用Tris-HCL溶液补足至250 μL，涡旋混匀后于41 ℃振荡摇床中孵育40 min，按照“1.3.3.1”方法处理样品。分别以对乙酰氨基酚的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并计算相关系数。选择低浓度对乙酰氨基酚的样品，经前处理之后，将样品测定3次，不同时间内重复上述3次，取9次测定结果的均值S和N，以信噪比S/N≥3时样品的最低浓度为该方法的检测限(LOD)，以达到信噪比S/N≥10时样品的最低浓度为该方法的定量限(LOQ)。
1.3.3.3 准确度和精密度的测定 取灭活的空白鸡肝微粒体10 μL，加入系列浓度的对乙酰氨基酚标准溶液配成终浓度0.03、0.10和0.60 mmol·L-1后，加入5 μL NADPH溶液，用Tris-HCl溶液补足至250 μL，涡旋混匀后，于41 ℃振荡摇床中孵育40 min后取出，按照“1.3.3.1”方法处理样品。日内不同时间每个浓度重复3次，连续测定3 d，分别计算日内和日间变异系数，并代入标准曲线计算回收率(%)。如果日内相对标准偏差(RSD)和日间RSD均小于15%，则符合生物样品定量检测的要求。
1.3.4 大蒜辣素处理对肉鸡CYP1A2酶活性的影响 分别将对照组、40和80 mg·kg-1大蒜辣素处理组肝微粒体于冰上解冻，每组各取10 μL微粒体混合液置于2 mL EP管内，加入探针底物非那西丁，用Tris-HCL溶液补足至245 μL，41 ℃振荡预孵育5 min后，加入5 μL NADPH启动反应(微粒体孵育总体系为250 μL)，继续在41 ℃振荡孵育40 min后取出，按照“1.3.3.1”方法处理样品，以对乙酰氨基酚的生成量反映CYP1A2酶活性的变化。每次测定均设置5个平行。
1.3.5 大蒜辣素处理对肉鸡CYP1A2和CXR mRNA表达的影响 按照RNA提取试剂说明书提取肝总RNA，测定A260 nm/A280 nm比值为1.8~ 2.0以及A260 nm/A230 nm比值大于2.0。按照反转录试剂盒说明书操作将RNA反转成cDNA，依次加入2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix、特异性引物及dd H2O涡旋混匀并离心之后进行cDNA扩增(注意避光操作)。内参β-actin基因和目的基因CYP1A2、CXR的上下游引物均用Primer 5软件设计，由擎科生物科技有限公司合成。引物序列如表 1所示。目的基因的mRNA相对表达量采用2-△△Ct法计算[16]。
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表 1 目的基因及内参基因的引物序列 Table 1 Primer sequences of target genes and reference genes |
1.3.6.1 α-萘黄酮和大蒜辣素对CYP1A2酶的半数抑制浓度(IC50)测定 鸡肝微粒体孵育总体系为250 μL。取10 μL空白微粒体混合液置于2 mL EP管中，加入底物非那西丁和系列浓度α-萘黄酮或大蒜辣素后，具体操作如“1.3.4”方法所述，孵育体系中α-萘黄酮的终浓度分别是0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、2.0和5.0 μmol·L-1；大蒜辣素的终浓度分别是5、10、25、50、100和200 μmol·L-1。以剩余肝CYP1A2的活性作为纵坐标，α-萘黄酮或大蒜辣素浓度的对数作为横坐标绘图。采用GraphPad Prism 9软件计算抑制作用的IC50，每次测定均设置3个平行。
1.3.6.2 α-萘黄酮和大蒜辣素对CYP1A2酶的抑制常数(Ki)测定 鸡肝微粒体孵育同“1.3.6.1”方法所述，孵育体系中α-萘黄酮的终浓度为0.10和0.50 μmol·L-1；大蒜辣素的终浓度为10、20和40 μmol·L-1；探针非那西丁的浓度分别是25、50、100、150和200 μmol·L-1。并对酶动力学数据采用Lineweaver-Burk双倒数作图法进行非线性曲线拟合，确定抑制类型，采用GraphPad软件计算Ki值。每次测定均设置3个平行。
1.3.6.3 大蒜辣素在不同处理时间和浓度时对CYP1A2抑制作用的影响 鸡肝微粒体孵育同“1.3.6.1”方法，孵育体系中大蒜辣素的终浓度分别是10、20和40 μmol·L-1，预孵育时间分别为0、5、15和30 min。分别以预孵育时间为横坐标，剩余肝CYP1A2的活性为纵坐标，运用GraphPad作图，得到预孵育时间-酶活性-抑制剂浓度的关系。每次测定均设置3个平行。
1.3.7 数据分析 各组间显著性差异采用GraphPad软件进行单因素方差分析。*.P＜0.05；**.P＜0.01；***.P＜0.001。
2 结果 2.1 对乙酰氨基酚的HPLC方法学考察2.1.1 专属性 经优化处理之后，获得了鸡肝微粒体样品中非那西丁及其代谢产物对乙酰氨基酚的HPLC最佳检测条件。结果如图 2所示，待测药物与杂质峰分离良好，表明该法的特异性和专一性良好，对乙酰氨基酚和非那西丁的出峰时间分别为3.22和10.90 min。
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A. 空白肝微粒体；B. 流动相加入标准品(对乙酰氨基酚100 μmol·L-1，非那西丁50 μmol·L-1)；C. 空白肝微粒体加入标准品(对乙酰氨基酚10 μmol·L-1，非那西丁200 μmol·L-1)。1和3. 对乙酰氨基酚；2和4. 非那西丁 A. Blank liver microsome; B. Mobile phase added with standard substance (acetaminophen 100 μmol·L-1, phenacetin 50 μmol·L-1); C. Blank liver microsomes added with standard substance (acetaminophen 10 μmol·L-1, phenacetin 50 μmol·L-1). 1 and 3. Acetaminophen; 2 and 4. Phenacetin 图 2 空白鸡肝微粒体中非那西丁和对乙酰氨基酚的色谱图 Fig. 2 Chromatogram of phenacetin and acetaminophen in blank chicken liver microsomes |
2.1.2 标准曲线方程及检测限和定量限 如图 3所示，在0.01~0.80 mmol·L-1，对乙酰氨基酚浓度与峰面积的线性关系良好，标准曲线回归方程为y=6.595 1x-0.057 0，R2=0.999 4。对乙酰氨基酚的检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别为0.005和0.01 mmol·L-1。
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图 3 对乙酰氨基酚的标准曲线 Fig. 3 The standard curve of acetaminophen |
2.1.3 准确度和精密度 如表 2所示，鸡肝微粒体中对乙酰氨基酚回收率为94.61% ~96.32%，日内RSD≤2.85%，日间RSD≤14.83%，均符合生物样品的测定要求。
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表 2 对乙酰氨基酚在鸡肝微粒体中的准确度和精密度(n=5) Table 2 Accuracy and precision of acetaminophen in chicken liver microsomes (n=5) |
大蒜辣素对肉鸡CYP1A2酶活性的影响见图 4。添加不同浓度大蒜辣素第14和28天时，肉鸡肝微粒体中CYP1A2酶活性分别显著增加为对照组的1.2倍和1.4倍(P＜0.05)，但第42天时40和80 mg·kg-1大蒜辣素分别使CYP1A2酶活性极显著下降至对照组的80%和62%(P＜0.001)。该结果提示大蒜辣素对肉鸡CYP450酶活性的影响呈现双向作用。
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结果用“x±sx”表示，下同。*.P < 0.05, **.P < 0.01, ***.P < 0.001 The results are expressed as "x±sx ", the same as below.*.P < 0.05, **.P < 0.01, ***.P < 0.001 图 4 大蒜辣素对肉鸡CYP1A2酶活性的影响(n=5) Fig. 4 Effect of allicin on CYP1A2 enzyme activity of broilers (n=5) |
RT-qPCR检测肝组织中CYP1A2和CXR的基因表达情况如图 5所示。结果显示不同浓度大蒜辣素分别处理肉鸡后第14和28天时，高剂量(80 mg·kg-1) 大蒜辣素可使CYP1A2基因的mRNA表达量分别极显著上升为对照组的1.8倍和4.0倍(P＜0.01)，而低剂量(40 mg·kg-1)大蒜辣素处理组与对照组相比差异不显著(P＞0.05)，第42天时，高剂量和低剂量大蒜辣素处理组CYP1A2基因的表达量均显著下调为对照组的50%(P＜0.05；P＜0.01)；大蒜辣素对肉鸡肝CXR的mRNA表达量影响呈现与CYP1A2相似情况，即80 mg·kg-1大蒜辣素处理肉鸡后第14和28天时，CXR基因的表达量均显著上调(为对照组的1.8倍)(P＜0.05)，而在第42天时，40和80 mg·kg-1大蒜辣素处理组CXR基因的表达量均极显著下调(P＜0.01)，为对照组的50%。
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*.P < 0.05, **.P < 0.01, ***.P < 0.001, ns.P>0.05 图 5 大蒜辣素对肉鸡CYP1A2和CXR mRNA表达的影响(n=6) Fig. 5 Effects of allicin on CYP1A2 and CXR mRNA expression in broilers (n=6) |
图 6A和B分别为CYP1A2的经典抑制剂α-萘黄酮和大蒜辣素对CYP1A2抑制作用的拟合抑制曲线。计算可得α-萘黄酮对CYP1A2的IC50值为0.29 μmol·L-1，表现为较强的抑制作用，对量效关系进行线性回归，α-萘黄酮对数浓度在-1.0~0.3范围内呈现良好的线性关系，线性回归方程为y=-45.91x+20.30，R2=0.99(图 6C)。在此条件下，测得大蒜辣素的IC50值为18.87 μmol·L-1，大蒜辣素浓度在0.699~1.699范围内呈现良好的线性关系，线性回归方程为y=-75.18x+153.10，R2=0.98(图 6D)。
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图 6 α-萘黄酮(A、C)和大蒜辣素(B、D)对鸡CYP1A2活性的抑制曲线(n=3) Fig. 6 Inhibitory effect of α-naphthoflavone (A, C) and allicin (B, D) on CYP1A2 activity of chicken (n=3) |
图 7(A和C)是α-萘黄酮和大蒜辣素对CYP1A2抑制曲线采用Lineweaver-Burk双倒数法作图获得的直线。结果显示直线均相交于X轴。当无抑制剂时，非那西丁O-脱乙基化活性的最大反应速率Vmax为(16.03±0.34)nmol·(mg·min)-1，当有抑制剂α-萘黄酮和大蒜辣素存在时，Vmax随抑制剂浓度增加而变小，米氏常数Km均保持不变，为(128.57±4.36)μmol·L-1，表明α-萘黄酮和大蒜辣素对鸡肝微粒体CYP1A2的抑制作用类型为非竞争性抑制。采用Km/Vmax和抑制剂浓度作线性回归，计算α-萘黄酮和大蒜辣素对非那西丁O-脱乙基反应的抑制常数Ki分别为0.97 μmol·L-1(图 7B)和10.89 μmol·L-1(图 7D)。
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图 7 α-萘黄酮(A, B)和大蒜辣素(C, D)对鸡CYP1A2抑制曲线的Lineweaver-Burk图及Ki转换图(n=3) Fig. 7 Lineweaver-Burk plot and Ki transformation of the inhibition curves of chicken CYP1A2 by α-naphthoflavone (A, B) and allicin (C, D) (n=3) |
图 8显示，不同浓度大蒜辣素与鸡肝微粒体预孵育不同时间时，其对鸡肝微粒体代谢非那西丁O-脱乙基化活性的抑制作用。图 8A显示，同一浓度大蒜辣素处理时，CYP1A2剩余酶活性随预孵育时间的增加而极显著降低(P＜0.001)，呈现时间依赖性；图 8B显示，预孵育时间相同时，CYP1A2剩余酶活性随大蒜辣素浓度的增加而极显著降低(P＜0.001)，且呈浓度依赖性。该结果提示大蒜辣素对鸡肝微粒体CYP1A2的抑制作用表现为时间和浓度依赖性。
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对乙酰氨基酚的生成量与对照组的百分比表示CYP1A2剩余酶活性。**.P < 0.01, ***.P < 0.001, ns.P>0.05 The amount of acetaminophen produced as a percentage of the control represents the remaining CYP1A2 enzyme activity. **.P < 0.01, ***.P < 0.001, ns.P>0.05 图 8 大蒜辣素在不同处理时间(A)和浓度(B)下对鸡CYP1A2抑制作用的影响(n=3) Fig. 8 Effect of allicin on CYP1A2 inhibition in chickens at different treatment times (A) and concentrations (B) (n=3) |
研究已证实兽医临床中因CYP450介导药物间相互作用发生而导致严重不良反应，如泰妙菌素、泰乐菌素等与聚醚类抗生素在家禽联用时，因前者可抑制CYP450酶活性导致聚醚类抗生素代谢障碍引起鸡中毒甚至死亡[17]。除此之外，红霉素、诺氟沙星、依诺沙星、柚子汁等对CYP1A2具有显著抑制作用[18-19]。通常情况下，酶抑制所导致的药物间相互作用要远大于酶促反应，约占酶系统全部作用的70%左右[20]。因此新兽药和饲料添加剂进行安全性评价时，也应考虑其对肝药酶的影响。基于此，本试验以蒜粉中的活性成分大蒜辣素为研究对象，率先评价了其对肉鸡肝药酶CYP1A2的表达及CYP1A2酶活性的影响。
大蒜辣素性质不稳定，常温下易分解失活[6, 21]，为充分发挥大蒜辣素的活性，作者采用前体物质蒜氨酸和蒜酶制备大蒜辣素添加到肉鸡饲粮中[22]，并优化条件建立了体外肝微粒体孵育体系和探针药物法评价其对CYP1A2酶活性的影响。值得注意的是大蒜辣素连续给与肉鸡后第14和28天时，会显著增加CYP1A2酶活性，但在第42天时，CYP1A2酶活性反而会极显著下降，进一步对编码该酶的基因表达水平进行检测，发现与酶活性变化的趋势基本一致，即大蒜辣素对CYP1A2酶活性和mRNA表达的影响均表现出明显的先诱导后抑制的双向作用。这与常伟宇[23]的有关黄连素对CYP3A先诱导后抑制的作用一致，但是也有文献显示五味子水提物对大鼠肝微粒体CYP3A也表现为双重的调节作用，但表现为先抑制后诱导的现象[24-25]。由此可见，天然化合物或者中药对机体肝药物代谢酶的影响较为复杂，大蒜辣素对CYP1A2酶表现的双重作用机制尚需深入探讨。此外，草药成分或天然产物改变CYP450的表达或活性对CYP450底物的吸收和生物利用度具有重要意义[26]。因此，本研究后续还需进一步研究大蒜辣素处理对CYP1A2底物非那西丁在肉鸡体内的药代动力学的影响，进而阐明其临床意义。
研究表明，小鼠和人的肝CYP2B和CYP3A基因受组成型雄烷受体CAR(constitutive androstane receptor)和孕烷X受体PXR(pregnane X receptor)调控[27-28]。鸡组织中未发现PXR或CAR，但发现核内受体CXR(chicken xenobiotic receptor)具有与哺乳动物PXR和CAR相似功能，可调节异源代谢酶CYP2H1和CYP2C45以及ABCG2[29]。因此作者进一步探究了大蒜辣素对肉鸡肝CXR mRNA表达的影响，结果显示，其对CXR也表现出双向的调节作用，并与CYP1A2 mRNA表达的变化趋势具有较强的相关性，后续作者将采用RNA干扰或者过表达的方法进一步探讨大蒜辣素是否通过CXR调控鸡CYP1A2的表达。由于缺少鸡源CYP1A2抗体，故本研究未能研究大蒜辣素对CYP1A2蛋白表达的影响。目前本实验室也在制备和纯化鸡源CYP特异性单克隆抗体，以期能建立和完善鸡源CYP450研究体系和平台。
另外，体内结果显示长时间使用大蒜辣素会对CYP1A2产生抑制作用，故本研究进一步优化了探针药物法测定了大蒜辣素对CYP1A2的酶抑制动力学影响。通过将不同浓度α-萘黄酮和CYP1A2的底物非那西丁按照建立的体外孵育方法共同孵育，测得其IC50值和Ki值分别为0.29 μmol·L-1和0.97 μmol·L-1，这和前人的研究结果是一致的[30-31]，证明作者的体外孵育方法可靠，在此条件下测得大蒜辣素对CYP1A2的IC50值为18.87 μmol·L-1。根据通用的CYP450酶抑制剂强度分级规则[32-33]，IC50值＜1 μmol·L-1为强抑制剂，IC50值在1 ~ 10 μmol·L-1为中等抑制剂，IC50值＞10 μmol·L-1为弱抑制剂，表明大蒜辣素为CYP1A2的弱抑制剂。Lineweaver-Burk作图法计算大蒜辣素对CYP1A2的Ki值为10.89 μmol·L-1，并表现为非竞争性抑制，表明大蒜辣素并非与底物竞争酶活性位点而导致抑制作用，其抑制机制有待进一步阐明。虽然大蒜辣素为CYP1A2的弱抑制剂，但本试验显示长期添加对酶活性还是能够产生显著影响，所以临床中大蒜辣素与CYP1A2底物类药物合用或者机体暴露于外源性化合物如黄曲霉毒素时, 应考虑到药物-药物相互作用或者药物-外源化合物相互作用，尤其对于治疗窗较窄的药物特别需要注意毒性作用产生。另外，后续还需细致探讨阶段性不连续使用大蒜辣素对鸡肝药酶活性影响的特点，为临床实际应用提供参考。
4 结论本试验通过将40和80 mg·kg-1的大蒜辣素分别连续14、28和42 d添加于肉鸡饲粮中，发现大蒜辣素对CYP1A2的酶活性和mRNA表达均表现出明显的先诱导后抑制的双向作用；大蒜辣素对CXR基因表达的影响与CYP1A2 mRNA表达的变化趋势具有较强的相关性；此外，本研究表明大蒜辣素对CYP1A2表现为非竞争性抑制，虽是CYP1A2的弱抑制剂，但长期使用大蒜辣素对肉鸡肝CYP1A2产生显著影响，需注意其介导的药物间相互作用。
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(编辑 白永平)