2. 四川省甘孜藏族自治州畜牧业科学研究所, 康定 626000;
3. 四川省畜牧科学研究院, 成都 610066
, YANG Danjiao2
, YE Zhongming2, ZHANG Min2, LAN Lan2, WANG Jinghao1, ZHOU Han1, KANG Runmin3, YU Jifeng3, ZHANG Zhidong1, LI Yanmin1, ZHOU Long1
2. Animal Husbandry Science Institute of Ganzi Tibetan Automous Prefecture, Sichuan Province, Kangding 626000, China;
3. Sichuan Animal Science Academy, Chengdu 610066, China
藏猪是我国青藏高原及其周边地区的地方特有猪种，起源于早期少数民族驯化当地野猪而形成[1]，属于放牧饲养的小型猪种，是我国高原牧区人民的重要生活资料。猪呼吸道疾病综合征(porcine respiratory disease complex, PRDC)是一种以病毒、细菌和支原体等多种病原体相互在机体内作用引起的呼吸道疾病的总称[2]，而病毒作为PRDC的主要病原体常常造成发病率和死亡率的提高，对养猪业造成了巨大的经济损失。病毒性呼吸道疾病是藏猪的一种常见疾病，主要以感染6~10周龄的保育猪和16~22周龄的育肥猪为主，猪群的发病率一般在30%~70%，死亡率为4%~15%[3]。
藏猪养殖以放牧为主，常年与当地牦牛、藏绵羊、山羊混群饲养，这种养殖模式可能会造成呼吸道疾病相关病毒的跨物种传播，导致病毒在牧区进一步广泛传播[4]，同时，放牧过程中藏猪与人群的密切接触，也有可能增加人畜共患传染病的传播风险[5]。常见的猪源人畜共患病毒病主要有口蹄疫(FMD)、猪流感(SI)、猪蓝眼病(LPM)、水疱性口炎(VS)、乙型脑炎(JE)、戊型肝炎(HE)等[6]。目前，猪呼吸道疾病研究主要针对低海拔地区的地方猪种和进口猪种，目前已报道的可引起猪呼吸道综合征相关病毒主要有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、流感病毒(SIV)、伪狂犬病病毒(PRV)、圆环病毒(PCV)及猪呼吸道冠状病毒(PRCV)等[7-8]，而高原地区藏猪呼吸道疾病相关的病毒种类及流行情况尚不清楚。
宏基因组学技术由Handelsman等[9]于20世纪90年代提出，病毒宏基因组学是宏基因组学技术的分支之一，该技术可将环境和机体内病原微生物的遗传物质视为整体对象研究，可快速鉴别病毒种类，是挖掘未知病毒的有效技术，也是分子流行病学研究中监测致病性病毒遗传变异情况的有力手段[10]。为了调查我国藏猪的呼吸道疾病相关病毒，作者使用宏基因组学技术，对2022年收集于四川省甘孜藏族自治州的119份藏猪呼吸道样本进行高通量测序，并进行全基因组遗传变异、遗传演化和重组分析，该研究丰富了我国高原地区藏猪呼吸道病毒的流行病学调查资料，为科学防控呼吸道病毒病在藏猪种群之间传播提供数据支持。
1 材料与方法 1.1 样品采集四川省甘孜藏族自治州存栏纯种藏猪主要分布在稻城、泸定和康定等纯牧区和半农半牧的高山峡谷地带，2022年1—10月，从稻城、泸定和康定三个地区的17个猪场采集119份藏猪呼吸道样品，其中健康组66份，均为鼻拭子(来自6个猪场)，呼吸道症状明显(如流鼻液、呼吸急促、困难等)的发病组53份，包括藏猪鼻拭子、肺组织及肺泡灌洗液(来自11个猪场)。采集完后-20 ℃保存，送至实验室。
1.2 主要试剂0.45 μm、0.22 μm微孔过滤器购自Millipore公司；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司；Ultra 50K超滤管购自默克密理博生命科学部；ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover反转录试剂盒购自TOYOBO公司；高速冷冻离心机(型号TG16.5)，购自上海卢湘仪离心机仪器有限公司; PCR仪(型号为A300)，购自杭州朗基科学仪器有限公司，凝胶成像系统(型号为GelView 6000Plus)，购自BIO-RAD公司; 核酸电泳仪(型号为DYY-12)，购自北京君意东方电泳设备有限公司。
1.3 样品处理和核酸提取对临床样本进行处理，简述如下：每份鼻拭子样本加入2 mL PBS缓冲液，震荡混匀，各取500 μL上清液；肺样本研磨后加入PBS缓冲液，10 000 r ·min-1离心5 min取上清液，将健康组和发病组的样本分别混合成一个pool样，先后使用一次性0.45和0.22 μm过滤器分别过滤，去除较大的组织碎片和细菌，然后用Ultra 50K超滤管将病毒液浓缩，使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取浓缩液的总DNA和RNA，并将提取的总RNA反转录形成cDNA，送至上海探普生物科技有限公司建库测序。
1.4 建库和Illunima novaseq 6000测序抽提pool样中的总基因组DNA，使用DNA剪切仪将提取的DNA随机打断成长度约450 bp的DNA小片段。构建PE文库后进行Illunima novaseq 6000测序。将获得的原始数据使用trimmomatic软件进行过滤，去除接头序列、低质量读段、N率较高序列(超过10%的reads)及长度过短序列(小于75 bp)，得到高质量的测序数据(clean data)。使用bwa去除clean reads内比对到宿主基因组的reads序列。使用kraken2软件对clean reads进行物种分类学注释，保留注释到病毒的reads条数。使用Megahit组装软件对所得到的病毒reads进行组装。
1.5 引物设计为检测藏猪中PCV2、TTSuV和Porprismacovirus三种病毒的流行情况，使用Primer 5软件设计3种病毒的引物，TTSuV和Porprismacovirus的引物序列参照宏基因组测序所得的序列，PCV2引物参照GenBank中已有的PCV2序列设计合成，详细信息见表 1。
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表 1 猪圆环病毒、细环病毒和Porprismacovirus引物信息 Table 1 Primer information of PCV2, TTSuV and Porprismacovirus |
通过NCBI中的BLASTN算法将组装好的病毒核苷酸与数据库比对，基于BLASTN的最佳比对结果，选择了6株Porprismacovirus毒株作为参考序列，利用Mega X软件的Clustal(W)程序将SCgz-2022毒株全基因组与GenBank里面的6株Porprismacovirus参考株全基因组序列进行比对，然后使用DNAStar软件中的MegAlign程序分析病毒的全基因组及其编码氨基酸序列的相似性。
1.7 病毒遗传演化分析选取GenBank内的毒株作为参考毒株，分别构建PCV-2、TTSuV和Porprismacovirus的全基因组遗传进化树以及Smacoviridae病毒科全基因组和Rep基因的遗传演化树。使用MEGA X软件用于构建系统发育树，MUSCLE组件进行每条基因序列的相似性比对，采用Neighbor-Joining Method (NJ法/邻近法)构建全基因组和Rep基因的系统发育树，对系统发育树的Bootstrap值进行1 000次重复以评估系统进化树分支的置信度。
1.8 全基因组重组分析根据NCBI中的BLASTN算法的比对结果，利用RDP4软件对测得病毒序列及从GenBank中下载的5株可疑亲本毒株Porprismacovirus全基因组序列进行重组分析，使用7种统计方法(RDP、GENECONV、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan、3Seq)分析其重组显著性，根据P值判断结果显著性(P＜0.05为有差异，P＜0.01为有显著差异，P＜0.001为有极其显著差异)，若7种统计学方法中有5种显示重组显著，则表明该重组结果可信。
2 结果 2.1 Illunima测序分析通过高通量测序，从藏猪呼吸道的pool样中获得62 154 056 reads，注释到病毒的reads条数占比为1.63%，用VirFinder、VirSorter2和IMG/VR三个软件比对发现，健康藏猪呼吸道样品中检测到的病毒reads主要以细菌噬菌体为主，动物相关病毒仅有疱疹病毒科(Herpesviridae)的mardivirus。发病藏猪呼吸道样品病毒种群包括14个病毒科(图 1A)，按病毒reads条数百分比排列顺序分为：类双生病毒科(Genomoviridae)36.48%，指环病毒科(Anelloviridae)15.61%，疱疹病毒科(Herpesviridae)12%，环状病毒科(Circoviridae)8.65%，非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)5.63%，全病毒科(Totiviridae)4.77%，小环状DNA病毒科(Smacoviridae)3.99%，布尼亚病毒科(Peribunyaviridae)2.47%，腺病毒科(Adenoviridae)2.33%，痘病毒科(Poxviridae)2.25%，细小病毒科(Parvoviridae)2.11%，黄病毒科(Flaviviridae)1.72%，多瘤病毒科(Polyomaviridae)1.16%，冠状病毒科(Coronaviridae)0.83%，对应16种病毒(图 1B)，包括双环病毒(gemycircularvirus)36.48%，细环病毒(Torque teno sus virus)15.61%，猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2)8.65%，非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)5.63%，猪细胞巨化病毒(porcine cytomegalovirus)5.54%，人疱疹病毒4型(human gammaherpesvirus 4)4.85%，Piscine myocarditis-like virus 4.77%，Porprismacovirus 3.99%，正布尼亚病毒(Orthobunyavirus)2.47%，禽腺病毒(fowl aviadenovirus)2.33%，Variola virus 2.25%，Protoparvovirus 2.11%，丙型肝炎病毒(hepacivirus C)1.72%，Ictalurid herpesvirus 1 1.61%，多瘤病毒(polyomavirus)1.16%，蝙蝠冠状病毒(Tylonycteris bat coronavirus)0.83%。结果表明，藏猪呼吸道发病组样本中病毒种群以DNA病毒为主，包括了11个病毒科的13种病毒，共占91.04%；而RNA病毒仅占8.96%，包括了3个病毒科的3种病毒。
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图 1 藏猪呼吸道样本中检测到的病毒科(A)和病毒种(B)的序列分类 Fig. 1 Sequence classification of virus family (A) and virus species (B) detected in respiratory tract samples of Tibetan pigs |
通过对病毒的reads进行组装，组装出3条TTSuV近全长基因组，2条PCV-2全基因组和1条Porprismacovirus全基因组，针对测序结果中出现的PCV-2、TTSuV、Porprismacovirus设计引物进行验证，结果显示PCV-2检出率为5.04%(6/119)，TTSuV检出率为0.84%(1/119)，Porprismacovirus检出率为2.52%(3/119)，并对检出样品送至公司进行测序确定。进一步对以上3种病毒进行遗传演化分析。
将3株TTSuV分别命名为SCgz-1、SCgz-2和SCgz-3，拼接长度分别为2 815、2 578和2 757 bp，与其它TTSuV参考毒株核苷酸比对结果显示，Scgz-1毒株相似性为55.0%~96.3%，Scgz-2毒株相似性为55.5%~97.8%，Scgz-3毒株相似性为55.5%~93.3%，三株毒株之间的相似性为56.2%~ 74.9%。遗传演化结果表明，本研究的3株TTSuV均为k2型，其中SCgz-1属于k2b亚型，SCgz-2和SCgz-3属于k2a亚型(图 2A)。
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 .本研究毒株
. The strains studied in this study
图 2 PCV-2(A)、TTSuV(B)、Smacoviridae病毒科Rep基因(C)系统发育分析
Fig. 2
Whole genome phylogenetic analysis of PCV-2(A), TTSuV(B), Rep gene of Smacoviridae(C)
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将2株PCV-2毒株命名为SCgz-SMU-1和SCgz-SMU-2，两株PCV-2长度分别为1 767、1 731 bp，与23株PCV-2参考毒株序列相比，SCgz-SMU-1的核苷酸相似性为94.4%~99.6%，SCgz-SMU-2的核苷酸相似性为94.1%~99.0%。遗传演化分析结果表明(图 2B)，SCgz-SMU-1和SCgz-SMU-2均为PCV-2d亚型。
将Porprismacovirus病毒株命名为SCgz-2022，全长为2 398 bp。由于Rep基因常用于Smacoviridae病毒科的遗传演化分析，将其分为12个种属[11]，本研究将SCgz-2022与30株小环状DNA病毒科内的12种属毒株的Rep基因构建进化树，遗传演化分析结果表明，SCgz-2022毒株属于Porprismacovirus种属(图 2C)。
2.3 Porprismacovirus全基因组同源性分析基于BLASTN比对结果可知，SCgz-2022毒株与越南地区的人源毒株相似性最高，五株猪源毒株相似性仅次于该人源毒株，以这6株毒株作为参考毒株，全基因组相似性为61.0%~89.5%；Rep基因核苷酸相似性为86.3%~90.3%；Cap基因核苷酸相似性为37.3%~87.4%，详见表 2。全基因组和Cap基因的比对结果表明，SCgz-2022毒株与人源毒株相似性最高，但其Rep基因相似性比对结果却显示其与猪源毒株相似性最高。SCgz-2022毒株虽为猪源毒株，但其与人源毒株的高相似性表明，该毒株可能在人畜之间传播。
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表 2 SCgz-2022毒株与6株参考毒株核苷酸和氨基酸相似性分析 Table 2 Nucleotide and amino acid homology between SCgz-2022 strain and six reference strains |
氨基酸序列分析显示，SCgz-2022株Rep蛋白编码243个氨基酸(33~764 nt)，Cap蛋白编码336个氨基酸(1 181~2 191 nt)。氨基酸比对结果显示，Rep蛋白氨基酸相似性为91.4%~95.9%；Cap蛋白氨基酸相似性为20.8%~88.9%(表 2)。在Rep蛋白中，SCgz-2022株与Human 16806x66_213株有21个氨基酸差异，与Porcine 17489x28_1796株有10个氨基酸的差异(图 3A)。在Cap蛋白中与Human 16806x66_213株有13个氨基酸差异，且SCgz-2022株在311~315点位出现5个氨基酸的插入(图 3B)，SCgz-2022株与相似性较高的5株猪源毒株的Cap蛋白氨基酸相似性仅为20.8%~32.2%(表 2)，表明藏猪源Porprismacovirus基因组遗传变异较大。
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图 3 Porprismacovirus毒株Rep蛋白(A)、Cap蛋白(B)氨基酸序列比对及基因组图谱标注(C) Fig. 3 Amino acid sequence alignment of Rep protein (A) and Cap protein (B) and genome map annotation (C) |
将SCgz-2022毒株全基因组与GenBank中64株小环状DNA病毒科(Smacoviridae)参考毒株全基因组构建进化树。全基因组进化树显示，SCgz-2022毒株与越南源的Human 16806x66_213毒株单独聚为一支，而其余五株参考毒株则遗传距离较远(图 4)。Rep基因进化树显示，SCgz-2022株为Porprismacovirus种属，遗传距离与一株猪源毒株距离较近(图 2C)。根据遗传演化关系上的差异，进一步推测SCgz-2022毒株可能为重组毒株。全基因组进化树结果也表明了不同物种来源的Smacoviridae毒株有较近的遗传演化关系，如，人源宿主和鼠源宿主聚为一大支(图 4)，表明该科毒株可能存在不同宿主间的相互传播。
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本研究毒株由红色星号标注，参考毒株由灰色阴影标注，目的毒株由红色阴影标注，不同宿主来源毒株用不同颜色标记名称(人源和灵长类为红色、猪源为蓝色、鼠源为绿色，鸡源为黄色)，红色箭头所指区域为不同宿主来源所构成的进化支 The strain in this study is labeled with a red asterisk, the reference strain is labeled with a gray shadow, the target strain is labeled with a red shadow, and different host source strains are named with different colors (red for humans and primates, blue for pigs, green for mice, and yellow for chickens). The area indicated by the red arrow represents the evolutionary branch composed of different host sources 图 4 小环状DNA病毒科全基因组系统发育分析 Fig. 4 Phylogenetic analysis of whole genome of Smacoviridae |
以GenBank中下载的5株可疑亲本毒株Porprismacovirus全基因组序列为参考毒株，使用RDP4软件分析SCgz-2022株基因组中可能存在的重组事件。结果表明，SCgz-2022毒株为人源Human 16806x66_213毒株和猪源Porcine 17668x82_593毒株的重组毒株。亲本株Human 16806x66_213于2013年在越南人的粪便中检测到，而亲本株Porcine 17668x82_593于2013年在越南家猪直肠拭子中检测到。重组断点为核苷酸760位点(760 nt)，将SCgz-2022基因组分为两个重组区域，分别为Region A(1~760 nt)、B(761~2 566 nt)，进一步遗传进化分析结果表明，在Region A区域SCgz-2022株与猪源毒株有较近的遗传进化关系，在Region B区域则和人源毒株单独为一支，遗传进化关系接近(图 5)。7种重组算法中有6种方法显示具有极显著重组，P-value分别为RDP(3.443×10-11)、BootScan(1.270×10-19)、MaxChi(4.508×10-16)、Chimaera(1.149×10-4)、SiScan(1.165×10-2)、3Seq(7.771×10-15)。综上结果表明，SCgz-2022毒株为人源和猪源Porprismacovirus毒株重组而来的新型变异毒株。
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本研究亲本株Human 16806x66_213用蓝色线条表示；亲本株Porcine 17668x82_593用紫色线条表示；本研究Porprismacovirus毒株SCgz-2022用红色圆点表示 图 5 SCgz-2022株全基因组重组分析结果(A)和遗传进化分析(B) Fig. 5 Whole genome recombination analysis of SCgz-2022 strain (A) and genetic evolution analysis (B) |
病毒性呼吸道疾病是藏猪的一种常见疾病，对藏猪养殖业造成了较大影响。本研究对四川省甘孜藏族自治州采集的119份呼吸道样本进行病毒宏基因组测序，结果显示，健康组藏猪的呼吸道样本中未检测到与呼吸道疾病相关的病毒，主要为细菌噬菌体，表明藏猪可能遭受细菌的感染。发病组藏猪样本中检测出14个病毒科的16种病毒，以小DNA病毒为主，在检测到的16种病毒中已经证实可引起猪呼吸道疾病的病原有PCV-2、TTSuV、PCMV和ASFV等。与发病组相比，健康组检测到的病毒群落较少，可能与样品采集部位不同有关，健康组仅采集了藏猪鼻腔拭子，而藏猪鼻道短，采样拭子难以深入鼻腔内部进行采集，加之测序深度仍显不够，导致健康组藏猪的鼻腔中的病毒丰度较低。本课题组曾对藏猪腹泻粪便样本中的病毒进行检测，结果表明也是以小DNA病毒为主[5]，这可能是藏猪易感小DNA病毒的一个特征，有待进一步研究。在藏猪发病组呼吸道样本中发现了部分禽腺病毒(fowl aviadenovirus)、蝙蝠冠状病毒(Tylonycteris bat coronavirus)、人疱疹病毒4型病毒(human gammaherpesvirus 4)的部分序列，表明藏猪呼吸道的多种病毒存在不同家畜间、人和家畜间交叉传播的可能，推测与藏猪以放牧为主的养殖模式有关，应予以重视。
PCV-2于1998年首次分离鉴定。该病毒与母猪繁殖障碍、猪皮炎和肾病综合征(PDNS)、腹泻、呼吸和神经系统病症等存在潜在关联，该病是影响养猪业发展的重要疾病[12]。本研究从藏猪呼吸道样本中检测出PCV-2，检出率为5.04%(6/119)，检出率显著低于从川西高原地区藏猪腹泻样本中的检出率(10.96%)[5]，这可能与样品采集部位不同和检测样品中包含部分未发病猪样品有关。猪细环病毒(TTSuV)为小型环状单股负链DNA病毒，目前猪群中有两种不同基因型(1型和K2型)广泛流行[13]，有研究报道，TTSuV 2可能会在宿主免疫力低下时促使自身病毒的释放和复制，TTSuV还存在不同物种相互传播的潜在风险，免疫力低下和免疫缺陷的宿主跨种传播的风险更大[14-15]。我国猪群中TTSuV和PCV-2混合感染现象较为普遍[16]。本研究首次在藏猪呼吸道样本中检出TTSuV，检出率为0.84%(1/119)，检出率显著低于四川地区家猪血清样本中检出率(49.29%)[17]，推测与样本采集部位不同有关。本研究检测到3株TTSuV(SCgz-1、SCgz-2和SCgz-3)，遗传演化分析表明3株毒株均属于TTSuV k2型，其中SCgz-1为k2b型，SCgz-2和SCgz-3为k2a型。值得注意的是，3株TTSuV均来自同一个样本，表明该猪场存在不同亚型TTSuV毒株的混合感染。
Smacoviridae已在包括人在内的多种脊椎动物的粪便和部分昆虫上被发现[18-24]，现已鉴定发现的Smacoviridae基因长度为2 300~3 000 bp，在检出Smacoviridae的43个物种中，有28个物种中检出Porprismacovirus[11]。有报道秘鲁地区发现的人源Porprismacovirus毒株与美国灵长类动物上发现的毒株具有较近的遗传演化关系[25]，表明该病毒可能在多宿主之间广泛传播。本研究在藏猪呼吸道样本鉴定了1株Porprismacovirus SCgz-2022，通过基因序列分析表明，SCgz-2022与人源Porprismacovirus毒株序列具有高度的相似性(89.5%)，进一步重组分析表明该毒株为人源毒株和猪源Porprismacovirus毒株之间的重组而来的新型变异毒株，该重组方式在国际上未见报道。目前，该病毒尚未成功分离培养，对人和动物的致病性尚不清楚，但在多物种上均有检出，应予以关注。本研究的SCgz-2022株经检测存在于发病的肺脏样本中，而大多数Porprismacovirus是在粪便样本中发现[26-30]，也有在家畜的血清和鼻拭子中发现[31-32]。值得注意的是，在人上发现的Porprismacovirus是在胃肠炎等肠道疾病的腹泻样本中发现的[23, 33-36]，但该病毒与呼吸道疾病的发生是否有关系尚不确定，但可以作为参考将Porprismacovirus列为可能潜在的病原体。
4 结论本研究从藏猪呼吸道发病样本中鉴定到14个病毒科的16种病毒，可引起呼吸道疾病的相关病毒有PCV-2、TTSuV、PCMV和ASFV等。对组装出的病毒基因全长或近全长序列进一步分析表明，两株PCV-2属于PCV-2d亚型，3株TTSuV均属于k2型，其中SCgz-1属于k2b亚型，SCgz-2和SCgz-3属于k2a亚型。Porprismacovirus毒株为人源毒株和猪源毒株的重组毒株。本研究为国内首次报道猪源Porprismacovirus的存在，了解和丰富了我国藏猪呼吸道相关病毒的流行病学资料，为我国川西高原地区的藏猪呼吸道疾病的科学防控提供参考依据。
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(编辑 白永平)