2. 江苏省农业科学院兽医研究所, 农业农村部兽用生物制品工程重点实验室, 南京 210014;
3. 南京农业大学生命科学院, 南京 210095;
4. 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心, 泰州 225300
, FENG Zhixin1,2,4
2. Key Laboratory of Veterinary Biological Products Engineering, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Institute of Veterinary Medicine, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;
3. School of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
4. Guotai Technology Innovation Center of Veterinary Biological Products(Taizhou), Taizhou 225300, China
黏膜是脊椎动物免疫系统的第一道防线，分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，SIgA)是黏膜免疫中结合病原，保护机体的主要效应分子[1-3]。SIgA主要以二聚体的形式存在，两个IgA分子由一条J链(joining-chain)组装形成二聚体，二聚体IgA与多聚免疫球蛋白受体(the polymeric Ig-receptor)的胞外区，也叫分泌成分(secretory component, SC)相结合，形成完整的SIgA[4-5]，随后，SIgA借助分泌成分，从上皮固有层分泌到黏膜器官的腔面[3]。与其它免疫球蛋白类似，IgA分子是由两条分子量约为55 ku的重链和两条分子量约为25 ku的轻链组成，加上15 ku的J链和约为75 ku的分泌成分，SIgA的分子量约为400 ku[6]。除了形成主要的二聚体形式外，SIgA还存在四聚体，五聚体等更多元的聚合形式[7-8]。
近年来，基于IgA单克隆抗体的治疗药物研究越来越多[9-10]。针对结核分枝杆菌，大肠杆菌等呼吸道、消化道的病原，靶向黏膜免疫可产生特异性SIgA的黏膜疫苗也成为疫苗研究的新的方向[9, 11]。病原感染机体后，SIgA出现时间相对较早，存在于取样方便的黏膜分泌液中，因此特异性病原的SIgA也作为早期诊断试剂的靶标分子。如乳汁中猪流行性腹泻病毒IgA抗体的检测[12-13]，胃癌的胃液分泌型IgA的检测等[14]，猪IgA双抗夹心ELISA检测方法的建立等[15]。无论是作为抗体治疗药物，还是检测靶标，SIgA/IgA的分离纯化是关键步骤。目前，SIgA的纯化多以初乳为原材料，主要集中于人、鼠和牛[16-19]。本团队曾采用传统的硫酸铵盐析法沉淀蛋白，DEAE52纤维离子、SephadexG-200凝胶层析和多次Protein A亲和层析，最终分离纯化出猪SIgA[20]。为了进一步提高猪SIgA的纯化效率，本研究避开了费时的硫酸铵沉淀法，采用串联亲和层析，先用Protein G层析柱吸附过多的IgG，然后再用Protein A和Protein L层析柱结合SIgA，最后用阴离子柱Resource Q和分子筛Superose 6对亲和层析柱上洗脱的蛋白进行精细纯化，获得了较高收率和较高纯度且具有活性的猪SIgA，本研究旨在探究一种分泌型免疫蛋白球(SIgA)纯化鉴定更高效的方法。
1 材料与方法 1.1 初乳的采集及乳清的分离采集产仔当天的二元母猪初乳，4 ℃保存，然后用冷冻离心机5 000×g，在4 ℃下离心30 min，用移液器吸取中层乳清，并分装保存于-40 ℃。
1.2 抗体与蛋白阳性对照SIgA，为本实验室每年由专人通过标准方法与流程[20]，从产仔后2 d内母猪初乳中提取，经过鉴定后冻干，保存于-80 ℃的标准品。抗猪SIgA的单抗购于Bethyl公司。SC蛋白和抗SC的单抗也为本实验制备与保存[21]。
1.3 猪初乳SIgA的纯化取10 mL乳清，用PBS缓冲液5倍稀释，然后用超高速离心机100 000×g，4 ℃离心1 h，再次吸取中层乳清并用0.22 μm滤器过滤。用10倍柱体积的PBS缓冲液对Protein G(GenScript)、Protein A(GenScript)及Protein L(GenScript)进行平衡。将过滤后的乳清先到Protein G上进行挂柱，收集流穿液。Protein G的流穿液再依次到Protein A和Protein L柱上进行挂柱。最后用洗脱缓冲液(0.1 mol·L-1 glycine，pH 3.0)对挂柱的蛋白进行洗脱并收集。蛋白被洗脱下来立即用1 mol·L-1 Tris-HCl pH 8.0缓冲液进行中和，防止抗体长期在酸性环境中被破坏。
用SDS-PAGE进行鉴定，将含有目的蛋白的洗脱液使用超滤管进行离心浓缩，用低盐缓冲液A(10 mmol·L-1 Tris-HCl pH 8.0，10 mmol·L-1 NaCl)换液，然后用阴离子交换柱Resource Q(Cytiva)进行纯化，通过缓慢增加高盐缓冲液B(10 mmol·L-1 Tris-HCl PH 8.0，1 mol·L-1 NaCl)的比例来洗脱目的蛋白。收集在A280 nm处有吸收值的洗脱液，经SDS-PAGE及Western blot鉴定，然后选取含有目的蛋白的峰进行下一步试验。
最后用分子筛层析柱Superose 6(Cytiva)进行纯化，缓冲液使用20 mmol·L-1 Tris-HCl pH 8.0，300 mmol·L-1 NaCl。收集在A280 nm处有吸收值的洗脱液，并通过SDS-PAGE及Western blot鉴定收集目的蛋白。整个蛋白的纯化流程如图 1所示。
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图 1 猪初乳SIgA的纯化流程图 Fig. 1 Flow diagram of the purification of SIgA from porcine colostrum |
将纯化后的SIgA按照3 μg·mL-1稀释，每孔100 μL，4 ℃包被过夜，PBST清洗后用5% BSA(PBST缓冲液稀释)37 ℃封闭2 h。用稀释的HRP标记的羊抗猪SIgA的单抗(1 ∶10 000)37 ℃孵育1 h。最后每孔加入TMB显色液100 μL，37 ℃避光显色8~10 min。加入50 μL终止液来终止反应，观察结果。
1.5 Western blot鉴定SIgA的特异性将纯化后的SIgA经SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜。PVDF膜用含5%脱脂乳的TBST缓冲液4 ℃封闭过夜。TBST洗涤后加入1 ∶10 000稀释的HRP标记的羊抗猪SIgA的单抗(TBST缓冲液稀释)，37 ℃，孵育2 h。最后加ECL显色液显色后曝光检测。鉴定SC特异性是以SC单抗为一抗，37 ℃孵育2 h。加入1 ∶10 000稀释的HRP标记山羊抗鼠IgG，37 ℃孵育2 h，其他步骤不变。
1.6 质谱鉴定猪初乳SIgA将纯化后的SIgA进行SDS-PAGE电泳，然后用考马斯亮蓝染色液染色，最后用脱色液进行脱色。将SIgA的重链条带及SC条带切成胶粒，分别装入1.5 mL EP管中，送上海拜谱生物科技有限公司进行质谱鉴定。
每份样品先用胰蛋白酶进行消化，然后使用Easy nLC 1200系统(Thermo Scientific)进行色谱分离。色谱柱使用反相Trap column(100 μm×20 mm，C18)以100%的0.1%甲酸水溶液平衡，再用0.1%甲酸乙腈水溶液进行洗脱，流速为300 nL·min-1，分析时间为60 min。
肽段分离后使用Q-Exactive HF-X质谱仪(Thermo Scientific)进行数据依赖采集式质谱分析。分析时长为30 min，检测模式为正离子，母离子扫描范围为300~1 800 m/z，一级质谱分辨率为30 000@m/z 200，二级质谱分辨率为17 500@m/z 200。
质谱数据库检索软件使用MaxQuant 1.6.17.0，检索的数据库为猪的参考蛋白组数据库(https://www.uniprot.org/proteomes/UP000008227)。
2 结果 2.1 猪初乳乳清的分离经过低温台式离心机离心后，猪初乳可以明显地分为3层，最上层为白色乳脂层，中间层为淡黄色乳清层，最底层为白色酪蛋白沉淀(图 2A)，其中乳清层占90%~95%呈现悬浊液状态。把乳清层用超速离心机离心后，依然分成乳脂，乳清和酪蛋白3层，乳清层变为透明的浅黄色(图 2B)。
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A. 猪初乳经过离心后的分层情况(经过离心后可以分成3层，分别为乳脂层，乳清层和酪蛋白层，不同分层已经用箭头及相应文字进行标注)；B. 经过超速离心后的乳清层 A. Stratification of porcine colostrum after centrifugation (The different layers have been marked with arrows and corresponding text); B. The whey layer after ultracentrifugation 图 2 猪初乳经离心后的分层情况及经过超速离心后的乳清层 Fig. 2 Stratification of porcine colostrum after centrifugation and the whey layer after ultracentrifugation |
乳清样品经过SDS-PAGE，显示在50和25 ku处各有一条条带，分别对应免疫球蛋白的重链和轻链，提示在乳清中含有大量的免疫球蛋白(图 3A)。经过Protein G和Protein A和Protein L挂柱后，用甘氨酸洗脱3个亲和层析柱时，从Protein G柱上洗脱下来的蛋白最多，约有400 mg，其次为从Protein A柱上洗脱的蛋白，约有100 mg，从Protein L柱上洗脱下来的蛋白最少，大约只有40 mg。对洗脱下来的蛋白进行SDS-PAGE鉴定，发现从三个亲和层析柱上洗脱下来的样品均在55和25 ku处各有一条蛋白条带(图 3B)，为免疫球蛋白，但是尚无法区分IgG和SIgA，洗脱样品的杂蛋白条带较弱或者没有，表明亲和层析已经达到一个较好的效果。由于理论上只有在Protein A和Protein L柱上洗脱下来的样品中含有SIgA，因此，这对这两个样品进行进一步的纯化。
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A. 猪乳清层的SDS-PAGE分析(M. 蛋白质相对分子质量标准；1.分离的猪乳清)；B.猪初乳乳清串联亲和层析纯化过程中各样品的SDS-PAGE分析(M. 蛋白质相对分子质量标准；1.乳清结合Protein G柱后的流穿液；2.Protein G柱的甘氨酸洗脱收集液；3.Protein A柱的甘氨酸洗脱收集液；4.乳清结合Protein G柱后又结合Protein A柱后的流穿液；5~6.Protein L柱的甘氨酸洗脱收集液) A. SDS-PAGE analysis of the porcine whey layer (M. Protein relative molecular quality standard; 1. Isolated porcine whey); B. SDS-PAGE analysis of each sample during the tandem affinity chromatography purification of porcine colostrum whey (M. Protein relative molecular quality standard; 1. Flow-through after whey binding to Protein G column; 2. Glycine eluent collection from Protein G column; 3.Glycine eluent collection from Protein A column; 4. Flow-through after whey binding to Protein G column and then to Protein A column; 5-6. Glycine eluent collection from Protein L column) 图 3 猪初乳乳清亲和层析纯化过程中的SDS-PAGE分析 Fig. 3 SDS-PAGE analysis of porcine colostrum whey during affinity chromatography purification |
从Protein A柱上洗脱下来的蛋白，进行离子交换时，蛋白分别在15%和35%的离子强度处各有一个洗脱峰，分别命名为P1峰和P2峰(图 4A)。其中P1峰的面积远远大于P2峰，表明P1峰有更多的蛋白。SDS-PAGE对各个峰的不同收集管进行鉴定，发现各个收集管在55和25 ku处都各有一条蛋白条带。对P1峰和P2峰的蛋白条带进行进一步的对比，发现，P2峰收集的蛋白，55 ku处条带要相对P1峰的要略微偏上，即蛋白要略微偏大(图 4A)。根据之前的研究，SIgA的重链要比IgG的重链要略微偏大[20](图 5)，因此推测P1峰为IgG，P2峰为SIgA。为了进一步确定P1和P2峰的蛋白性质，作者用羊抗猪SIgA重链的抗体对两个峰的蛋白进行免疫印迹，结果表明，抗体可以很好地与P2峰的蛋白，还有阳性对照SIgA进行反应，而与P1峰的蛋白，猪的IgG，BSA等不发生反应(图 4B)。因此，P2峰是主要含有SIgA的目的峰。
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A. Protein A柱纯化蛋白的离子交换层析(横坐标为洗脱体积，纵坐标为A280 nm的吸光值，次坐标为电导率。P1和P2两个峰分别用箭头标出。插入的SDS-PAGE图为目的蛋白洗脱收集峰各个收集管的鉴定，其中1~4号收集管来源于P1收集峰；5~9号收集管来源于P2收集峰)；B. 离子交换层析洗脱峰的Western bolt鉴定(M. 蛋白质相对分子质量标准；1. P1峰的蛋白样品；2. P2峰的蛋白样品；3. SIgA标准品；4. 猪的IgG；5. BSA) A. Ion-exchange chromatography of protein purified by Protein A column (The horizontal coordinate is the elution volume, the vertical coordinate is the absorbance value of A280 nm and the secondary coordinate is the conductivity. Two peaks, P1 and P2, are marked with arrows respectively. The inserted SDS-PAGE plots show the identification of the individual collected fractions of the elution peaks of the target protein, where fractions 1-4 are from the P1 peak; fractions 5-9 are from the P2 peak); B. Western bolt identification of the collected fractions from ion exchange chromatography (M. Protein relative molecular quality standard; 1. Protein sample of the P1 peak; 2. Protein sample of the P2 peak; 3. SIgA standards; 4. Pig IgG; 5. BSA) 图 4 Protein A柱纯化蛋白的离子交换层析及相应洗脱峰样品的Western bolt鉴定 Fig. 4 Ion-exchange chromatography of Protein A column purified proteins and Western bolt identification of the corresponding elution peak samples |
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M. 蛋白质相对分子质量标准；1. SIgA；2. IgG M. Protein relative molecular quality standard; 1. SIgA; 2. IgG 图 5 SIgA及IgG的SDS-PAGE分析 Fig. 5 SDS-PAGE analysis of SIgA and IgG |
类似，从Protein L柱上洗脱下来的蛋白进行离子交换层析时，出现了P1峰、P2峰和P3峰3个峰，分别在15%、35%和50%的离子强度处被洗脱(图 6A)。对三个峰收集的蛋白进行SDS-PAGE鉴定，结果显示：P1、P2峰的蛋白在55和25 ku处均各有单一的条带(图 6A)，其中P2峰55 ku处的重链要略大于P1峰的重链，推测P1峰为IgG，P2峰为SIgA。P3峰的蛋白条带位于33~25 ku，可能为残留的酪蛋白或者乳清中的其它蛋白。此外P2峰的所有收集管在70~90 ku有一条额外的条带，推测可能是SIgA上的SC片段。对P1和P2峰收集的蛋白进行Western blot鉴定，结果显示P2峰的蛋白能够与羊抗猪SIgA重链的抗体于55 ku发生特异性结合，与阳性对照SIgA出现条带的位置一致(图 6B)，判断P2峰为SIgA。而抗体与P1峰蛋白，猪的IgG和BSA都没有明显反应。
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A. Protein L柱纯化蛋白的离子交换层析(横坐标为洗脱体积，纵坐标为A280 nm的吸光值，次坐标为电导率。P1、P2和P3峰分别用箭头标出。插入的SDS-PAGE图为目的蛋白洗脱收集峰各个收集管的鉴定，其中1号收集管来源于P1收集峰；2~7号收集管来源于P2收集峰，8~9号收集管来源于P3收集峰)；B. 离子交换层析洗脱峰的Western bolt鉴定(M. 蛋白质相对分子质量标准；1. P1峰的蛋白样品；2. P2峰的蛋白样品；3. P3峰的蛋白样品；4. SIgA标准品；5. 猪的IgG；6. BSA) A. Ion-exchange chromatography of protein purified by Protein L column (The horizontal coordinate is the elution volume, the vertical coordinate is the absorbance value of A280 nm and the secondary coordinate is the conductivity. Peaks P1, P2 and P3 are marked with arrows respectively. The inserted SDS-PAGE plots show the identification of the individual fractions from the elution peaks of the target protein, where fraction 1 is from the P1 peak; fractions 2-7 are from the P2 peak and fractions 8-9 are from the P3 peak); B. Western bolt identification of the ion exchange chromatography elution peaks (M. Protein relative molecular quality standard; 1. Protein sample of the P1 peak; 2. Protein sample of the P2 peak; 3. Protein sample from P3 peak; 4. SIgA standards; 5. Pig IgG; 6. BSA) 图 6 Protein L柱纯化蛋白的离子交换层析及相应洗脱峰样品的Western bolt鉴定 Fig. 6 Ion exchange chromatography of Protein L column purified proteins and Western bolt identification of the corresponding elution peak samples |
经过上述阴离子柱交换层析，发现通过Protein L柱纯化得到的SIgA蛋白更多，阴离子交换层析时的峰型更好，因此，选取图 6中的P2峰，进行进一步的分子筛层析。分子筛层析结果显示，蛋白主要在13 mL左右出现较为单一的峰(图 7A)，在10和15.5 mL左右分别由一个较小的峰。SDS-PAGE鉴定发现，主峰蛋白在55和25 ku各有一条蛋白条带，提示为免疫球蛋白。10 mL左右的小峰，蛋白条带位于70~90 ku，推测可能是SC蛋白。15.5 mL处的小峰，在55和25 ku各有一条蛋白条带，可能为残留的少量IgG。Western blot鉴定，结果显示主峰的蛋白能够与羊抗猪SIgA重链的抗体在55 ku发生特异性结合，与泳道2阳性对照结果一致(图 7B)。判断该主峰为猪的SIgA。
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A. 分子筛纯化(横坐标为洗脱体积，纵坐标为A280 nm的吸光值，其中主峰为目的蛋白。插入的SDS-PAGE图为目的蛋白洗脱收集峰各个收集管的鉴定，其中1号管为分子筛纯化上样前的样品。2~4为10 mL出小峰的收集样品，5~9为主峰收集的样品，10为15.5 mL处小峰收集的样品)；B. Western bolt鉴定(M. 蛋白质相对分子质量标准；1. 主峰收集的样品；2. SIgA标准品；3. IgG；4.BSA) A. Molecular sieve purification (The horizontal coordinate is the elution volume and the vertical coordinate is the absorbance value of A280 nm. where the main peak is the target protein. The inserted SDS-PAGE plot shows the identification of the individual collected fractions for the elution peaks of the target protein, where lane 1 is the sample prior to molecular sieve purification; lanes 2 to 4, are the collected fractions at 10 mL of the small peak; lanes 5 to 9 are the fractions collected from the main peak and lane 10 is the fraction collected from the small peak at 15.5 mL); B. Western bolt identification (M. Protein relative molecular quality standard; 1. Sample collected from the main peak; 2. SIgA standards; 3. IgG; 4. BSA) 图 7 SIgA的分子筛纯化及Western bolt鉴定 Fig. 7 Molecular sieve purification and Western bolt identification of SIgA |
由于纯化的SIgA可用于ELISA测定，因此，我们用ELISA的方法来鉴定SIgA是否可以很好地被抗IgA(重链)的特异性抗体识别。结果显示，与BSA相比，本研究纯化的SIgA和SIgA阳性对照[20]与都抗IgA(重链)的抗体具有显著的反应性。而本研究纯化的SIgA与抗体的反应性与SIgA阳性对照相当，甚至还略高于SIgA阳性对照。因此，通过本论文中构建的SIgA的纯化方法，保留了SIgA的特性(图 8)。
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1. Protein L柱洗脱收集液纯化后的SIgA；2. Protein A柱洗脱收集液纯化后的SIgA；3. SIgA标准品；BSA. 阴性对照；****表示差异极显著(P < 0.000 1)；*表示差异显著(P < 0.05)；ns表示差异不显著(P>0.05) 1. SIgA purified by Protein L column; 2. SIgA purified by Protein A column; 3. SIgA standards; BSA is the negative control; **** indicates a highly significant difference (P < 0.000 1); * indicates a significant difference (P < 0.05); ns indicates a non-significant difference (P>0.05) 图 8 ELISA法检测SIgA特异性 Fig. 8 ELISA assay for SIgA specificity |
血清IgA与SIgA的不同之处在于，血清IgA不含有SC成分，SC是分泌型IgA的特有组分，因此，作者用抗SC的单抗对纯化过程中的样品进行了Western bolt杂交。其结果显示，与商品化SC片段一致，不同纯化阶段的SIgA都能够与抗SC的单抗反应，在70~95 ku有一条明显的条带；但是IgG和BSA没有特异性的条带(图 9)。
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M. 蛋白质相对分子质量标准；1. Protein A柱洗脱纯化的SIgA蛋白；2. Protein L柱洗脱纯化的SIgA蛋白；3. 分子筛纯化时SIgA收集峰蛋白；4. 商品化SC；5. IgG；6. BSA M. Protein relative molecular quality standard; 1. SIgA protein purified by Protein A column; 2. SIgA protein purified by Protein L column; 3. SIgA protein collected during molecular sieve purification; 4. Commercial SC; 5. IgG; 6. BSA 图 9 不同纯化阶段蛋白样品与抗SC单抗的Western bolt验证 Fig. 9 Western bolt verification of protein samples with anti-SC monoclonal antibody at different stages of purification |
为了进一步确认纯化得到的蛋白为SIgA，把重链对应的条带以及疑似SC的条带(图 10)进行了质谱鉴定(图 11)。
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M. 蛋白质相对分子质量标准；1. 纯化后的SIgA蛋白 M. Protein relative molecular quality standard; 1. Purified SIgA protein 图 10 纯化后SIgA的SDS-PAGE分析 Fig. 10 SDS-PAGE analysis of purified SIgA |
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A. SC总离子图谱；B. SIgA(重链)总离子图谱 A. SC total ion mapping; B. Total ion mapping of SIgA (heavy chain) 图 11 纯化后SIgA的质谱鉴定 Fig. 11 Mass spectrometry identification of purified SIgA |
重链对应条带的质谱结果显示(表 1)，丰度最高，匹配性最好，覆盖度最好，匹配的多肽条数最多的为猪的IgA重链区域(uniprot No.: A0A287B626)，此外结果中猪的J链也占了相当的比例(uniprot No.: A0A287BJU0;A0A5G2QR26;F1RUQ0;A0A287BEC0;A0A287BJL0;A0A287B5V2;A0A287BQC8)。疑似SC条带的质谱进行搜库后，与猪的多聚免疫球蛋白受体，即SC(uniprot No.: A0A5G2RA19;F1SEY8;A0A287A0N2; A0A287B644;F1SEZ3;A0A287ADL4)，有最好的匹配度，因此确定70~95 ku的条带为SC片段。因此，可以判定纯化得到的蛋白确实为猪的SIgA。
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表 1 SIgA(重链)及SC鉴定结果 Table 1 Identification results of SIgA (heavy chain) and SC mass spectrometry |
近年来，SIgA作为黏膜免疫的“主角”，其作为诊断靶标和治疗药物越来越受到重视[1, 9]。相对IgG的纯化，SIgA的提取更具有挑战性[17, 20]。与大部分传统的SIgA纯化方法相比[17, 20]，本研究在如下几个方面具有创新和纯化优势：1)离心步骤中，增加了超速离心，可以使酪蛋白沉淀地更彻底，使乳清层得到一个更好的分离，减少了下一个纯化步骤中杂质蛋白的非特异性吸附。2)先用Protein G填料吸附乳清中的大部分IgG，这样避免由于大量的IgG吸附导致与Protein A及Protein L吸附的SIgA减少，最后使SIgA的收率减少。此外还避免在离子交换这一过程中，过多的IgG蛋白，增加纯化次数及对柱子造成的损害。3)所用的强阴离子柱Resource Q，比DEAE52弱阴离子填料具有更强的蛋白吸附能力，洗脱时具有更好的分辨率。分子筛Superose 6也比SephadexG-200具有更好的分辨率。这将使纯化获得的蛋白具有更高的纯度。4)在收率上，10 mL的初乳可以得到3 mg的SIgA蛋白，而使用传统方法，相同的初乳，获得SIgA的量只有1/3。5)从活性和完整性上，从ELISA的结果可以看出，相比本实验室保存的猪SIgA，本方法纯化的SIgA与抗猪IgA重链的抗体具有更好的反应性(图 8)。此外，本方法纯化的SIgA与抗SC的抗体具有很好的反应性，表明纯化的SIgA较好得保留了SC的部分(图 9)，另外，从SDS-PAGE胶图上看SC的条带也比本实验室保存的SIgA明显，提示本纯化方法可能更有利于SIgA的完整性。
与之前构建的方法不同的是，在本方法中洗脱的蛋白没有出现IgM。猪IgM的重链条带大概在75 ku左右[20]，可以在没有进行任何纯化的乳清以及亲和层析的流穿液中发现(图 3)。本研究与2011年方法的主要差异，是本方法先用Protein G、Protein A和Protein L进行的串联亲和层析，这些填料与猪IgM的亲和力还是未知。其中Protein G，与人的IgM和IgA有非常弱的亲和力，但是对鼠的IgM和IgA却没有亲和力，因此推测，在本方法中猪初乳中的IgM很有可能没有结合到亲和层析柱上，从而后继的纯化过程中也不会出现。而2011年的方法IgM是先过的SephadexG-200分子筛层析的时候出现的，此过程乳清中的所有蛋白都会出现，因而出现了上述差异。
本研究可以看出，相比SIgA，猪初乳中IgG的含量占了有绝对的优势。进行串联亲和层析后，从Protein G柱上洗脱了400 mg IgG，Protein A柱洗脱蛋白进行离子交换时，IgG还是占据了主要部分(图 4A)，甚至Protein L上洗脱的蛋白进行离子交换时，IgG峰依然要比IgA高(图 6A)。鉴于此，推测猪初乳中IgG含量显著高于SIgA的原因，可能有如下三点：1)初乳中含有较多的SIgA，但是IgG依然为主要的抗体组分。2)SIgA的含量也有可能与初乳采集的时间有关，本研究用的初乳是产后当天采集的，此时SIgA的分泌量可能还不多。3)SIgA存在较多的糖基化，可能导致其与填料的亲和力下降，导致纯化得到的SIgA不多。
本研究一方面为从猪初乳中纯化SIgA提供了更高效的方法，为猪病的黏膜抗体诊断试剂盒提供原材料，另一方面也可为从其它动物初乳中提纯SIgA提供参考。
4 结论采用串联亲和层析，强阴离子柱和精细分子筛层析进行纯化，建立了一种从猪初乳中纯化SIgA的高效纯化方法，使用本方法纯化的SIgA较原先方法(即硫酸铵沉淀，DEAE52弱阴离子层析，SephadexG-200凝胶层析和多次亲和层析的纯化方法)具有更高的反应性。
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(编辑 白永平)