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小反刍兽疫(peste des petits ruminants, PPR)是由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)引起山羊、绵羊等小反刍兽的一种急性、热性、接触性传染病[1]，是世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health，OIE)法定报告的动物传染病，我国规定为Ⅰ类动物疫病[2]。PPRV是单股负链不分节段的有囊膜RNA病毒，绝大多数PPRV的核苷酸总数为15 948 nt[3]，病毒基因组从3′至5′依次分布着N-P-M-F-H-L 6个基因，共编码6种结构蛋白，即核衣壳蛋白(nucleoprotein, N)、磷蛋白(phosphoprotein, P)、基质蛋白(matrixprotein, M)、融合蛋白(fusion protein, F)、血凝素蛋白(hemagglutinin protein, H)、大蛋白(large protein, L)，此外PPRV P基因有两个重叠的开放性阅读框，可编码病毒结构蛋白P和非结构蛋白C、V[4-6]，病毒最小感染单位是核衣壳包裹缠绕的病毒基因(RNP)复合物。据联合国粮农组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO)推测，全球约有62.5%的小反刍动物受到小反刍兽疫的威胁，特别是非洲、亚洲和中东地区[7-8]。2007年7月我国西藏地区首次发生疫情，2013年11月我国新疆地区再次发生，随后疫情遍布全国大多数省份[9-12]。据FAO推测，全球每年因PPR导致的经济损失高达约30亿美元，目前主要采用疫苗免疫接种对PPR进行预防，2015年OIE、FAO联合启动了《全球小反刍兽疫控制与根除策略》，提出了到2030年在全球消灭PPR的目标[13-15]。
作为影响养羊业的重要病原，研究其致病机制为临床疫情的控制提供依据显得尤为重要，而反向遗传操作技术是研究PPRV基因组结构与功能、分子致病机制以及PPRV与宿主相互作用的一个重要工具。因此，本研究旨在构建本实验室保存的PPRV Clone9株感染性克隆，以期为深入研究该毒株的基因组结构与功能、分子致病机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 细胞、毒株来源Vero细胞由中国兽医药品监察所保存。BHK-T7细胞由中国农业大学刘维全教授惠赠。
PPRV Clone9株：由Nigeria 75/1株(GenBank登录号：X74443)经Vero细胞传代噬斑纯化挑取单克隆获得，由中国兽医药品监察所保存。
1.2 主要试剂DNA/RNA提取试剂盒、载体pEASY-Blunt Zero Cloning Kit、Trans 2K DNA Plus Marker、Trans15K DNA Marker均购于全式金生物技术有限公司；Premix TaqTM、PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PrimeSTAR® HS DNA Polymerase、PrimeSTAR® HS DNA Polymerase with GC Buffer均购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒Wizard@ Plus Midipreps DNA Purification System、琼脂糖凝胶快速回收试剂盒Wizard® SV Gel and PCR Clean-UP System、转染试剂FuGENE® 6 Transfection Reagent均购于Promega公司；所有限制性内切酶、高保真DNA组装预混液NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix购自NEB公司；其他试剂或化学药品均购自Invitrogen或Sigma公司；异硫氰酸荧光素(FITC)-羊抗小鼠IgG购自中杉金桥生物有限公司。
1.3 方法1.3.1 PPRV Clone9株基因组分段扩增 基于PPRV Clone9株的全基因组序列，将其基因组分为6个片段，分别设计RT-PCR扩增引物(表 1)。取200 μL PPRV Clone9株F2代病毒液，用DNA/RNA提取试剂盒提取病毒RNA，将提取的病毒基因组RNA进行反转录，生成PPRV-cDNA，然后用设计的引物进行PCR扩增[15]。
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表 1 PPRV Clone9株分段克隆引物 Table 1 PPRV Clone9 strain segmented cloning primer |
1.3.2 全长cDNA克隆构建策略 在低拷贝质粒pBluScript Ⅱ SK(+)中插入T7启动子、终止子和丁肝核酶序列，将PPRV Clone9株全长分为6个片段，利用PCR技术，在扩增片段FL1的上游引物中引入T7启动子序列及与载体酶切位点BssHII左侧同源的15 bp碱基序列，在扩增片段FL2的下游引入与载体酶切位点SnaBI，在FL5片段的3′末端引入丁肝核酶序列及T7终止子。利用PCR方法将PPRV Clone9株基因组8 424位核苷酸G突变为T引入一个点突变，作为拯救病毒的遗传标记。RT-PCR扩增各片段后分别连接至pEASY-Blunt Zero Cloning Kit，构建中间质粒，测序无误后通过同源重组分两步连入全长质粒载体PB-BSM，构建全长cDNA质粒。
利用同源重组技术，将病毒基因组全长cDNA各中长片段(FL1-FL5)分两步连入载体pBluScript Ⅱ SK(+)，具体如图 1所示。
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图 1 pB-PPRV构建示意图 Fig. 1 Schematic representation of pB-PPRV |
1.3.2.1 载体pB-PPRV-1 (1-7061)的构建 用内切酶BssHII，SnaBI对载体pBluScript Ⅱ SK(+)进行双切，使载体线性化。利用同源重组酶将片段FL1、FL2、连入双酶切载体pBluScript Ⅱ SK(+)，连接产物转化E.coli HST08感受态，37 ℃过夜培养后挑选菌落进行PCR鉴定，将菌落PCR鉴定为阳性的克隆，送公司测序。
1.3.2.2 载体pB-PPRV的构建 用内切酶SnaBI，MIuI对载体pB-PPRV-1进行双酶切，使载体线性化，PCR扩增片段FL3、FL4、FL5-1、FL5-2利用同源重组酶将各片段连入双酶切载体pB-PPRV-1，连接产物转化E.coliHST08感受态，37 ℃过夜培养后挑选菌落进行PCR鉴定，将菌落PCR鉴定为阳性的克隆，送北京六合华大科技股份有限公司测序。形成载体pB-PPRV。最后对构建好的阳性克隆进行全基因组测序以确保序列的准确性。
1.3.3 PPRV Clone9株各辅助质粒的构建 副黏病毒科各病毒反向遗传学操作平台的建立，除了病毒基因组全长cDNA，还需要提供N、P、L 3个功能蛋白(图 2)。蛋白N、P、L基因的克隆由构建成功的含病毒基因组全长cDNA的质粒pB-PPRV为模板设计相应引物扩增而来，扩增引物见表 2。
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图 2 蛋白N、P、L表达载体构建示意图 Fig. 2 Schematic representation of plasmids for expressing proteins N, P, L |
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表 2 N、P、L基因扩增引物 Table 2 Primers used in cloning of genes of N, P, L |
利用同源重组技术，蛋白N、P、L基因由SacⅡ和MIuⅠ双酶切连入载体PEMC，分别命名为PEMC-PPRV-N、PEMC-PPRV-P、PEMC-PPRV-L。
1.3.4 病毒拯救及鉴定 将病毒基因组全长cDNA克隆载体pB-PPRV和功能蛋白载体PEMC-PPRV-N、PEMC-PPRV-P、PEMC-PPRV-L共转染稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK-T7细胞(表 3)。转染2 d后，将每个六孔板的细胞转入2个25 cm细胞瓶继续培养，培养到第4天将细胞瓶冻融，冻融物作为拯救病毒F1代，按10%体积比接入Vero细胞，进行拯救病毒的传代。用间接免疫荧光、Westernblot、RT-PCR和序列测定对拯救病毒F3代进行鉴定[15]。
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表 3 转染液的配制 Table 3 Components and amounts of transfection medium |
1.3.5 体外增殖动态 亲本毒和拯救的病毒以MOI=0.01剂量接种生长于96孔板中的单层Vero细胞，感染后不同时间点(12、24、36、48、60、72、84、96 h)收取病毒液，并计算相应时间点病毒滴度，绘制病毒生长曲线。
1.3.6 遗传稳定性鉴定 为评价拯救病毒的遗传稳定性，取拯救病毒F0代于Vero细胞上连续传代10次，收获F3、F5、F10代病毒细胞培养物，分别进行遗传标记鉴定、Western blot的鉴定。
2 结果 2.1 PPRV Clone9株基因组中长片段的扩增及全长和辅助质粒的构建与鉴定通过PCR对PPRV-cDNA进行扩增，用0.8%琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测，扩增出的片段大小与预期相符(图 3A)。全长质粒pB-PPRV经酶切后，应出现两条带，大小分别为5 321和13 689 bp。酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分析，出现结果与预期一致，表明全长质粒pB-PPRV构建成功(图 3B)。构建成功的辅助质粒pEMC-PPRV-N、pEMC-PPRV-P、pEMC-PPRV-L，经酶切后，酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分析，出现结果与预期一致，表明各重组质粒构建正确(图 3C)。
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A.PPRV Clone9中长片段的克隆; B.基因组全长cDNA克隆质粒的酶切鉴定; C.辅助质粒的酶切鉴定 A.PPRV Clone9 medium and long fragment clone; B.Identification of full-length genomic cDNA cloned by plasmid restriction digestion; C.Enzyme digestion identification of auxiliary plasmid 图 3 重组质粒的酶切鉴定 Fig. 3 Enzyme digestion identification of recombinant plasmids |
将感染拯救病毒F3代的细胞用抗PPRV-N的特异性单抗进行间接免疫荧光染色。结果表明，拯救病毒感染细胞呈现特异性荧光染色(图 4A)；将亲本毒PPRV Clone9株及拯救病毒F3裂解物进行Western blot试验，用抗PPRV-N的特异性单抗可检测到目的蛋白条带(图 4B)；将F3代拯救病毒培养上清进行RT-PCR及测序鉴定，确定了遗传标记的存在(图 4C)；拯救病毒体外增殖特性鉴定结果表明，拯救病毒表现出与亲本毒相似的生长特性，且最高生长滴度均可接近106 TCID50 ·mL-1(图 4D)。
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A.间接免疫荧光鉴定拯救病毒rPPRV Clone9：a.Vero细胞; b.感染PPRV Clone9的Vero细胞; c.感染rPPRV Clone9的Vero细胞；B.Western blot鉴定拯救病毒；C.拯救病毒遗传标记的序列测定，箭头所指为突变位点；D.拯救病毒感染Vero细胞的生长动力学曲线 A.Indirect immunofluorescence analysis of rPPRV Clone9: a. Vero cells; b. Vero cells infected by PPRV Clone9; c. Vero cells infected by rPPRV Clone9; B.Western blot analysis of rescued virus; C.Sequence determination of rescue virus genetic markers. Arrows indicate the change site; D.Rescue the growth kinetics curve of virus-infected Vero cells 图 4 拯救病毒的鉴定 Fig. 4 Rescue virus identification |
经基因测序和Western blot结果表明，遗传标记能稳定地存在于拯救病毒基因组中(图 5A)；各代次病毒稳定表达N蛋白(图 5B)。
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A.不同代次拯救病毒遗传标记鉴定；B.Western blot鉴定不同代次拯救病毒 A.Identification of genetic markers for rescue viruses of different generations; B.Western blot identifies rescue viruses of different generations 图 5 拯救病毒传代稳定性鉴定 Fig. 5 Rescue virus passage stability identification |
就目前麻疹病毒属各病毒而言，反向遗传学的研究相对不平衡。麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、犬瘟热病毒(CDV)的研究较多[16-19]，其操作系统也相对比较完善。PPRV虽有反向遗传系统的报道，但应用到实际并不多。对于PPRV而言，基础研究相对薄弱，建立科学、有效的反向遗传系统势在必行[20]。
目前，已有报道成功拯救PPRV感染性克隆的方法共有3种，分别如下：胡倩倩[21]利用细胞中的RNA聚合酶Ⅱ在CMV启动子下，转染Vero Dog SLAMtag(VDS)细胞后拯救PPRV，通过CPE病变，间接免疫荧光以及PCR等方法鉴定成功获得了感染性病毒，该体系虽然采用高效的CMV转录系统，但拯救效率依然很低，每106个细胞只能产生约1~10个病毒粒子，这主要是因为PPRV在感染细胞后，病毒粒子在细胞质中进行组装和复制，而RNA聚合酶Ⅱ存在于细胞核内，利用细胞中的RNA聚合酶Ⅱ拯救病毒时，当RNA聚合酶Ⅱ在细胞核内转录编码病毒基因组时，核膜阻碍转录物输出至细胞质，从而可能影响病毒拯救效率[22]。
Muniraju等[23]采用T7 RNA聚合酶的体系，将病毒基因组全长质粒和3个辅助质粒(N、P、L)附加可以表达T7 RNA聚合酶的质粒一起共转染VDS细胞后，进行病毒拯救。该体系采用五质粒共转染进行病毒拯救，有研究表明，副黏病毒拯救过程中，共转染质粒越多，病毒拯救效率越低[24-25]。
体外拯救负链RNA病毒时，在MV[10]、新城疫病毒(NDV)[26]、水泡性口炎病毒(VSV)[27]等病毒的拯救中，采用T7 RNA聚合酶体系，需要使用表达T7 RNA聚合酶的痘病毒作为辅助病毒，MV等病毒复制速度快，可在辅助病毒对细胞产生损害之前已完成包装、复制和释放；而PPRV需要更长的复制和释放时间，所以痘病毒-T7系统不适于PPRV拯救。稳定表达T7 RNA聚合酶的工程化细胞避免了痘病毒对宿主细胞的破坏，影响复制较慢的病毒拯救。Liu等[28]同样采取T7 RNA聚合酶体系的四质粒系统，转染BSR-T7/5细胞进行PPRV的拯救。
与此同时，国内研究学者翟军军[29]、刘振东[30]和李菊[31]也纷纷构建了PPRV全长基因组的克隆以及拯救病毒必要的辅助质粒，但一直未能拯救成功。
参考报道成功拯救出PPRV的体系，以及借鉴麻疹病毒属其他已成功拯救出的病毒体系，本研究将病毒基因组全长质粒和3个辅助质粒(N、P、L)共转染稳定高效表达T7 RNA聚合酶的BHK细胞，这样既避免了引入痘病毒对宿主细胞的破坏，同时四质粒转染提高了病毒拯救效率。
4 结论本研究使用稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK细胞进行病毒拯救，建立了PPRV Clone9株的反向遗传系统。利用反向遗传系统获得的PPRV Clone9株可用于基础理论的研究和新型疫苗的研发。此外对同种属其他副黏病毒进行类似基因操作提供技术参考。
| [1] |
KUMAR N, MAHERCHANDANI S, KASHYAP S K, et al. Peste des petits ruminants virus infection of small ruminants: A comprehensive review[J]. Viruses, 2014, 6(6): 2287-2327. DOI:10.3390/v6062287 |
| [2] |
农业农村部, 海关总署. 中华人民共和国农业农村部中华人民共和国海关总署公告第256号[J]. 中华人民共和国农业农村部公报, 2020(7): 104-110. Ministry of Agriculture and Rural Affairs, General Administration of Customs. Ministry of Agriculture and Rural Affairs of the People 's Republic of China announcement No.256 of the General Administration of Customs of the People 's Republic of China[J]. Gazette of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs of the People 's Republic of China, 2020(7): 104-110. (in Chinese) |
| [3] |
DIALLO A, MINET C, LE GOFF C, et al. The threat of peste des petits ruminants: Progress in vaccine development for disease control[J]. Vaccine, 2007, 25(30): 5591-5597. DOI:10.1016/j.vaccine.2007.02.013 |
| [4] |
董浩, 段小波. 小反刍兽疫分子生物学研究进展[J]. 中国畜牧兽医, 2011, 38(10): 135-138. DONG H, DUAN X B. Advance in molecular biology of peste des petits ruminants virus[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2011, 38(10): 135-138. (in Chinese) |
| [5] |
BAILEY D, BANYARD A, DASH P, et al. Full genome sequence of peste des petits ruminants virus, a member of the Morbillivirus genus[J]. Virus Res, 2005, 110(1-2): 119-124. DOI:10.1016/j.virusres.2005.01.013 |
| [6] |
DIALLO A. Morbillivirus group: Genome organisation and proteins[J]. Vet Microbiol, 1990, 23(1-4): 155-163. DOI:10.1016/0378-1135(90)90145-L |
| [7] |
BANYARD A C, PARIDA S, BATTEN C, et al. Global distribution of peste des petits ruminants virus and prospects for improved diagnosis and control[J]. J Gen Virol, 2010, 91(12): 2885-2897. DOI:10.1099/vir.0.025841-0 |
| [8] |
宋建德, 袁丽萍, 孙洪涛, 等. 2015—2016年全球小反刍兽疫流行状况和防控[J]. 中国兽医杂志, 2017, 53(12): 111-113. SONG J D, YUAN L P, SUN H T, et al. Global prevalence and prevention and control of PPR in 2015-2016[J]. Chinese Journal of Veterinary Medicine, 2017, 53(12): 111-113. (in Chinese) |
| [9] |
刘永宏, 曹胜波, 赵丽, 等. 中国小反刍兽疫疫情分析[J]. 西北农业学报, 2014, 23(9): 19-26. LIU Y H, CAO S B, ZHAO L, et al. Analysis of epidemic Chinese peste des petits ruminants[J]. Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica, 2014, 23(9): 19-26. (in Chinese) |
| [10] |
BAO J Y, WANG Q H, LI L, et al. Evolutionary dynamics of recent peste des petits ruminants virus epidemic in China during 2013-2014[J]. Virology, 2017, 510: 156-164. DOI:10.1016/j.virol.2017.07.018 |
| [11] |
NIU B, LIANG R R, ZHANG S W, et al. Spatiotemporal characteristics analysis and potential distribution prediction of peste des petits ruminants (PPR) in China from 2007-2018[J]. Transbound Emerg Dis, 2021, 69(5): 2747-2763. |
| [12] |
吴昊天, 满初日嘎, 王凤阳, 等. 小反刍兽疫流行状况及分子诊断技术研究现状[J]. 动物医学进展, 2022, 43(1): 122-126. WU H T, MANCHU R G, WANG F Y, et al. Epidemiological situation of research progress on molecular detection of peste des petits ruminants[J]. Progress in Veterinary Medicine, 2022, 43(1): 122-126. (in Chinese) |
| [13] |
PARIDA S, MUNIRAJU M, MAHAPATRA M, et al. Peste des petits ruminants[J]. Vet Microbiol, 2015, 181(1-2): 90-106. |
| [14] |
ZHAO H, NJEUMI F, PARIDA S, et al. Progress towards eradication of peste des petits ruminants through vaccination[J]. Viruses, 2021, 13(1): 59. DOI:10.3390/v13010059 |
| [15] |
王煜. 小反刍兽疫病毒Clone9株反向遗传操作系统的建立[D]. 北京: 中国兽医药品监察所, 2022. WANG Y. Establishment of reverse genetics operation system of peste des petits ruminants virus Clone9 strain[D]. Beijing: China Institute of Veterinary Drugs Control, 2022. (in Chinese) |
| [16] |
RADECKE F, SPIELHOFER P, SCHNEIDER H, et al. Rescue of measles viruses from cloned DNA[J]. EMBO J, 1995, 14(23): 5773-5584. |
| [17] |
BARON M D, BARRETT T. Rescue of rinderpest virus from cloned cDNA[J]. J Virol, 1997, 71(2): 1265-1271. |
| [18] |
GASSEN U, COLLINS F M, DUPREX W P, et al. Establishment of a rescue system for canine distemper virus[J]. J Virol, 2000, 74(22): 10737-10744. |
| [19] |
陈宗香, 张勇侠, 高雅丽, 等. 麻疹疫苗株Schwarz反向遗传系统的建立[J]. 中国生物制品学杂志, 2021, 34(6): 637-642. CHEN Z X, ZHANG Y X, GAO Y L, et al. Construction of a reverse-genetic system of measles vaccine virus Schwarz strain[J]. Chinese Journal of Biologicals, 2021, 34(6): 637-642. (in Chinese) |
| [20] |
王煜, 孙淼, 陈延飞, 等. 小反刍兽疫病毒反向遗传学研究进展[J]. 中国兽药杂志, 2022, 56(2): 82-87. WANG Y, SUN M, CHEN Y F, et al. Research progress on reverse genetics of peste des petits ruminants virus[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2022, 56(2): 82-87. (in Chinese) |
| [21] |
胡倩倩. 表达GFP或BTV结构蛋白的小反刍兽疫疫苗株的构建及生物学特性硏究[D]. 南京: 南京农业大学, 2012. HU Q Q. Construction and study of peste des petits ruminants vaccine strain virus expressing green fluorescence protein and bluetongue virus structural proteins[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2012. (in Chinese) |
| [22] |
张勇侠, 李玫颖, 陈宗香, 等. 麻疹病毒沪191株反向遗传系统的建立[J]. 病毒学报, 2017, 33(4): 565-571. ZHANG Y X, LI M Y, CHEN Z X, et al. Construction of a reverse-genetics system of measles virus strain S191[J]. Chinese Journal of Virology, 2017, 33(4): 565-571. (in Chinese) |
| [23] |
MUNIRAJU M, MAHAPATRA M, BUCZKOWSKI H, et al. Rescue of a vaccine strain of peste des petits ruminants virus: In vivo evaluation and comparison with standard vaccine[J]. Vaccine, 2015, 33(3): 465-471. |
| [24] |
LIU H J, ALBINA E, GIL P, et al. Two-plasmid system to increase the rescue efficiency of paramyxoviruses by reverse genetics: The example of rescuing Newcastle Disease Virus[J]. Virology, 2017, 509: 42-51. |
| [25] |
LIU H J, DE ALMEIDA R S, GIL P, et al. Comparison of the efficiency of different newcastle disease virus reverse genetics systems[J]. J Virol Methods, 2017, 249: 111-116. |
| [26] |
PEETERS B P H, DE LEEUW O, KOCH G, et al. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: Evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence[J]. J Virol, 1999, 73(6): 5001-5009. |
| [27] |
LAWSON N D, STILLMAN E A, WHITT M A, et al. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92(10): 4477-4481. |
| [28] |
LIU F X, ZHANG Y Q, LI L, et al. Rescue of eGFP-expressing small ruminant morbillivirus for identifying susceptibilities of eight mammalian cell lines to its infection[J]. Virus Res, 2019, 261: 60-64. |
| [29] |
翟军军. 小反刍兽疫病毒全长cDNA的构建及DNA疫苗的免疫学研究[D]. 兰州: 中国农业科学院, 2012. ZHAI J J. Construction of Full-length cDNA of peste des petits ruminants Virus and Immunological study of the developed DNA vaccine[D]. Lanzhou: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2012. (in Chinese) |
| [30] |
刘振东. PPRV反向遗传系统的构建及重组病毒拯救[D]. 兰州: 中国农业科学院, 2021. LIU Z D. Construction of PPRV reverse genetic system and rescue of recombinant virus[D]. Lanzhou: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2021. (in Chinese) |
| [31] |
李菊. PPRV N、C蛋白单克隆抗体的制备及C基因沉默的重组病毒拯救[D]. 兰州: 西北民族大学, 2022. LI J. Preparation of monoclonal antibodies against N and C proteins of peste des petits ruminants virus and the rescue of the recombinant virus with C gene silence[D]. Lanzhou: Northwest Minzu University, 2022. (in Chinese) |
(编辑 范子娟)