非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一种以肝脂肪显著蓄积为特征的临床病理综合征[1]。目前，NAFLD已成为全球高发病率和高死亡率的疾病之一，且仍然没有特效药，寻找针对性强、副作用小并且疗效明显的抗NAFLD药物意义重大。
线粒体是细胞中能量产生和细胞有氧呼吸的主要场所。正常的肝细胞中有1 000~2 000个线粒体，除提供能量外，还参与肝细胞损伤的病理过程[2]。线粒体功能障碍是HFD诱发NAFLD发生和发展的重要因素[3]。Fouret等[4]研究表明肝脂肪变性进展与线粒体结构和活性变化密切相关。MEEX等[5]研究发现，摄入饱和脂肪酸会降低线粒体呼吸传递链的效率，导致活性氧的产生和附近结构的损伤，导致NAFLD。血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)是肾素血管紧张素系统代偿通路的关键酶，可降解AngⅡ产生Ang1-7，并通过其MasR发挥血管舒张、抗炎、抗纤维化、抗凋亡等生物学功能[6]。研究表明，ACE2的产物Ang1-7作用于MasR通过影响肝细胞线粒体呼吸链功能进而改善NAFLD[7]。并有研究表明，在mTk2 KO小鼠模型中，线粒体功能障碍与ACE2表达相关，ACE2在线粒体代谢中发挥作用[8]。NAFLD发生时，ACE2/Ang1-7/Mas轴激活通过增强胰岛素信号传导，缓解内质网应激和降低ROS水平调节肝糖脂代谢[9-11]。
Moraes等[12]研究表明依那普利通过调节ACE/ACE2肝脏表达改善肝脂肪变性和代谢特征。因此，过表达ACE2激活代偿通路可能是改善肝疾病的一种有效方法。二脒那秦(diminazene aceturate, DIZE)是一种广泛使用且毒副作用小的抗寄生虫药，2011年，Kulemina和Ostrov[13]发现DIZE具有激活ACE2的作用，目前已在多种疾病中开展大量研究。已经证实DIZE能够激活ACE2，继而减轻氧化应激，调节脂代谢，缓解NAFLD[14]，但其能否通过激活ACE2影响线粒体结构和功能缓解肝脂肪蓄积，目前尚不清楚。并且，目前从DIZE激活ACE2影响线粒体结构功能方面研究NAFLD的报道较少，因此，从线粒体结构功能方面进行了研究。
本试验通过高脂饲喂SD大鼠建立NAFLD模型，从线粒体生物发生、融合分裂以及线粒体呼吸链复合物角度研究灌胃DIZE后线粒体结构功能的变化，以进一步探讨DIZE激活ACE2对NAFLD大鼠线粒体结构和功能的影响，旨在为NAFLD的治疗提供新的理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料1.1.1 试验动物 26只6周龄雄性SD大鼠，体质量(200 g ±10 g)，购自斯贝福生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2019-0010。饲养于南京农业大学实验动物中心，环境温度22 ℃±2 ℃，湿度55%±5%，12 h光照/黑暗循环。动物饲养及处理均遵循南京农业大学动物福利与伦理规范的要求。
1.1.2 主要试剂与器材 二脒那秦(DIZE)购自南京良纬生物科技有限公司；线粒体裂变1蛋白(Fis1)抗体、线粒体融合蛋白1(Mfn1)抗体均购自巴傲得生物公司；解偶联蛋白1(UCP1)抗体购自万类生物公司；β-actin抗体、视神经萎缩蛋白1(OPA1)抗体、动力蛋白相关蛋白1(Drp1)抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗均购自武汉爱博泰克生物公司；血管紧张素转换酶2(ACE2)抗体购自Abcam公司，所有抗体均为兔源。2×SYBR Green Pro Taq HS Premix购自艾科瑞生物工程有限公司；大鼠Ang1-7和AngⅡ ELISA检测试剂盒购自南京奥青生物公司；TG、TC试剂盒购自南京建成生物公司；BCA试剂盒购自碧云天生物公司；ECL化学发光超敏显色试剂盒购自上海翌圣生物公司。
POWER-PAC300电泳仪和POWER-PAC HC转印仪(美国，Bio-Rad公司)；Tanon-3900全自动化学发光图像分析系统(上海，Tanon科技有限公司)；Tecan Spark多功能酶标仪(瑞士，Tecan公司)；TA dvanced基因扩增仪(德国，Biometra)；LightCycler96荧光定量PCR仪(罗氏，Roche公司)；Servicebio高速组织研磨仪(武汉赛维尔生物科技有限公司)等。
1.2 方法1.2.1 动物分组与处理 26只6周龄雄性SD大鼠，适应性喂养1周，称重后随机分为对照组(n=9，饲喂脂肪含量为12%的普通饲料)和高脂组(n=17，饲喂脂肪含量为45%的高脂饲料)。参照朱斌等[15]的造模方法，4周后，从两组大鼠中随机各取1只，迅速处死后取肝脏观察肝形态并做组织病理学切片确认NAFLD模型成功建立。然后将高脂组16只大鼠重新分为2组，具体分组和处理见表 1。试验期间观察大鼠的精神状态、毛发光泽和排便情况，每天下午14:00按时按顺序灌胃。试验周期为70 d。
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表 1 动物分组及处理(n=8) Table 1 Grouping and treatment of animals (n=8) |
1.2.2 样品采集 大鼠饲养至第10周末，禁食12 h后，称重并剖杀大鼠，腹主动脉采血，3 000 r·min-1离心10 min，收集血清，于-20 ℃保存。采集肝脏组织，称重后取相同部位组织块于4%多聚甲醛中固定，其余肝组织置于-80 ℃保存。
1.3 肝病理组织学观察大鼠饲喂高脂饮食4周后，随机选择对照组和高脂组大鼠各1只，麻醉处死采集肝脏组织，取相同部位肝组织于4%多聚甲醛中固定24 h，石蜡切片送南京武汉赛维尔生物公司进行制作。光学显微镜观察肝组织形态学变化。
1.4 血清中TG、TC含量的测定测定血清中总胆固醇(TC)及三酰甘油(TG)的含量，具体步骤按照试剂盒说明书进行操作。
1.5 肝中AngⅡ和Ang1-7含量的测定ELISA法测定肝组织中AngⅡ和Ang1-7含量，具体操作根据的ELISA试剂盒说明书进行。
1.6 肝线粒体相关基因mRNA表达的检测1.6.1 引物设计 大鼠过氧化物酶体增殖物受体共激活因子-1α(PGC-1α)、核呼吸因子1(Nrf1)、线粒体转录因子(Tfam)、泛醌氧化还原酶亚基B8(NDUFB8；compleⅠ)、琥珀酸脱氢酶B(SDHB；complex Ⅱ)、泛醇-细胞色素C还原酶核心蛋白2(UQCRC2；complex Ⅲ)及内参GAPDH的引物序列从NCBI网站查阅，根据引物设计原则，利用Primer Premier 5.0设计引物，引物送由南京擎科生物公司合成，各基因的引物序列见表 2。
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表 2 基因引物序列及参数 Table 2 Sequence and parameters of gene primers |
1.6.2 肝组织RNA的提取和cDNA的合成 称取80 mg左右大鼠肝组织，Trizol法提取总RNA，用酶标仪测定RNA的浓度与纯度，DEPC水调整RNA浓度为500 ng·μL-1，反转录体系为20 μL(Evo M-MLV RT Premix 4 μL，总RNA 2 μL，RNase-Free water14 μL)，反转录程序为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 10 min。反转录得到的cDNA于-20 ℃保存。
1.6.3 Real-time PCR 采用荧光定量PCR SYBR Green染料法对相关基因的mRNA表达进行相对定量分析，反应体系为10 μL(RNase-Free water 3.6 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.2 μL，2X SYBR Green Pro Taq HS Premix 5 μL，cDNA模板1 μL)，两步法PCR反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40个循环。以GAPDH为内参基因，计算目的基因相对表达量，结果用2-ΔΔCt表示。
1.7 Western blot检测相关蛋白表达Western blot检测参照Wang等[16]的方法稍作改进：称取约35 mg肝组织剪碎加入500 μL裂解液(RIPA：PMSF=100 ∶1)匀浆，4 ℃，12 000 r·min-1，离心10 min取上清，获得总蛋白。BCA法测定蛋白浓度，并统一稀释为5 μg·μL-1；蛋白上样量7 μL经SDS-PAGE电泳后湿转法(100 V，90 min)转印于PVDF膜上，取出PVDF膜置于5%脱脂奶粉中封闭2 h，随后加入β-actin (1 ∶10 000稀释)，ACE2 (1 ∶3 000稀释)，UCP1(1 ∶1 500稀释)，Mfn1、OPA1、Fis1、Drp1 (皆为1 ∶1 000稀释)，在4 ℃孵育过夜，洗膜后加入山羊抗兔IgG二抗(1 ∶10 000稀释)室温孵育2 h。用全自动发光成像系统显影，拍照保存，Image J软件分析条带灰度值，以β-actin为内参计算目的蛋白的相对表达量。
1.8 数据统计与分析使用SPSS 26.0软件分析数据，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。结果以“平均值±标准误(x±sx)”的形式表示。P < 0.05，表示差异显著，P < 0.01，表示差异极显著。GraphPad Prism 8.0进行作图。
2 结果 2.1 NAFLD模型的建立结果见图 1，与对照组相比，大鼠饲喂高脂饲料4周后肝组织病理学切片出现明显脂肪沉积和脂肪变性(红色箭头)，与朱斌等[15]的研究结果一致，证实NAFLD模型建立成功，可以开展后续试验。
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图 1 饲喂高脂饲料4周后大鼠肝组织病理学变化(HE) Fig. 1 Histopathological changes in rat liver after 4 weeks of feeding high-fat feed (Hematoxylin-eosin staining) |
如表 3所示，与CON组相比，MOD组大鼠血清中的TG、TC含量均显著上升(P < 0.05)。与MOD组相比，DIZE组大鼠血清中的TG、TC含量均显著下降(P < 0.05)。说明DIZE可以显著抑制高脂饮食引起的血脂含量增加，缓解肝脂代谢紊乱。
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表 3 DIZE对NAFLD大鼠血清TG、TC含量的影响(x±sx，n=8) Table 3 Effects of DIZE on serum TG and TC contents in NAFLD rats (x±sx, n=8) |
结果见图 2，与CON组相比，MOD组ACE2蛋白表达极显著降低(P < 0.01)，与MOD组相比，DIZE组ACE2蛋白表达极显著升高(P < 0.01)；与CON组相比，MOD组AngⅡ含量极显著升高(P < 0.01)，Ang1-7含量显著升高(P < 0.05)，AngⅡ/Ang1-7比值显著升高(P < 0.05)，与MOD组相比，DIZE组AngⅡ含量极显著降低(P < 0.01)，Ang1-7含量升高但不显著(P>0.05)，AngⅡ/Ang1-7比值极显著降低(P < 0.01)。提示，DIZE激活ACE2，ACE2降解AngⅡ为Ang1-7。
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与对照组相比，*表示差异显著(P < 0.05)，**表示差异极显著(P < 0.01)；与模型组相比，#表示差异显著(P < 0.05)，##表示差异极显著(P < 0.01)，下同 Compared with the control group, * means significant difference (P < 0.05), ** means extremely significant difference (P < 0.01); Compared with high fat group, # means significant difference (P < 0.05), ## means extremely significant difference (P < 0.01), the same as below 图 2 DIZE对大鼠肝组织中ACE2蛋白表达和AngⅡ、Ang1-7含量的影响(n=8) Fig. 2 Effects of DIZE on ACE2 protein expression and AngⅡ and Ang1-7 content in rats liver(n=8) |
结果见图 3，与CON组相比，MOD组PGC-1α、Nrf1和Tfam基因mRNA表达水平均极显著下调(P < 0.01)；与MOD组相比，DIZE组PGC-1α、Nrf1基因mRNA表达水平极显著上调(P < 0.01)，Tfam基因mRNA表达水平显著上调(P < 0.05)。提示，DIZE通过促进线粒体生物发生发挥缓解NAFLD的作用。
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图 3 DIZE对大鼠肝组织中线粒体生物发生相关基因mRNA表达的影响(n=8) Fig. 3 Effect of DIZE on mRNA expression of mitochondrial biogenesis related genes in rats liver(n=8) |
结果见图 4，与CON组相比，MOD组线粒体融合蛋白Mfn1表达量显著降低(P < 0.05)，OPA1蛋白表达量极显著降低(P < 0.01)，与MOD组相比，DIZE组Mfn1和OPA1蛋白表达量均极显著升高(P < 0.01)。
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图 4 DIZE对大鼠肝组织中线粒体融合分裂相关蛋白表达的影响(n=8) Fig. 4 Effect of DIZE on expression of mitochondrial fusion and division related proteins in rats liver(n=8) |
与CON组相比，MOD组线粒体分裂蛋白Fis1蛋白表达水平极显著降低(P < 0.01)，Drp1蛋白表达水平显著降低(P < 0.05)，与MOD组相比，DIZE组Fis1、Drp1蛋白表达水平均极显著升高(P < 0.01)；提示，高脂饮食不仅抑制线粒体融合蛋白的表达，还抑制线粒体分裂蛋白的表达，同时抑制融合分裂的情况下，线粒体的数量以及功能都会受到损伤，DIZE同时促进融合与分裂改善线粒体质量发挥作用。
2.6 DIZE对NAFLD大鼠线粒体呼吸链复合物基因表达的影响结果见图 5，与CON组相比，MOD组NDUFB8和UQCRC2基因mRNA表达极显著下调(P < 0.01)；与MOD组相比，DIZE组NDUFB8和UQCRC2基因mRNA表达水平极显著上调(P < 0.01)；呼吸链复合物Ⅱ(SDHB)基因mRNA表达水平各组差异均不显著。提示：DIZE可以通过促进线粒体呼吸链复合物基因mRNA表达调节能量代谢，改善NAFLD。
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图 5 DIZE对大鼠肝脏组织中线粒体呼吸链复合物相关蛋白转录的影响(n=8) Fig. 5 Effect of DIZE on trauscription of mitochondrial respiratory chain complex related proteins in rats liver(n=8) |
结果见图 6，与CON组相比，MOD组UCP1蛋白表达极显著降低(P < 0.01)，与MOD组相比，DIZE组UCP1蛋白表达极显著升高(P < 0.01)。提示DIZE可以通过促进产热促进能量代谢。
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图 6 DIZE对大鼠肝组织中UCP1蛋白表达的影响(n=8) Fig. 6 Effect of DIZE on UCP1 protein expression in rats liver(n=8) |
NAFLD以三酰甘油(TG)显著积累为特征，通常超过肝脏质量的5%~10%，其发生发展受遗传、生活习惯、环境等因素影响, 并且与肥胖、糖尿病等疾病密切相关[17]。高脂饮食可导致三酰甘油异常蓄积和肝线粒体功能失衡[18]。
2016年，Cao等[9]研究表明ACE2/Ang1-7/Mas轴可以调节脂质代谢基因减少肝脂积累。Feltenberger等[19]研究表明，上调MasR或Ang1-7给药可以降低TG水平，减少脂肪生成相关标志物，改善NAFLD。Ntouma等[20]研究表明，ACE2过表达能够能缓解肝特异性线粒体应激UBL-5基因缺失导致的脂肪肝。本课题组此前在3T3-L1脂肪细胞的研究提示，ACE2或DIZE可作为防控脂肪沉积发生和发展的潜在靶点或药物[21]。本研究通过建立NAFLD模型，检测TG、TC含量，AngⅡ/Ang1-7比值以及ACE2蛋白表达，发现灌胃DIZE可激活ACE2，显著降低高脂饲喂引起的TG、TC含量的升高，调节AngⅡ/Ang1-7比值，缓解肝脂肪沉积，结果与上述研究一致。
3.2 DIZE对NAFLD大鼠线粒体质量的影响线粒体是细胞内的一种形态微小而高度动态的细胞器，它由线粒体外膜、线粒体膜间间隙、线粒体内膜和线粒体基质组成。线粒体通过增殖和系统合成维持细胞的生命活动，线粒体还参与细胞信息传递、Ca2+稳态、细胞周期调节和氧化应激等一系列作用[22]。
线粒体质量是一个动态平衡的过程，线粒体通过自身持续的融合与分裂、合成与自噬，能够维持其在细胞内的形态和功能，并提供能量[23]。与线粒体融合相关的主要是线粒体融合蛋白1(Mfn1)、线粒体融合蛋白2(Mfn2)和视神经萎缩蛋白1(OPA1)3种蛋白质，研究表明，线粒体融合蛋白Mfn1与Mfn2形成复合体，继而启动外膜融合过程[24]。融合蛋白Opa1通过调节内膜融合维持线粒体嵴的稳定性，通过调控线粒体内膜重构，保持呼吸链完整[25]。与线粒体分裂相关的主要是动力相关蛋白1(Drp1)、线粒体裂变蛋白1(Fis1)和线粒体分裂因子(MFF)。Drp1广泛存在于细胞质中，经翻译修饰激活后易位至线粒体外膜，并与Fis1、MFF、线粒体动力学蛋白相互作用，收缩并切割线粒体。Fis1、MFF在线粒体裂变过程中扮演了不同的角色。普遍认为，Fis1是介导线粒体碎片化过程中不可缺少的因素[26]。
过氧化物酶体增殖物受体共激活因子-1α(PGC-1α)是哺乳动物线粒体生成的关键调控因子，通过核呼吸因子1和2(Nrf1，Nrf2)调控线粒体转录因子(Tfam)的表达，进而参与维持线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)转录和复制，调控线粒体生成[27-29]。本研究检测了线粒体融合分裂蛋白的表达及线粒体生物发生相关基因过氧化物酶体增殖物受体共激活因子-1α(PGC-1α)、核呼吸因子1(Nrf1)、线粒体转录因子(Tfam)、泛醌氧化还原酶亚基B8(NDUFB8；compleⅠ)、琥珀酸脱氢酶B(SDHB；complex Ⅱ)、泛醇-细胞色素C还原酶核心蛋白2(UQCRC2；complex Ⅲ)mRNA表达水平，结果显示，高脂饮食可以抑制线粒体融合分裂蛋白的表达，线粒体生物发生基因的表达，导致线粒体动力学失衡，结构破坏以及数量减少，灌胃DIZE后能够促进线粒体融合与分裂改善线粒体动力学失衡，促进线粒体生物发生，进而发挥缓解NAFLD的作用。
3.3 DIZE对NAFLD大鼠线粒体呼吸链和产热的影响线粒体是脂肪酸β氧化和能量产生的主要细胞器[30]。呼吸链位于线粒体内膜，由复合物Ⅰ~Ⅳ构成，在线粒体氧化中起关键作用[31]，呼吸链进行一系列的氧化还原反应将电子逐级传递到O2，形成水和ATP，为机体提供能量。当机体摄入营养物质过多时，线粒体呼吸链酶复合体的活性降低，导致电子传递受阻，ATP耗竭，不能为细胞提供必需的能量。
PGC-1α能够与UCP1启动子区域结合，上调UCP1表达，促进产热[32]。Garcia-Berumenci等[33]研究表明，高脂高糖诱导的NAFLD大鼠体内，复合体Ⅰ活性降低和ROS的产生增加，会进一步加重肝细胞损伤程度。研究表明，过表达MasR可显著上调线粒体呼吸链相关蛋白的表达，维持肝能量稳态，并改善线粒体功能障碍[7]。Ang Ⅱ诱导线粒体功能障碍，通过线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅲ促进线粒体中ROS的产生[34]。
本研究检测了呼吸链复合物Ⅰ~Ⅲ mRNA表达水平以及UCP1蛋白表达水平，结果表明，高脂饮食导致线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅲ基因mRNA表达水平下调，UCP1蛋白表达水平极显著降低，灌胃DIZE后可改善这一结果。提示，DIZE通过促进产热，上调线粒体呼吸链复合物基因mRNA表达水平进而促进能量代谢，缓解NAFLD。
4 结论DIZE激活ACE2的表达，调节AngⅡ/Ang1-7的比值，同时改善高脂饮食造成的线粒体的生物发生和线粒体呼吸链及产热等的损伤，继而减少脂肪沉积发挥治疗非酒精性脂肪肝的作用，其中ACE2与线粒体结构功能之间的具体作用机制，有待进一步研究。
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(编辑 白永平)