畜牧兽医学报  2023, Vol. 54 Issue (9): 3793-3802. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2023.09.019    PDF    
引用本文
李倩倩, 林馨, 韦依琳, 崔昊宇, 邹荣华, 吴晓妮, 葛家振, 黄国梁, 张丽娟, 郑福英, 蔺国珍. RaeR对鸭疫里默氏杆菌外排泵RaeC-RaeA-RaeB的调控作用研究[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(9): 3793-3802.  
LI Qianqian, LIN Xin, WEI Yilin, CUI Haoyu, ZOU Ronghua, WU Xiaoni, GE Jiazhen, HUANG Guoliang, ZHANG Lijuan, ZHENG Fuying, LIN Guozhen. Study on the Role of RaeR in the Regulation of Efflux Pump RaeC-RaeA-RaeB of Rimerella anatipestifer[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2023, 54(9): 3793-3802.  
RaeR对鸭疫里默氏杆菌外排泵RaeC-RaeA-RaeB的调控作用研究
李倩倩1, 林馨1, 韦依琳1, 崔昊宇1, 邹荣华2, 吴晓妮2, 葛家振2, 黄国梁1, 张丽娟1, 郑福英2, 蔺国珍1     
1. 西北民族大学生命科学与工程学院, 兰州 730030;
2. 中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室, 兰州 730046
收稿日期：2022-10-26
基金项目：国家自然科学基金(32260882);中央高校基本科研业务费专项资金(31920220137)
作者简介：李倩倩(1997-), 女, 陕西宝鸡人, 硕士生, 主要从事细菌耐药机制、致病机制及诊断技术研究, E-mail: y200130610@outlook.com; 林馨(2003-), 女, 福建福州人, 本科生, 主要从事细菌耐药机制、致病机制及诊断技术研究, E-mail: 2371796023@qq.com.
李倩倩和林馨为同等贡献作者
通信作者：蔺国珍, 主要从事细菌耐药机制、致病机制及诊断技术研究, E-mail: lgzh18@163.com.
摘要：旨在阐明鸭疫里默氏杆菌RA-LZ01株GE296_RS05175基因编码的RaeR对外排泵RaeC-RaeA-RaeB的调控作用。构建RA-LZ01株的GE296_RS05160基因(编码内膜蛋白RaeB)缺失株ΔRaeB和回复株cΔRaeB, 以及GE296_RS05175基因缺失株ΔRaeR和回复株cΔRaeR。测定菌株的生长曲线、菌株对抗菌素的敏感性以及GE296_RS05160和GE296_RS05175基因在特异性底物刺激下的转录水平。结果显示, 与亲本株相比, 缺失株的生长能力无明显变化; 与亲本株和回复株相比, 缺失株ΔRaeB对卡那霉素、链霉素和十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)的敏感性上升, 而缺失株ΔRaeR对卡那霉素、链霉素和SDS的敏感性降低; 加入SDS刺激后, RA-LZ01和ΔRaeR株的GE296_RS05160基因的相对转录水平分别上升了2.26倍和4.64倍, ΔRaeR株中该基因的上调倍数明显超过了RA-LZ01株; 在SDS刺激下, RA-LZ01和ΔRaeB株的GE296_RS05175基因的相对转录水平均明显下调。上述结果表明, 外排泵RaeC-RaeA-RaeB与菌株的生长无明显相关性, 可介导菌株对卡那霉素、链霉素和SDS产生耐受; 底物SDS可刺激GE296_RS05175基因的转录水平降低, 该基因编码的RaeR对RaeB的表达发挥负向调控作用。
关键词：鸭疫里默氏杆菌    RaeB    RaeR    调控    
Study on the Role of RaeR in the Regulation of Efflux Pump RaeC-RaeA-RaeB of Rimerella anatipestifer
LI Qianqian1, LIN Xin1, WEI Yilin1, CUI Haoyu1, ZOU Ronghua2, WU Xiaoni2, GE Jiazhen2, HUANG Guoliang1, ZHANG Lijuan1, ZHENG Fuying2, LIN Guozhen1     
1. College of Life Science and Engineering, Northwest Minzu University, Lanzhou 730030, China;
2. State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, China
Corresponding author: LIN Guozhen, E-mail: lgzh18@163.com.
Abstract: The aim of this study was to clarify the role of RaeR encoded by GE296_RS05175 gene in the regulation of efflux pump RaeC-RaeA-RaeB of Rimerella anatipestifer RA-LZ01 strain. The GE296_RS05160 gene (encoding the inner membrane protein RaeB) deletion mutant ΔRaeB and complemented strain cΔRaeB of RA-LZ01 strain were constructed. Similarly, GE296_RS05175 gene deletion mutant ΔRaeR and its complemented strain cΔRaeR were constructed. The growth curves, antimicrobial susceptibility and transcription levels of GE296_RS05160 and GE296_RS05175 genes under specific substrate stimulation were measured. Compared with the parental strain, the growth abilities of the deletion mutants had no obvious change. By comparison with the parental strain and complemented strains, the sensitivity of ΔRaeB to kanamycin, streptomycin and (sodium dodecyl sulfate, SDS) were increased, while ΔRaeR showed the opposite results. After SDS stimulation, the relative transcription levels of GE296_RS05160 gene in RA-LZ01 and ΔRaeR strains increased 2.26 and 4.64 times, respectively. The upregulation of GE296_RS05160 gene in ΔRaeR strain was significantly higher than that in RA-LZ01 strain. Under SDS stimulation, the relative transcription levels of GE296_RS05175 gene in RA-LZ01 and ΔRaeB strains decreased significantly. These results indicated that the efflux pump RaeC-RaeA-RaeB had no significant correlation with the growth of RA-LZ01 strain, but could mediate the tolerance of the strain to kanamycin, streptomycin and SDS. The transcription level of GE296_RS05175 gene reduced under SDS pressure, and RaeR, which encoded by GE296_RS05175 gene, regulated the expression of RaeB negatively.
Key words: Rimerella anatipestifer    RaeB    RaeR    regulation    

鸭疫里默氏杆菌是一种革兰阴性菌，属于黄杆菌科，里默氏菌属，可导致鸭的浆膜炎，严重危害养鸭业生产，可造成重大经济损失[1]。该菌血清型众多，目前国际公认有21个血清型，各血清型之间缺乏交叉保护，给疫苗的有效预防带来了困难[2]。基于此，在实际生产中添加抗生素仍然是目前预防和治疗鸭疫里默氏杆菌感染的重要手段。伴随着抗生素的广泛应用，耐药菌株不断出现并播散，进一步增加了对鸭疫里默氏杆菌的防控难度[3]。为提高抗生素的应用效果，并对实际生产给予指导，需对鸭疫里默氏杆菌的耐药机制开展研究。

外排泵介导的主动外排是细菌产生耐药的重要机制。目前已报道了5种外排泵系统，分别是耐药结节细胞分裂超家族(resistance nodulation cell division family，RND)、主要易化子超家族(major facilitator superfamily，MFS)、小多重耐药家族(small multidrug resistance family，SMR)、多药和毒性化合物外排家族(multidrug and toxic compound extrusion family，MTE)和ABC转运蛋白家族(ATP binding cassette family)[4-5]。RND在革兰阴性菌中广泛存在，并且是发挥重要生物学功能的外排泵，由内膜蛋白(inner membrane protein，IMP)、外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)和周质膜融合蛋白(membrane fusion protein，MFP)构成三重外排复合体，有些含有调控子[6]。前期研究在鸭疫里默氏杆菌中鉴定了3个RND外排泵，包括RaeC-RaeA-RaeB(外排氨基糖苷类抗生素和去污剂)、RaeE-RaeF-RopN(外排氨基糖苷类抗生素和去污剂)和RaeX-RaeY-RopM(外排重金属离子)[7-9]。根据基因组注释，RaeC-RaeA-RaeB包含一个自身调控子RaeR，组合成RaeR-RaeC-RaeA-RaeB，对应于RA-LZ01基因组中的GE296_RS05175-GE296_RS05170-GE296_RS05165-GE296_RS05160。RaeR由GE296_RS05175基因编码，读码框大小为615 bp，编码204个氨基酸，蛋白大小约为22.44 ku。内膜蛋白RaeB由GE296_RS05160基因编码。

调控子可对RND外排泵的表达水平和功能发挥重要作用，目前对于RaeR对RaeC-RaeA-RaeB的调控作用还未见报道。本研究通过构建RaeR和RaeB的缺失株及回复株，并对亲本株RA-LZ01、缺失株和回复株进行药敏试验，测定菌株的生长速率，研究RaeR对RaeC-RaeA-RaeB的调控作用，进一步理解该外排泵的生物学功能。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 　　鸭疫里默氏杆菌RA-LZ01(GenBank登录号：NZ_CP045564.1)和LJW-2菌株由中国农业科学院兰州兽医研究所草食动物细菌病创新团队惠赠；大肠埃希菌ATCC25922购自美国菌种保藏中心(American type culture collection)；大肠埃希菌X7213和自杀质粒pRE112购自NTCC国家典型培养物保藏中心；穿梭质粒pCPRA由中国农业科学院兰州兽医研究所草食动物细菌病创新团队构建；Trans-1感受态细胞购自北京全式金公司。

1.1.2 培养基和试剂 　　胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)、胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)购自美国BD difcoTM公司；LB肉汤、琼脂粉和抗生素购自北京Solarbio公司；2, 6-二氨基更二酸(DPA)购自东京化成工业株式会社；限制性内切酶SacI、SphI、PstI，T4连接酶，质粒提取试剂盒以及胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司；细菌RNA提取试剂盒购自北京天根公司；0.22 μm无菌硝酸纤维素膜和过滤器购自美国Millipore公司；SYBR qPCR Master Mix和HiScriptΙΙ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)购自南京Vazyme生物科技有限公司。

1.1.3 主要设备 　　台式高速离心机购自Beckman公司；PCR热循环仪购自杭州博日科技公司；紫外分光光度计购自美国Backman公司；酶标仪购自美国Bio-Rad公司；CO2恒温培养箱购自美国Thermo公司；摇床购自上海苏坤实业有限公司；凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 引物 　　本研究中所用的引物、序列、退火温度及扩增的目的DNA片段见表 1，引物由西安擎科生物有限公司合成。

表 1 PCR引物名称、序列及扩增DNA片段 Table 1 PCR primers, sequences and target DNA fragments

1.2.2 构建GE296_RS05160和GE296_RS05175基因缺失株ΔRaeB和ΔRaeR 　　首先由武汉金开瑞生物工程有限公司合成用于GE296_RS05160(编码RaeB蛋白)和GE296_RS05175(编码RaeR蛋白)基因缺失的打靶片段。GE296_RS05160基因的打靶片段包含上游同源臂600 bp，ermF基因读码框801 bp，下游同源臂600 bp。GE296_RS05175基因的打靶片段包含上游同源臂600 bp，ermF基因读码框801 bp，下游同源臂586 bp。打靶片段上、下游同源臂两端分别加上SacI和SphI酶切位点。用SacΙ和SphΙ酶将打靶片段克隆进自杀质粒pRE112，重组质粒转化进大肠埃希菌X7213细胞中。参照文献[8-9]的方法，利用氯霉素抗性筛选供体菌，利用红霉素和多黏菌素B抗性筛选缺失株。缺失株构建具体流程详见图 1。用引物OmpA-F/OmpA-R、Erm-F/Erm-R和5160-F/5160-R对缺失株ΔRaeB进行PCR鉴定；用引物OmpA-F/OmpA-R、Erm-F/Erm-R和5175-F/5175-R对缺失株ΔRaeR进行PCR鉴定。

图 1 缺失株构建示意图 Fig. 1 Schematic representation of the deletion strain constructs

1.2.3 构建回复株cΔRaeB和cΔRaeR 　　以亲本株RA-LZ01株的基因组为模板，以引物5160-F/5160-R和5175-F/5175-R分别扩增GE296_RS05160和GE296_RS05175基因，用PstΙ和SphΙ内切酶将目的DNA片段分别克隆进穿梭质粒pCPRA，得到回复重组质粒，并将重组质粒转化进X7213菌株。参照文献[8-9]的方法，用氨苄青霉素抗性筛选供体菌，用头孢西丁抗性筛选回复株，并用引物OmpA-F/OmpA-R和5160-F/5160-R，以及OmpA-F/OmpA-R和5175-F/5175-R引物对分别对回复株进行PCR鉴定，得到的回复株分别命名为cΔRaeB和cΔRaeR。

1.2.4 测定菌株的生长曲线 　　将亲本株RA-LZ01和缺失株ΔRaeB、ΔRaeR分别增菌至OD600 nm约为1.0，以10倍系列稀释至10-9，取10-7、10-8和10-9三个浓度梯度的菌液涂布TSA平板，每个样本做3个重复，计算每个菌株的菌落形成单位(CFU)。取108 CFU·mL-1的菌种，接种至10 mL TSB中，将培养物以37 ℃、200 r·min-1培养，每隔1 h取130 μL菌液用紫外分光光度计测量其OD600 nm值，共测定12 h。每个菌株做3组平行试验[9]，利用GraphPad Prism 6.0软件中的One-way ANOVA对每一个时间点的OD600 nm值进行统计学分析。

1.2.5 测定菌株MIC 　　参照文献[10]，将菌株增菌至OD600 nm约为1.0，通过微量肉汤稀释法测定菌株对抗生素的最小抑菌浓度(MIC)，大肠埃希菌ATCC25922作为质控菌株。抗生素的浓度范围为1 024~0.062 5 mg·L-1，同时设置阴性对照(培养基)和阳性对照(菌液)。96孔板中每孔加入100 μL稀释好的菌液(含有106 CFU)。37 ℃、5% CO2培养箱中培养24~48 h，在酶标仪中测量其OD600 nm值，确定抗生素抑制菌株生长的MIC。试验重复3次。

1.2.6 点板试验 　　依据菌株的MIC，选出抗生素，并确定其浓度。参照文献[9]，将经121 ℃、20 min高压的TSA培养基冷却至40 ℃左右，加入选定的合适浓度的抗菌素，制备TSA平板。将新鲜菌液以1 ∶100比例重新转接后，增菌至OD600 nm约1.0，稀释至10 CFU·mL-1，取106~10 CFU·mL-1的菌液，每个菌液样本取5 μL进行点板，将培养板在含5% CO2，37 ℃恒温培养箱培养18~24 h，观察细菌生长状况。

1.2.7 实时定量RT-PCR 　　对亲本株RA-LZ01和缺失株ΔRaeB、ΔRaeR培养至OD600 nm约为1.0，培养过程中一份RA-LZ01菌液不添加SDS，另外一份RA-LZ01和缺失株ΔRaeB、ΔRaeR菌液添加4 mg·L-1的SDS。提取RA-LZ01和ΔRaeR的总RNA, 用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，作为模板备用。实时定量RT-PCR反应体系为20 μL，反应条件：95 ℃ 30 s预变性，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40次循环。以特异性引物GAPDH-F/GADPH-R、q5160-F/q5160-R和q5175-F/q5175-R分别扩增GAPDH、GE296_RS05160和GE296_RS05175基因的靶标片段，其中GADPH基因作为内参。通过2-△△Ct方法计算相对基因表达量，并利用GraphPad Prism 6.0软件中的One-way ANOVA进行差异性分析。*P＜0.05表示差异显著；**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.000 1，表示差异极显著。

2 结果 2.1 基因缺失株ΔRaeB和ΔRaeR的构建

以菌液为模板，经PCR鉴定，引物OmpA-F/OmpA-R扩增出1 119 bp大小的目的条带；引物Erm-F/Erm-R扩增出801 bp大小的ermF基因，引物5160-UF/5160-DR扩增到2 038 bp大小的DNA片段，经测序确认为打靶片段；引物5160-F/5160-R未扩增到目的片段(图 2A)。以上结果说明菌株为鸭疫里默氏杆菌，并且ermF基因替换了GE296_RS05160基因，缺失株ΔRaeB构建成功。对缺失株ΔRaeR的PCR鉴定结果显示，引物OmpA-F/OmpA-R和Erm-F/Erm-R均扩增到合适大小的目的条带，5175-UF/5175-DR扩增到2 026 bp大小的DNA片段，经测序确认为打靶片段；5175-F/5175-R未扩增出目的片段(图 2B)，说明ermF基因成功替换了GE296_RS05175基因，ΔRaeR菌株构建成功。

A. 缺失株ΔRaeB的鉴定；B. 缺失株ΔRaeR的鉴定；M. DL2000 DNA Marker；1. OmpA-F/OmpA-R引物扩增(1 119 bp)；2. Erm-F/Erm-R引物扩增(801 bp)；3. 5160-UF/5160-DR(A，2 038 bp)和5175-UF/5175-DR(B，2 026 bp)引物扩增；4. 5160-F/5160-R(A，3 156 bp)和5175-F/5175-R(B，615 bp)引物扩增 A. Identification of the deletion mutant ΔRaeB; B. Identification of the deletion mutant ΔRaeR; M. DL2000 relative molecular mass standard; 1. PCR amplification with OmpA-F/OmpA-R primers (1 119 bp); 2. PCR amplification with ErmF/ErmF primers (801 bp); 3. PCR amplification with 5160-UF/5160-DR primers (A, 2 038 bp) and 5175-UF/5175-DR primers (B, 2 026 bp); 4. PCR amplification with 5160-F/5160-R primers (A, 3 156 bp) and 5 175-F/5175-R primers (B, 615 bp) 图 2 缺失株ΔRaeB和ΔRaeR的鉴定 Fig. 2 Identification of the deletion mutants ΔRaeB and ΔRaeR
2.2 回复株cΔRaeB和cΔRaeR的构建

以菌液为模板，用引物OmpA-F/OmpA-R和5160-F/5160-R分别扩增出1 119 bp和3 156 bp的目的片段(图 3A)，说明回复株cΔRaeB构建成功。以引物OmpA-F/OmpA-R和5175-F/5175-R分别扩增出1 119 bp和615 bp的目的片段，说明回复株cΔRaeR构建成功(图 3B)。

A. 回复株cΔRaeB的鉴定；B. 回复株cΔRaeR的鉴定；M. DL2000 DNA Marker；1. OmpA-F/OmpA-R引物扩增(1 119 bp)；2. 5160-F/5160-R(A，3 156 bp)和5175-F/5175-R(B，615 bp)引物扩增 A. Identification of the complemented strain cΔRaeB; B. Identification of the complemented strain cΔRaeR; M. DL2000 relative molecular mass standard; 1. PCR amplification with OmpA-F/OmpA-R primers (1 119 bp); 2. PCR amplification with 5160-F/5160-R primers (A, 3 156 bp) and 5175-F/5175-R primers (B, 615 bp) 图 3 回复株cΔRaeB和cΔRaeR的鉴定 Fig. 3 Identification of the complemented strains cΔRaeB and cΔRaeR
2.3 菌株的生长速率

为确定GE296_RS05160和GE296_RS05175基因的缺失是否影响菌株的生长速率，测定了亲本株RA-LZ01和缺失株ΔRaeB和ΔRaeR在12 h的OD600 nm值，每次测定间隔1 h。依据测定的OD600 nm值绘制了菌株的生长曲线。结果表明，与亲本株RA-LZ01相比，缺失株ΔRaeB和ΔRaeR的生长速率没有发生明显变化，每个时间点的OD600 nm值均无统计学差异，说明GE296_RS05160和GE296_RS05175基因对菌株的生长无显著影响(图 4)。

图 4 亲本株RA-LZ01和缺失株ΔRaeB、ΔRaeR的生长曲线 Fig. 4 Growth curves of parental strain RA-LZ01, deletion mutants ΔRaeB and ΔRaeR
2.4 MIC测定

测定了11类、27种抗菌素对亲本株RA-LZ01、缺失株ΔRaeB和ΔRaeR、回复株cΔRaeB和cΔRaeR的MIC值。结果表明，GE296_RS05160基因灭活后，仅氨基糖苷类的链霉素和卡那霉素以及去污剂类的SDS的MIC发生了改变，分别降低至1/2、1/2和1/8，并且回复株恢复到了和亲本株相同的水平；而GE296_RS05175基因缺失后，菌株对链霉素、卡那霉素的MIC值无变化，而对SDS的MIC值增加了2倍。其他抗菌药物的MIC值均无变化。具体结果如表 2所示。

表 2 抗菌药物对鸭疫里默氏杆菌亲本株、缺失株及回复株的MICs Table 2 MICs of antimicrobial agents to R. anatipestifer wild strain, deletion mutants and complemented strains 
2.5 点板试验

MIC试验结果显示，只有链霉素、卡那霉素和SDS对缺失株ΔRaeB和ΔRaeR的MIC发生改变，并且链霉素、卡那霉素只降至亲本株的1/2，而SDS降至亲本株的1/8。因此，选择差异较大的SDS进行点板试验，进一步验证GE296_RS05160基因在外排SDS中的作用及GE296_RS05175基因对该外排泵的调控作用。结果显示，在8 mg·L-1的SDS浓度下，与亲本株RA-LZ01株相比，缺失株ΔRaeB对SDS的敏感性显著升高，而缺失株ΔRaeR对SDS的敏感性有所降低，回复株cΔRaeB和cΔRaeR基本恢复了对SDS的耐受水平(图 5)。

图 5 菌株对SDS的敏感性 Fig. 5 Sensitivity of the strains to SDS
2.6 实时定量RT-PCR

对实时定量RT-PCR的结果进行分析后，以亲本株GE296_RS05160基因相对转录水平为1，发现在添加4 mg·L-1的SDS后，亲本株GE296_RS05160基因的相对转录水平升高至2.26，而ΔRaeR的GE296_RS05160基因的相对转录水平升高至4.64(图 6)。与此结果相反，亲本株和ΔRaeB的GE296_RS05175基因的相对转录水平分别下降至0.36和0.35(图 6)。

A. RA-LZ01和ΔRaeR菌株在SDS作用下GE296_RS05160基因的相对转录水平；B. RA-LZ01和ΔRaeB菌株在SDS作用下GE296_RS05175基因的相对转录水平；****P＜0.000 1，差异极显著 A. The relative transcriptional levels of GE296_RS05160 gene of RA-LZ01 and ΔRaeR strains treated with SDS; B. The relative transcriptional levels of GE296_RS05175 gene of RA-LZ01 and ΔRaeB strains treated with SDS; ****P < 0.000 1, the differences are highly significant 图 6 GE296_RS05160和GE296_RS05175基因的相对转录水平 Fig. 6 The relative transcriptional levels of GE296_RS05160 and GE296_RS05175 genes
3 讨论

RND是一种在革兰阴性菌中广泛存在的外排泵，目前的研究已在多种细菌中鉴定到RND外排泵，研究的比较清晰、深入的包括大肠埃希菌、沙门菌和铜绿假单胞菌的RND外排泵，包括大肠埃希菌的AcrB、AcrD、AcrF、CusA等[11-14]；沙门菌的AcrB、AcrD、AcrF等[15-17]；铜绿假单胞菌的MexB、MexD、MexF、MexY等[18-21]。外排底物是RND外排泵的重要生物学功能，并且这些外排泵有非常广泛的底物谱，包括多种抗菌素、重金属离子、胆汁、肠杆菌素、游离脂肪酸、激素等。除了外排底物，RND外排泵还可发挥其他多种生物学功能，包括维持细胞分裂和生长、毒力、新陈代谢、生物膜形成等[11-21]。

鉴于RND外排泵的多种重要的生物学功能，其表达水平受到多种调控子的严格调控。如大肠埃希菌的经典RND外排泵AcrAB-tolC，受到AcrR、MarA、MarB、MarC、SdiA等调控子的正向或负向调控[22]；AcrD受到BaeSR和CpxAR双组分系统的调控[23]；AcrS和H-NS分别对AcrEF进行负调控以及正调控[24]。对于沙门菌的RND外排泵，RamA、RamR、AcrR、MarA以及SoxS等调控子对AcrAB发挥调控作用[22]；双组分系统BaeSR和CpxAR调控AcrD的表达[23]；AcrEF受到双组分系统AcrS和H-NS的调控[25-26]。铜绿假单胞菌含有多个RND外排泵，鉴定到MexR、NalC、NalD、RocS1/S2-A2等二十多个调控因子和双组分系统[6]。

目前对于鸭疫里默氏杆菌的RND外排泵研究的较少，只鉴定到3个RND外排泵系统，包括外排氨基糖苷类抗生素和去污剂的RaeC-RaeA-RaeB和RaeE-RaeF-RopN，外排重金属离子的RaeX-RaeY-RopM，其中内膜蛋白为RaeB、RaeF和RaeY，周质膜融合蛋白为RaeA、RaeE和RaeX，外膜蛋白为RaeC、RopN和RopM[7-9]。目前研究仅初步鉴定了上述外排泵的外排底物、与菌株生长和毒力相关的生物学表型，对于调控其表达水平的调控子还未见报道。根据基因组注释，RaeC-RaeA-RaeB有一个属于TetR/AcrR家族的调控子RaeR，本研究对该调控子是否对RaeB发挥调控作用进行了验证。

首先对菌株的生长能力进行了检测。亲本株、缺失株ΔRaeB和ΔRaeR在12 h内的生长曲线无明显差异，说明RaeC-RaeA-RaeB外排泵与菌株的生长能力无明显相关性，也保证了缺失株ΔRaeB和ΔRaeR其他生物学表型的改变不是由生长速率改变而引起。

前期研究表明，以RA CH-1作为亲本株，RaeC-RaeA-RaeB可以外排氨基糖苷类的庆大霉素、链霉素、卡那霉素，去污剂SDS和Triton X-100。本研究以RA-LZ01作为亲本株，缺失株ΔRaeB仅对链霉素、卡那霉素和SDS的敏感性上升，并且链霉素和卡那霉素的MIC值只减小至1/2，SDS的MIC值减小至1/8。这种差异应该是由于亲本株不同引起的，不同的菌株有不同的耐药表型。缺失株ΔRaeR与ΔRaeB相反，表现为对链霉素、卡那霉素和SDS的敏感性降低。点板试验进一步验证了这种表型改变。这些结果说明RaeR对RaeB外排底物有负向调控作用。

对亲本株和缺失株ΔRaeR的GE296_RS05160基因的相对转录水平进行了检测。在添加SDS后，亲本株GE296_RS05160基因的相对转录水平升高，而ΔRaeR的GE296_RS05160基因的相对转录水平显著上升。进一步对亲本株和ΔRaeB的GE296_RS05175基因的相对转录水平进行检测，当受到SDS刺激时，亲本株和缺失株ΔRaeB中该基因的转录水平均明显下降。这些结果表明，底物SDS促使GE296_RS05175基因的转录水平下调，GE296_RS05175基因对GE296_RS05160基因的转录发挥负向调控作用。

4 结论

GE296_RS05160基因编码的RaeB和GE296_RS05175基因编码的RaeR与鸭疫里默氏杆菌RA-LZ01株的生长无明显相关性；与菌株对链霉素、卡那霉素和SDS的耐受性相关。药物敏感性试验和实时定量PCR试验结果表明，RaeR对RaeB的表达发挥负向调控作用。

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(编辑   范子娟)