, ZHAO Jiamin, GU Baichen, REN Peipei, YU Zhuoya, BAI Yunjie, LIU Xinyu, WANG Chao, LIU Bo
党参(Codonopsis pilosula)具有补中益气、生津、胃和健脾益肺等功效，是我国传统的补益药之一[1]。党参多糖(Codonopsis pilosula polysaccharide，CPPS)是从中药党参中提取的主要生物活性化合物之一[2]。其具有广泛的生物活性和药理作用，包括调节细胞和体液免疫、抗炎、抗病毒、抗肿瘤和抗氧化。中医药具有以整体观和辨证论治为特色的理论体系和几千年的临床实践经验，随着医学与生命科学研究逐渐步入大数据时代。网络药理学应运而生从整体的角度探索药物与疾病间的关联性[3]。目前，网络药理学已成为中医药研究领域的热点和前沿。
急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是由直接或间接肺损伤引起的炎症反应，是一种剧烈的肺部炎症反应，表现为中性粒细胞聚集、间质水肿、上皮完整性破坏、蛋白渗入肺泡间隙和炎性细胞因子水平升高等[4]。重症则为急性呼吸窘迫综合征，可导致多器官衰竭, 致死率高达30%~50%，特征是炎性细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)的释放及炎性细胞的流入和活化[5-6]。大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)所致感染性肺损伤的病理生理变化，与常见吸入性肺损伤所致ALI的发病过程相似[7]。大量研究表明，大肠杆菌菌体成分LPS和大肠杆菌均可诱导小鼠ALI的发生[8-10]。LPS吸入是小鼠ALI的成熟试验模型，其特征是肺组织/支气管肺泡灌洗液中急性中性粒细胞积累和肺水肿[11]。但党参对防治急性肺损伤的作用机制目前尚不清楚。
本研究采用网络药理学的方法，对党参防治急性肺损伤进行有效成分的预测和靶点的挖掘，并从蛋白互作、分子功能，生物学过程和相关通路多角度挖掘党参对防治急性肺损伤的潜在作用机制。使用大肠杆菌建立ALI小鼠模型，对相关的信号通路激活和细胞因子分泌情况进行验证，并通过免疫荧光和HE染色对肺损伤进行评估。因此，该机制阐明可为兽医临床应用党参来防治由细菌感染所致的急性肺损伤和相关新兽药的研发提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 主要试剂、药品及抗体本研究使用的CPPS由内蒙古农业大学兽医学院高珍珍博士馈赠，CPPS的结构表征(分子量5.3~230.6 ku)，主要由Gal、Ara和Glu组成[12]。IL-1β和TNF-α的ELISA试剂盒均购自Biolegend公司；胎牛血清(FBS)购自ExCell Biology公司；RPMI 1640培养基和磷酸盐缓冲液(PBS)均购自HyClong公司；无酶水(DNase/RNase-Free Deionized Water)购自Tiangen公司；牛血清白蛋白(BSA)购自BD Biosciences公司；酵母提取物(yeast extract)和胰蛋白胨(tryptone)均购自Oxoid公司；吐温-20(Tween-20)购自Solarbio公司；兔抗高迁移率族蛋白B1(HMGB1/HMG1)购自NOVUSBIO公司；GAPDH抗体和山羊抗兔(Alexa Fluor 488)二抗均购自Abcam公司；组织裂解液购自Thermo Scientific公司；p65、P-p65、p38、P-p38、ERK和P-ERK抗体均购自Cell Signaling Technology公司，HRP标记山羊抗兔二抗购自Affinity Biosciences公司。
1.2 细菌培养野生型大肠杆菌(鉴定证书号SYS110017)由本课题组分离鉴定保存。将在-80 ℃低温保存的菌液在4 ℃环境中融化后，转移至100 mL已灭菌的LB肉汤培养基中，在37 ℃，200 r·min-1于恒温摇床中连续培养12 h。根据本课题组前期研究数据，使用酶标仪检测菌液600 nm波长处的吸光值大约为0.9时，表明其处于对数生长期。将菌液混匀后取1 mL置于无菌无酶离心管中，3 000 r·min-1离心6 min，弃掉上清，用无菌PBS溶液重悬菌液3次，最后使用1 mL PBS缓冲液重悬细菌，4 ℃保存备用[13]。
1.3 党参有效成分和靶点的获取及靶点网络关系图的构建本研究利用中药系统药理学分析平台TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/index.php)检索词“党参”，以口服利用度≥30%，类药性≥0.18进行初步筛选后，再按Lipinsk五原则相对分子质量≤500，氢给体数目＜5，氢受体数目＜10，脂水分配系数＜5进行再次筛选。通过Uniprot(https://www.uniprot.org/)和PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取TCMSP数据库筛出的活性成分所对应的靶点。将筛选好的活性成分及其靶点输入Cytoscape中，构建党参的“中药-化合物-靶点”网络图。
1.4 急性肺损伤靶点的获取及关键靶点筛选以“acute lung injury”为检索词，使用GeneCards(https://www.genecards.org/)和DisGeNET(https://www.disgenet.org/)数据库进行检索，得到急性肺损伤的相关靶点，使用微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)绘制韦恩图将党参活性成分的靶点与急性肺损伤的靶点取交集，将交集靶点导入STRING(https://cn.string-db.org/)数据库，选择物种“Homo sapiens”，将最低交互要求分数设置为置信度大于0.700，且隐藏网络中断开连接的节点，构建PPI网络图。
1.5 GO富集及KEGG分析将党参与急性肺损伤的交集靶点导入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)数据库，选择物种“Homo sapiens”随后得到GO富集和KEGG通路，运用微生物平台进行可视化分析。
1.6 实验动物及分组本试验所用实验动物为C57BL/6J小鼠购自内蒙古大学实验动物中心，本研究选用8周龄，体重23 g±2 g。随机将小鼠分组，每组10只，即阴性对照组(uninfected)、E.coli感染组、CPPS(40、100或250 mg·kg-1)+E.coli处理组、地塞米松(DEX)+E.coli阳性对照组。体内试验感染前1 h腹腔注射CPPS(40、100、250 mg·kg-1)，地塞米松(0.5 mg·kg-1)。菌液用PBS洗涤3次，重悬备用，鼻腔滴注30 μL菌液，大肠杆菌感染12 h后处死小鼠，收集肺，将肺组织研磨后取上清。体外细胞试验巨噬细胞使用CPPS(6.25、12.5、25、50 μg·mL-1)预处理1 h后，使用大肠杆菌感染巨噬细胞(MOI 5∶1)，感染1 h后，使用PBS清洗3次，随后用含有10 mg·mL-1卵清蛋白和20 U·mL-1干扰素的新鲜培养基清洗细胞3次，再用PBS清洗3次，培养至24 h收集上清。按照ELISA试剂盒说明书检测组织和细胞上清中的TNF-α和IL-1β的水平。
1.7 小鼠腹腔巨噬细胞培养和试验处理小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养方法基于本课题组先前的研究[14]。小鼠腹腔注射3% TG培养基2 mL。腹腔注射3% TG培养基3 d后处死小鼠。沿腹部中线将小鼠皮肤组织剪开，暴露腹膜。用无菌PBS缓慢注射到小鼠腹腔并晃动小鼠2 min，随后吸取小鼠腹腔灌注液，直至吸取得腹腔灌注液澄清透明。将腹腔灌注液1 000 r·min-1离心5 min后弃掉上清，用无菌PBS进行重悬细胞，重复此步骤3次。用含10% 胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞，并将细胞浓度调至5×106·孔-1，置于5% CO2，温度37 ℃细胞培养箱中培养过夜。
1.8 总蛋白提取和Western blot分析将巨噬细胞使用CPPS(6.25、12.5、25、50 μg·mL-1)预处理1 h后，使用大肠杆菌感染巨噬细胞(MOI 5∶1)，感染时间15和30 min。随后进行总细胞蛋白提取，用200 μL M-PER处理巨噬细胞10 min后使用细胞刮刀收获贴壁细胞。用BCA试剂盒测定蛋白样品的浓度。Western blot分析采用12% SDS聚丙烯酰胺凝胶，电泳时每泳道总蛋白10 μg。随后进行膜转印。随后用含3% BSA的封闭液封闭PVDF膜4 h，然后在4 ℃条件下孵育一抗14 h。一抗稀释比例如下：p65、P-p65、p38、P-p38、ERK和P-ERK稀释比例均为1∶1 000，GAPDH稀释比例1∶10 000。一抗孵育完成后，用TBST缓冲液清洗3次，室温孵育兔二抗(1∶3 000稀释)1 h。然后用TBST清洗3次。用化学发光底物和化学发光成像系统进行图像的采集，通过Image J软件对试验结果灰度值进行分析。
1.9 免疫荧光检测和形态学观察采集小鼠肺在液氮中速冻，-80 ℃保存，修块，用OTC包埋剂将修好的组织块包埋，冰冻切片机切片，厚度为6~10 μm，4或-20 ℃保存，切片放置室温15 min干燥，冷丙酮固定10 min，冷PBS洗2次，每次5 min，用5%的BSA封闭1 h，吸除多余的液体，4 ℃孵育HMGB1抗体过夜。次日，用含PBST洗3次，每次5 min，室温孵育荧光二抗1 h，用含PBST洗3次，每次5 min。随后使用激光共聚焦显微镜采集荧光强度。收集小鼠肺制备石蜡切片，用不同浓度的酒精(100%、75%、50%和25%)脱水。苏木精、伊红(H&E)染色后，扫描观察肺病理变化。
1.10 统计分析所有数据使用GraphPad Prism 8软件统计并进行差异性分析(3次重复试验数据“x±s”，One-Way ANOVA)，以*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001表示与大肠杆菌组相比较，以#.P<0.05表示与空白对照组相比较。
2 结果 2.1 党参的活性成分及靶点从TCMSP数据库中共筛选出8种符合要求的活性化学成分，如表 1所示。同时找到党参活性成分对应靶点对应的急性肺损伤靶点交集119个，运用Cytoscape软件构建网络图，如图 1所示。
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表 1 党参的主要活性成分 Table 1 Main active components of Codonopsis pilosula |
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红色椭圆. 党参；绿色三角. 党参活性成分；橙色方形. 靶点 Red oval. Codonopsis pilosula; Green triangle. Codonopsis pilosula active compound; Orange square. Target 图 1 党参“中药-化合物-靶点”网络 Fig. 1 Codonopsis pilosula "traditional Chinese medicine-compound-target" network |
通过疾病相关数据库筛选出1 522个与急性肺损伤相关的靶点，其中与党参的交集靶点共119个，并绘制PPI图发现党参与急性肺损伤的靶点与NF-κB、MAPK和TLR4之间存在紧密关联，如图 2所示。
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图 2 党参治疗急性肺损伤的潜在靶点及PPI网络分析 Fig. 2 Potential target and PPI network analysis of Codonopsis pilosula in treating ALI |
通过富集筛选与急性肺损伤相关的生物过程和分子功能，结果如图 3所示。生物过程主要包括肽基酪氨酸磷酸化，跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路，蛋白质磷酸化，MAPK级联的正调控，激酶活性正调控和蛋白质自磷酸化等。此外，分子功能主要包括跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性，蛋白酪氨酸激酶活性，ATP结合和蛋白激酶活性等。KEGG通路富集分析表明，NF-κB信号通路、MAPK信号通路和TNF信号通路等信号通路在党参治疗中发挥关键作用。
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图 3 党参治疗急性肺损伤GO和KEGG富集分析 Fig. 3 Enrichment analysis of GO and KEGG in ALI treated with Codonopsis pilosula |
探究CPPS对大肠杆菌诱导的巨噬细胞中MAPK和NF-κB信号通路激活的影响，以及对促炎性细胞因子TNF-α和IL-1β分泌水平的影响。结果表明，大肠杆菌感染可诱导巨噬细胞分泌高水平的TNF-α和IL-β，如图 4所示。CPPS(6.25、12.5、25和50 μg·mL-1)预处理均能降低大肠杆菌感染后巨噬细胞TNF-α和IL-1β的分泌。此外，与大肠杆菌感染后15和30 min相比，CPPS预处理组ERK、p65和p38磷酸化水平明显降低，如图 4所示。上述结果表明在大肠杆菌感染过程中，CPPS可影响巨噬细胞MAPK信号通路中p38和ERK以及NF-κB信号通路中p65的激活，以及促炎性细胞因子和趋化因子的分泌。
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与大肠杆菌组相比，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001；与空白对照组相比，#.P<0.05 Compared with the Escherichia coli group, *.P<0.05, **.P<0.01, ***.P<0.001; Compared with the blank control group, #.P<0.05 图 4 党参多糖对大肠杆菌诱导巨噬细胞中MAPK和NF-κB信号通路激活及炎症因子分泌的影响 Fig. 4 Effect of CPPS on activation of MAPK and NF-κB signaling pathways and secretion of inflammatory factors in E.coli-infected macrophages |
CPPS预处理C57BL/6J野生型小鼠后，检测炎性细胞因子TNF-α和IL-1β分泌的情况。如图 5所示，CPPS预处理可显著下调大肠杆菌感染诱导的小鼠肺中TNF-α、IL-1β的产生。上述结果表明, CPPS可降低大肠杆菌感染诱导的炎性细胞因子的产生，且具有剂量依赖性。
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与大肠杆菌组相比，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001；与空白对照组相比，#.P<0.05 Compared with the Escherichia coli group, *.P<0.05, **.P<0.01, ***.P<0.001; Compared with the blank control group, #.P<0.05 图 5 CPPS对大肠杆菌感染诱导的小鼠体内炎性细胞因子TNF-α和IL-1β产生中的影响 Fig. 5 Effect of CPPS on the production of inflammatory cytokines TNF-α and IL-1 β in E.coli-infected mice |
C57BL/6J小鼠腹腔注射CPPS预处理后, 用1×108 CFU大肠杆菌鼻腔滴注小鼠后取肺组织，检测小鼠肺中HMGB1的表达情况，如图 6所示。相比于未处理组，使用CPPS处理组小鼠在大肠杆菌感染时肺组织的荧光强度中位数较低，提示HMGB1表达处于较低水平。此外，通过HE染色结果可观察到对照组小鼠肺基本正常, 未见明显病理变化，而大肠杆菌感染组病变较为严重，表现为大部分肺泡间质变宽，有的区域可见大量中性粒细胞渗出，当使用CPPS预处理后, 再使用大肠杆菌感染肺损伤程度显著下调，表现为部分区域肺泡间质稍有增宽，轻度淤血。上述结果表明, CPPS可下调大肠杆菌感染诱导的肺中HMGB1的表达并可减轻肺的损伤。
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与大肠杆菌组相比，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001;与空白对照组相比，#.P<0.05 Compared with the Escherichia coli group, *.P<0.05, **.P<0.01, ***.P<0.001; Compared with the blank control group, #.P<0.05 图 6 CPPS对大肠杆菌诱导损伤标记物HMGB1蛋白表达和肺病理损伤的影响 Fig. 6 Effect of CPPS on the expression of HMGB1 injury marker protein induced by E.coli and lung pathological injury |
急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是一种严重的呼吸系统疾病，目前缺乏有效的治疗方法导致死亡率较高[15-16]。ALI的特征是肺间隙和肺实质中无法控制的高炎症反应，包括肺泡毛细血管膜损伤、血管通透性增加和中性粒细胞募集增多[17]。党参作为一种常用中药具有补中益气和健脾益肺的功效[18]。研究表明，党参在防治慢性阻塞性肺，呼吸窘迫综合征和间质性肺病等肺部相关疾病具有重要作用[19-21]。但党参对ALI的作用目前尚不清楚，因此本研究通过网络药理学和分子生物学试验相结合的方式探究党参对ALI的作用机制，以期为兽医临床防治急性肺损伤及相关新兽药的研发提供理论依据。
本研究发现党参发挥作用的网络中核心靶点主要包括PTGS1、PTGS2、IL2、PDGFRA、JAK3、JAK2、JAK1、CXCR1、CXCR2、NOS1、TGFBR1、MIF、TLR4、TLR9、ZAP70、MAPK1、MAPK8、MAPK10、MAPK14、MAP2K1、NFKB1、HSP90AA1、PPARA、MPO、PLG等。前列腺素在炎症反应的产生中起着关键作用，在炎症组织中的生物合成显著增加，并有促进急性炎症的发展，因此被认为是一种高效的炎性介质[22]。PTGS1和PTGS2基因编码的环加氧酶COX-1和COX-2催化前列腺素合成的速率限制步骤，这是炎症的关键调节因子[23]。众所周知, Janus激酶(JAK1、JAK2和JAK3)是多种细胞因子信号通路的重要介质，存在于正常的细胞过程和免疫介导的炎症[24]。大量研究表明, 白细胞介素-8(CXCL8/IL-8)受体趋化因子受体1型(CXCR1)和趋化因子受体2型(CXCR2)可作为ALI的潜在治疗靶点[25]。MIF参与了LPS诱导的ALI的发病机制，可能是ALI的治疗靶[26]。哺乳动物细胞中，有4组主要的传统MAPKs信号通路ERK1/2(分别称为MAPK3和MAPK1)、ERK5、JNKs(JNK1、JNK2和JNK3)分别称为(MAPK8、MAPK9和MAPK10)和p38 MAPKs (p38alpha、p38beta、p38gamma和p38delta分别称为(MAPK14、MAPK11、MAPK12和MAPK13)[27]。MPO参与了包括在ALI内的多种疾病，如严重脓毒症和ARDS。综上所述，本文通过网络药理学方法得到的核心基因可从调节炎症反应、炎症信号通路相关基因表达等方面在急性肺损伤过程中发挥关键作用。
通过GO和KEGG富集分析发现，党参防治急性肺损伤的靶基因主要参与MAPK级联活化密切相关、膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白质结合和ATP结合等相关生物功能，而且相关靶基因主要富集在MAPK、NF-κB和TNF等信号通路中。研究表明，包括ALI在内的各种炎症性疾病均涉及巨噬细胞通过NF-κB或MAPK信号通路介导细胞因子(如TNF-α、IL-6和IL-1β)，以及炎症介质(如NO和PGE2)表达[28]。然而，党参是否通过以上关键通路调节急性肺损伤，还有待进一步的验证。
大量研究表明，大肠杆菌感染可诱导ALI[9]。本研究使用大肠杆菌感染建立小鼠ALI模型。CPPS是党参提取的一种多糖，具有广泛的生物活性和药理作用，包括免疫调节、清除自由基、造血等[12, 29]。CPPS在炎症反应、疾病的预防和治疗等方面被广泛应用[30]。研究表明, 在大肠杆菌感染过程中可激活MAPK和NF-κB信号通路进而介导炎症介质的分泌[31]。CPPS对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子分泌具有调控作用，且可减轻了葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎的临床症状[32]。
上述网络药理学研究结果表明，NF-κB或MAPK信号通路在急性肺损伤中具有重要作用，因此通过Western blot检测CPPS对大肠杆菌诱导MAPK和NF-κB信号通路激活的影响。结果表明，CPPS可减弱大肠杆菌感染诱导的MAPK(p38和ERK)和NF-κB(p65)的激活。MAPK和NF-κB信号通路激活减弱预示炎症反应转归[33]。此外，当细胞破损HMGB1释放到细胞外可引起炎症，并刺激先天免疫细胞迁移和激活，因此将其作为组织损伤相关分子模式成员之一[34]。在ALI发生是促炎反应的增加和抗炎反应的减少，大量的炎症细胞因子(如IL-6和TNF-α)被分泌出来，导致细胞因子风暴的发展，从而导致呼吸衰竭[35]。结果表明，CPPS可降低肺中TNF-α和IL-1β的分泌以及HMGB1的表达，因此CPPS对大肠杆菌感染所致急性肺损伤具有保护作用。
4 结论党参可通过下调MAPK(p38和ERK)和NF-κB(p65)炎症信号通路的激活对TNF-α和IL-1β的分泌进行调控，从而降低肺的损伤程度及病理变化。此外，党参多糖对大肠杆菌诱导的急性肺损伤具有较好的防治作用，但具体作用机制还需进一步研究。
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(编辑 白永平)