非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)是一种双链DNA虫媒病毒编码60种以上的结构蛋白和100余种非结构蛋白[1]，其中由E165R、K196R、A240L基因编码的dUTPase(E165R)、K196R、A240L蛋白是ASFV主要的核苷酸代谢酶[2]，负责在病毒复制过程中提供能量[3]。dUTPase被证实与先天免疫相关[4-5]且能够激活核因子-kappaB(NF-κB)信号通路[6]。在ASFV中也有报道称E165R缺失会影响病毒在巨噬细胞中的高效复制[7]。
NF-κB是由5个转录因子NF-κB1(p50)、NF-κB2(p52)、RelA(p65)、RelB和c-Rel组成的家族，激活靶基因的转录参与多种细胞过程，常见其介导炎症反应。在非活性状态下，经典NF-κB通路中的p65/p50二聚体被NF-κB抑制蛋白α(IKBa)隔离在细胞质中, 当受到促炎刺激时，IKBa的蛋白酶体降解，p65/p50二聚体从IKBa中释放并迅速发生核转位从而启动下游靶基因表达，入核的p65/p50二聚体同时激活IKBa转录使自身恢复静息状态[8]。
慢病毒表达系统能够将目的基因整合到宿主基因组中，从而实现在宿主细胞的稳定表达，是一种准确高效的基因转移载体[9]。本研究通过慢病毒表达系统构建出稳定表达E165R的PK 15细胞系，发现E165R促进NF-κB和炎症相关基因表达。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 质粒和细胞 HEK 293T细胞、PK 15细胞、p3×FLAG-CMV-10质粒、慢病毒载体lentiCRISPR v2Cas9-质粒、psPAX2质粒、PMD2.G质粒和大肠杆菌TOP10感受态细胞均由河南农业大学农业农村部动物生化与营养重点实验室保存，E165R基因以NCBI公布的ASFV E165R的序列号(NC_001659.2)交由生工生物公司合成。
1.1.2 主要试剂 ClonExpress II One Step Cloning Kit购自Vazyme公司；Q5® High-Fidelity DNA Polymerases和限制性核酸内切酶购自NEB公司；PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒和质粒DNA小量抽提试剂盒购自生工生物公司；TurboFect转染试剂和山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor Plus 555二抗购自Thermo Fisher公司、DMEM购自Solarbio公司；胎牛血清FBS、Opti-MEMTM I减血清培养基和胰酶购自Gibco公司；Anti-GAPDH mouse mAb购自Servicebio公司；鼠源抗FLAG单克隆抗体购自abcam公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG和蛋白Marker购自鼎国生物公司；PVDF转印膜和ECL化学发光显色液购自millipore公司；RIPA裂解液购自碧云天生物公司。
1.2 方法1.2.1 重组标签质粒的构建 ASFV E165R基因由生工生物公司合成，和p3×FLAG-CMV-10设计一对特异性引物并添加酶切位点，上游引物为5′-aaggatgacgatgacaagcttCTAGCGATGGCAACAA-ATTTT-3′，下游引物为5′-cagggatgccacccgggatcc-GGAGTTCTCATAATCCCGGCC-3′，下划线处分别为限制性内切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ的识别位点。为模板PCR扩增同源重组插入片段，PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35个循环，72 ℃延伸5 min。扩增的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分离纯化与双酶切后的p3×FLAG-CMV-10质粒一起同源重组连接，转化，涂板，挑菌鉴定得到质粒p3×FLAG-E165R。
1.2.2 重组慢病毒质粒的构建 以重组质粒p3× FLAG-E165R为模板根据lentiCRISPR v2Cas9-质粒选择酶切位点Xba Ⅰ和BamH Ⅰ设计并合成一对特异性引物，上游引物V2-FLAG-F为5′-gaaca caggaccggttctagaATGGACTACAAAGACCATGACGG-3′, 下游引物V2-FLAG-R为5′-gaagtttgttgcgccggatccGGATCCGGAGTTCTCATAATCCC-3′，下划线处分别为限制性内切酶Xba Ⅰ和BamH Ⅰ识别位点。PCR扩增和lentiCRISPR v2Cas9-慢病毒载体酶切回收纯化后进行同源重组连接，经转化，涂板，鉴定测序后得到质粒V2-FLAG-E165R。
1.2.3 重组慢病毒的包装和细胞筛选 按照TurboFect的说明，将V2-FLAG-E165R(2 μg)、pMD2.G(0.5 μg)和psPAX2(1.5 μg)三质粒共转染到HEK 293T细胞中，转染48和72 h时分别收集病毒上清液，混匀后感染PK 15细胞48 h，然后使用工作浓度的嘌呤霉素筛选细胞直到阴性对照细胞全部死亡。存活细胞经终点稀释法筛选出单克隆细胞，经扩大培养后进行鉴定。鉴定正确的细胞系命名为E165R-PK，同时设置lentiCRISPR v2 Cas9-质粒构建慢病毒作为阴性对照命名为V2-PK。
1.2.4 细胞系的PCR鉴定 用细胞DNA小量提取试剂盒提取细胞基因组，以基因组为模板PCR扩增E165R蛋白序列，反应条件参考“1.2.1”，反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳, 并用凝胶成像系统分析结果。
1.2.5 蛋白免疫印迹(Western blot) 将细胞接种于6孔板，当细胞融合度达到90%时使用RIPA进行裂解。裂解液4 ℃离心收集上清并加入4×Loading buffer，高温变性后进行15%的SDS-PAGE电泳以湿转法将蛋白转印至PVDF膜上。将膜使用5%脱脂奶粉封闭1 h，再分别以鼠抗GAPDH和FLAG的单抗(1∶1 000)作为一抗4 ℃孵育过夜，HRP标记山羊抗小鼠单抗(1∶5 000)作为二抗室温孵育1 h。孵育完成的膜使用ECL化学发光显色液显色后以多功能成像仪观察结果。
1.2.6 间接免疫荧光(indirect immunoinfluscent assay，IFA) 将细胞株接种于细胞爬片，待细胞长至50%时使用4% PFA固定细胞30 min，然后使用500 μL 0.1% TritonX-100通透12 min。通透结束后的细胞使用10% FBS室温封闭1 h，以鼠抗FLAG的单抗(1∶1 000)在室温孵育1 h，山羊抗小鼠Alexa Fluor Plus 555(1∶500)避光孵育1 h。最后细胞经DAPI染核并封片后使用激光共聚焦显微镜进行观察。
1.2.7 RT-qPCR检测mRNA转录 以TRIzol法提取细胞总RNA并反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行Real-time qPCR，检测基因转录，猪GAPDH基因为内参，引物序列如表 1。
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表 1 RT-qPCR引物序列 Table 1 RT-qPCR primer sequence |
本研究以p3×FLAG-CMV-10质粒为骨架构建了E165R基因含有FLAG标签的质粒，经鉴定正确后将基因和标签一起连接到lentiCRISPR v2质粒上，测序鉴定后成功得到慢病毒质粒V2-FLAG-E165R。
2.2 细胞系的筛选和鉴定将慢病毒质粒V2-FLAG-E165R包装后转导至PK 15细胞以嘌呤霉素进行筛选，经终点稀释法挑选扩大培养后进行PCR和Western blot鉴定。在PCR鉴定中将重组慢病毒质粒作为阳性对照，V2-PK细胞基因组作为阴性对照，结果显示，E165R-PK基因组在575 bp处有目的条带(图 1A)与预期一致。Western blot鉴定结果显示(图 1B)E165R-PK细胞系在21 ku存在条带而PK 15和V2-PK则没有。上述结果证实E165R蛋白在E165R-PK细胞系成功表达。
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A. 细胞系PCR鉴定：M. DNA分子量标准(DL2000); 1. V2-FLAG-E165R质粒; 2. V2-PK细胞基因组; 3~4. E165R-PK细胞基因组。B. 细胞系Western blot鉴定：1. PK 15细胞; 2. V2-PK细胞; 3~4. E165R-PK细胞 A. PCR identification of cell lines: M. DNA molecular weight standard (DL2000); 1. V2-FLAG-E165R plasmid; 2. V2-PK cell genome; 3-4. E165R-PK cell genome. B. Western blot identification of cell lines: 1. PK 15 cells; 2. V2-PK cells; 3-4. E165R-PK cells 图 1 细胞系PCR和Western blot鉴定 Fig. 1 PCR and Western blot identification of cell lines |
在24孔板中制备PK 15和E165R-PK的细胞爬片进行免疫荧光鉴定。从图 2可以看到E165R-PK细胞有点状红色荧光信号(以白色方框标出)，而PK 15细胞并无明显点状荧光。
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图 2 免疫荧光鉴定E165R的FLAG标签表达(扫描文章首页OSID码可查看彩图) Fig. 2 Identification of FLAG tag expression of E165R by immunofluorescence(Scan OSID code on the first page to view the colorful image) |
通过qPCR检测NF-κB和炎症相关IL-6、IL-8、TNF-α基因mRNA表达水平。由图 3可知E165R-PK细胞相对于对照细胞V2-PK，NF-κB相关基因P65和IKBa表达均极显著高于对照组(P＜0.01)，同时炎症相关基因IL-6、IL-8、TNF-α表达量也显著增高(P＜0.01)。该结果表明E165R蛋白可以激活NF-κB信号通路，并可能刺激炎症产生。
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用t检验进行分析，*** P＜0.001，**** P＜0.000 1 t test was used for analysis, *** P < 0.001, **** P < 0.000 1 图 3 过表达E165R蛋白后NF-κB和炎症相关基因mRNA水平变化 Fig. 3 Change of mRNA levels of NF-κB and inflammation-related gene after overexpression of E165R protein |
据报道，dUTPase广泛存在于生命体中，包括许多原核生物、真核生物、DNA病毒及RNA病毒中[10]。Oliveros等[7]通过构建ASFV dUTPase缺失突变体，发现dUTPase影响ASFV在猪巨噬细胞高效复制，同时Epstein-Barr virus (EBV)的dUTPase能通过NF-κB信号通路增加TNF-α、IL-6表达[4-5]。虽然E165R在ASFV复制中的作用已有报道，但其在先天免疫方面的作用研究的还并不清楚。
虽然ASFV的易感细胞为猪原代肺泡巨噬细胞，但是相对与猪原代肺泡巨噬细胞，PK15细胞易于培养，并且广泛用作细胞模型用来研究宿主先天免疫信号通路。本研究通过慢病毒系统构建表达ASFV E165R基因的PK15细胞系，利用PCR、Western blot和IFA证实该基因能够在PK15细胞系中稳定表达。
ASFV相关蛋白对天然免疫信号通路的影响引起学者广泛关注，Yang等[11]通过敲减F317L蛋白发现其抑制NF-κB从而拮抗宿主先天免疫应答，Wang等[12]发现K205R蛋白诱导内质网应激，从而激活自噬和NF-κB信号通路。针对构建成功的稳定过表达E165R的PK15细胞系，本研究用qPCR检测E165R对NF-κB信号通路相关因子表达的影响，发现E165R蛋白显著提高NF-κB信号通路相关基因P65和IKBa的转录，促进炎症相关基因IL-6、IL-8和TNF-α在转录水平上的表达，表明E165R蛋白能够激活NF-κB信号通路并且刺激炎症产生，但其在先天免疫信号通路中的具体作用仍有待进一步探究。
4 结论本研究以慢病毒包装技术转导PK 15细胞得到稳定表达非洲猪瘟E165R蛋白的细胞系，并初步验证其能激活NF-κB信号通路，刺激炎症因子表达，为ASFV在先天免疫方向的研究提供了新思路。
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(编辑 范子娟)