肠类器官(intestinal organoid)是由离体的干性细胞如成体干细胞(adult stem cells, ASCs)、胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)及其分化形成的多能干细胞(pluripotent stem cells, PSCs)、诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)或肠隐窝(intestinal crypts)组织，在基质胶(matrigel)和特殊生长因子的培养条件下，自发组织增殖和分化且表现明显肠组织特性的空心细胞团块[1]。它们高度折叠，呈肠纤毛和隐窝样(图 1)。
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图 1 肠类器官模型 Fig. 1 Intestinal organoid model |
2007年Clevers研究组[2]利用小鼠体内试验证明了Lgr5+上皮细胞属于肠道上皮干细胞。2009年该研究组成员Sato等[3]在Nature上展示了团队成功利用单一的Lgr5+细胞培养出小肠绒毛状上皮结构。这些结构不但具有完整的肠道上皮结构特性，且含肠道内各种分化的功能细胞，包括肠上皮细胞、肠内分泌细胞、杯状细胞、潘氏细胞和Lgr5+干细胞[3]。随后的多项研究也证明，离体的肠道干细胞和隐窝可以在3D培养条件下形成肠道类器官，也称为“迷你肠”(mini-gut)，它们能呈现源组织的典型功能[4-10]。
目前报道培养人和小鼠的肠类器官的文献比较丰富，但伴侣动物和家畜动物的相关报道较少。然而伴侣动物和家畜动物仍存在很多传染性和非传染性的肠道疾病，需要新型的研究模型。为此，本文将综述动物肠类器官的培养进展，旨在为构建不同动物的肠类器官提供参考。
1 肠类器官的培养方法目前肠类器官的培养方法主要有两种：Sato等[3]在2009年发表的“浸泡培养法”(submerged method)和Wang等[11]在2015年发表的“气液双向培养法”(air-liquid method)。前者是将分离的样品与基质胶混合后，滴加到培养皿正中间使之呈圆滑的“水珠状”，待基质胶凝固后加入含有特殊生长因子的类器官生长培养基并浸没样品基质胶混合物以实现3D培养；后者是利用Transwell小室，在一个培养板中间放置一个底下可以允许生长培养基通过的滤膜皿，在滤膜皿底部先铺一层基质胶，再在上层加入基质胶和样品混合物，最后在培养板中加入完全类器官培养基，构建“大皿套小皿”的方式培养。这两种方法都可使肠ASCs在体外培养条件下自发分化成各种成熟细胞，并重现与源组织相同的结构和功能。前者单次培育的成熟类器官较少，而后者单次培育的类器官数量更多。除了在类器官培育数量上有区别外，更重要的是，后者的培养方式改变了小肠上皮细胞的极性，使单层上皮细胞的小肠绒毛面朝向培养液，便于进行小肠功能探索与评估或宿主与病毒关系的试验[6, 12-13]。
2 不同动物的肠类器官培养 2.1 鼠肠类器官2009年，Clevers团队[3]首次利用ENR培养条件，即利用富含表皮生长因子(EGF)、头蛋白(Noggin)和Wnt激活剂R-spondin-3的培养基成功构建鼠小肠类器官。2018年，Wang等[14]从成年小鼠的黏膜下组织和固有层中分离出了肠神经胶质细胞(EGCs)，Baghdadi和Kim[15]在Wang等的研究基础上将ENR培养基和从EGCs培养中分离的条件培养基相结合，发现该培养系统会显著促进鼠小肠新隐窝的形成，增强干细胞活性，该培养系统可以用于研究鼠小肠类器官和EGCs通过分泌因子产生的相互作用。
尽管小鼠小肠类器官的培养条件已经相对成熟，构建长期稳定的小鼠结肠类器官仍存在培养条件上的挑战。为此，Sato等[16]开始改良ENR培养条件。研究发现鼠小肠类器官可持续表达Wnt信号，而结肠隐窝在培养开始不久后便失去Wnt信号，他们推测结肠类器官缺乏Wnt配体，因此不能长期维持结肠干细胞的稳定[16]；该课题组在ENR条件培养基中添加Wnt-3A，结果发现结肠隐窝的培养效率增加了10倍，最终成功探索出小鼠结肠类器官的培养条件[16]；此外，他们还发现新鲜分离的结肠隐窝上部完全成熟细胞会干扰肠类器官的生长[16]。将结肠隐窝轻度消化成小簇细胞再进行培养，会极大提高结肠类器官形成的效率。
Yilmaz等[17]发现潘氏细胞能够通过检测肠干细胞代谢状态来调节自身活动。Sato等[18]研究发现无论是在小鼠的体内或体外，Lgr5+干细胞的生长维持都与潘氏细胞有密切的联系。潘氏细胞能够表达EGF、Wnt3、TGF-α等多种培养干细胞所必须的信号分子，将分选出的Lgr5+干细胞与潘氏细胞共培养可显著提高肠类器官培养的成功率。
2.2 猪肠类器官2013年，Gonzalez-Cordero等[19]从野生型约克夏仔猪中获取肠道组织，采用免疫荧光法及电镜首次鉴定了猪肠细胞谱系，包括肠道干/祖细胞系，吸收细胞系及分泌细胞系。同时，构建了猪肠类器官长期培养体系，成功培养和传代猪肠类器官，为利用猪作为转化医学的动物模型奠定基础[19]。为了更好地研究肠道上皮细胞的更新情况，Thorne团队[20]成功开发了“单层类器官”的培养方法，并证实“单层类器官”具有增殖和分化区，自我更新，组织极性及分化主要肠道细胞类型的特性。van der Hee等[21]利用完全酶解法将类器官分离为多细胞系悬液，取代了用机械破碎法获得肠道隐窝或肠道干细胞。这样不仅能提高单层类器官培养效率还能减少机械分离对细胞的损伤。利用上述培养方法，Li等[12]成功将3D猪肠类器官制成2D单层类器官，用于研究PEDV感染宿主肠道的致病机制。2020年，Li等[22]通过去除猪肠类器官培养系统中的基质胶并利用超低吸附培养板，使原本肠绒毛内置的猪肠类器官在悬浮培养时发生极性反转，培养出了绒毛外置的猪肠类器官，为研究猪肠道病原体与宿主的相互作用提供了适宜的模型。
2.3 犬肠类器官近年来，人们建立并不断探索犬肠类器官的改良培养方案以期提高培养效率[16]。Powell和Behnke[23]利用可分泌Wnt3a、R-spondin-1和Noggin(WRN)的小鼠纤维原细胞系，构建了50% L-WRN(条件培养基)，并证明了WRN是犬类器官生长所需要的因子。在该培养方案下，犬肠类器官能稳定传代40代以上。Kramer等[24]采取Fujii团队[25]的经验策略，通过移除烟酰胺、p38-MAPK抑制剂、N2和EGF及增添IGF1及FGF2，调制出改良培养系统。该培养系统在促进细胞分化的同时还能保持肠道干细胞的增殖。
此外，由于每个肠段都有特定的解剖结构和生理功能，研究者开始探索更精准的肠段类器官。Chandra和同事们[26]在试验中分离健康犬和炎性肠炎病(IBD)及肠道肿瘤病犬的空肠、十二指肠、回肠组织和结肠，并在改良的人肠类器官培养基(WRN、ROCK抑制剂和GSK3β)中培养出了对应的类器官。研究发现IBD犬源的类器官和健康犬源的类器官在形态学上无明显差异，且都能稳定传代20代以上。与传统截取肠段组织不同，该研究利用内窥镜对不同肠段进行活检采样，所得样本均能顺利形成对应的类器官，扩大了犬肠类器官的供体来源。就犬隐窝分离方法而言，Powell和Chandra团队使用的方法略有差异：前者使用胶原酶消化达到隐窝分离的效果，而后者使用EDTA螯合法[23, 26]。从分离效果上来看，使用EDTA进行隐窝分离显著提高了隐窝上皮的纯度，并减少了其他细胞类型的污染[26]。哺乳类动物肠道干细胞的分离具有种属差异，消化试剂浓度和孵育时间与对应种属肠道绒毛的长度、数量和大小相关[3, 26-27]。
与人和小鼠的肠道类器官相似，犬Lgr5+肠道干细胞主要集中在肠道类器官及空肠组织的隐窝区域[26]。犬肠道类器官与犬全层空肠组织的免疫组化对比结果显示，犬肠道类器官为上皮细胞群组成，不含潘氏细胞、间充质细胞及免疫细胞且犬肠道干细胞能分化成杯状细胞、小肠内分泌细胞及空肠组织[26]。这些细胞的类型及空间定位与源组织一致，证明犬肠道类器官能较好地还原源组织的结构和功能[28]。
2.4 猫肠类器官目前，仅有一例报道描述了猫肠类器官的培养，但培养的结果并不理想。Powell和Behnke[23]利用L-WRN条件培养基养出猫肠类器官，但猫肠类器官在P10代次前后停止扩增，并在P13~P18代次前后开始出现生长停滞。与此同时，他们观察到了一种间充质样细胞类型在猫肠类器官生长出现停滞前数量减少且猫肠类器官表达的波形蛋白(VIM)比对照组多，提示这类细胞可能是猫肠类器官生长的必需成分。Powell和Behnke[23]根据间充质/基质成分与肠隐窝共培养的要求，尝试了添加多种用于诱导人和小鼠的肠类器官生长或由隐窝间充质/基质细胞分泌的因子，但培养结果依然没有太大的改善，说明猫肠类器官的培养条件仍需要更多探索。
2.5 禽肠类器官目前，关于禽肠道类器官的报道较少。Pierzchalska等[29]首次利用鸡胚的上皮组织成功建立禽肠道类器官，并发现前列腺素E2(PGE2)可替代WRN培养体系中的R-spondin1和Noggin而不影响类器官球的生长。与哺乳类动物的肠类器官不同，禽肠类器官较少出现出芽样的隐窝[29-30]。
近期，Zhao等[30]采用L-WRN条件培养基，利用鸡胚的小肠组织和肉鸡或蛋鸡的盲肠成功构建了可传代、可冻存的禽肠类器官，并用RT-PCR和Western blot证实了禽小肠类器官不仅有干细胞还有成熟的分化细胞，包括上皮细胞、肠内分泌细胞、潘氏细胞和杯状细胞。而外源添加物的浓度和种类可改变禽肠类器官的数量、表面积和干细胞标记物的表达量[30-32]。为了提高构建禽肠类器官的可重复性，除了培养体系方面的改良，Panek等[33]还应用悬滴法培养以鸡胚为材料的禽肠类器官，不但提升了培养效率而且还降低实验成本。
2.6 反刍动物及草食动物的肠类器官由于反刍动物(牛、羊)及草食动物(马、兔)的饮食特性，其消化道进化为与之适应的特殊解剖结构。例如牛和羊具有四个胃，马和兔子的盲肠和结肠发达。尽管反刍动物及草食动物的肠道与人和小鼠的肠道不同，但利用改良的人或小鼠肠道类器官培养系统如L-WRN、BEM或商品化培养基IntestiCultTM仍能培养出相应的反刍动物及草食动物的3D肠类器官，而Mussard等发现利用化学抑制剂的2Ki培养基更适用于增殖兔肠类器官，而低浓度(5%)的L-WRN更适合诱导分化兔肠类器官[23, 34-38]。
3 动物肠类器官的优点与缺点 3.1 优点动物肠类器官是功能介于2D细胞系模型和动物模型之间的体外模型。它既具有某些2D细胞系模型或活体动物模型的优势，又能弥补他们在某些研究上的不足。
Caco-2细胞单层模型是药物研究常用的2D细胞系模型，但该模型无法模拟肠道真实结构和肠道细胞间的互作[39-40]。而与广泛使用的癌细胞系和永生细胞系构建的2D单层细胞系模型不同，3D肠类器官模型能更好地再现细胞的结构和功能，以及原始组织的遗传和表观遗传特征，是更加真实可靠的模型[4, 41-44]。
与活体动物模型相比，类器官不仅能模拟疾病在体内发生和发展的情况，还能更容易地进行基因操作，使之更好地研究特定细胞之间的联系和形态结构[45-46]。除此以外，类器官培养所需的原代细胞来源广泛，可从外科切除的组织、活检样品和屠宰组织中获得，极高效地利用组织，减少使用活体动物，符合实验3R原则[26, 47-49]。由于类器官能很好地反映样本个体特征，因此也可服务于病患个体的精准医疗[35, 50]。
3.2 缺点和所有正在发展的技术一样，类器官培养技术也有其短板。肠类器官的3D培养体系所用的基质胶是来自小鼠的肉瘤，而这些动物来源的基质胶成分复杂，组分无法标准化，具有传播动物源病原的风险。此外，这种肿瘤源基质不能有效地模拟天然肠道的微环境。上述缺点可能会限制肠类器官广泛地应用在机制研究和临床试验中[50]。Gjorevski等[51]首次提出人造水凝胶替代基质胶，但由于类器官生长的不同阶段需要不同硬度的细胞外基质，因此人造水凝胶的培养效果不如动物源基质胶。随后人们开始尝试不同的非肿瘤源生物基质胶，并发现其培养性质与基质胶相当，甚至更优，如蛋白、肠道细胞外间质水凝胶和去细胞化的猪消化道[52-54]。这些尝试为以后生产标准化基质胶提供了理论基础[54]。
当前类器官主要指上皮源性的类器官。而这些类器官几乎只含干细胞/足细胞及其分化的特异性上皮细胞，不含有成纤维细胞、免疫细胞、血管细胞等间基质细胞[26]。这限制了类器官技术在模拟炎症反应、免疫细胞调控机制和模拟体内微环境等方面的研究[50]。当试验需要更复杂，更接近生理的研究模型时，单个类器官或简单的共培养系统则不能满足此要求。为此，科学家开发了类器官芯片(organoid-on-chips)，以更好地模拟生理微环境[55-56]。
肠上皮细胞具分泌物质、消化大分子、吸收营养、抵抗病原体和自我更新的功能，其特殊细胞亚结构绒毛和微绒毛面向肠腔，具有极性[57]。研究肠类器官上皮细胞与其他物质或病原体之间的关系需要通过微注射方法[58]。这种高要求的操作技术限制了相关研究的发展。因此，探索培养绒毛外翻的肠类器官具有迫切性。2D类器官很好地解决了上述的难题。首先在培养皿中铺上基质胶薄层，待基质胶凝固后加入含基质胶的肠隐窝或肠干细胞与混合物，然后加入ENR培养液，即可构建出细胞基底面朝向基质胶，细胞顶端面朝向培养液的单层肠类器官[12, 20-21, 59]。此外，Nash等[60]利用悬浮法培养建立了肠绒毛外翻的禽肠类器官。
4 小结与展望Clevers实验室开创性地发现Lgr5+ 干细胞标记物，自此引起了探索人和动物的肠类器官构建、鉴定与改良的热潮。得益于肠类器官的立体结构及细胞异质性等特性，人们对这种新型的、更好模拟体内肠道生理结构和功能的体外模型产生巨大需求。为此，研究者纷纷开始探索和改良的类器官培养体系，以期望提高肠类器官的培养效率并根据研究需要开发出不同肠段的肠类器官。目前的培养体系和培养技术能快速成熟地培养出人、小鼠和犬不同肠段的肠类器官。利用改良的人和鼠肠类器官培养体系，也能顺利培养出反刍动物和草食动物的肠类器官；然而相似的培养体系在猫肠道类器官中的培养效率却较低。相反，由于没有太多研究和文献报道，禽肠类器官的培养体系没有其他物种的肠类器官培养体系丰富，仍有待继续优化。
无论是3D肠类器官抑或是2D单层肠类器官，这些研究平台都能高度还原源组织的表型和功能。因此在不久的将来，当类器官培养体系能更标准化时，结合如CRISPR/Cas9基因编辑、细胞共培养、大数据和人工智能等技术，动物肠类器官能进一步服务于疾病诊断、药物筛选、器官修复或移植等研究领域，推动精准医学的发展。
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(编辑 白永平)