镉(cadmium，Cd)是一种污染来源广泛且毒性很强的重金属元素，环境镉极易被植物吸收而进入食物链，并且在动物体内有很强的蓄积能力[1]，痕量镉即可危害畜禽健康并降低生产性能，例如降低猪的采食量，影响胚胎发育，导致畸胎和死胎数增加[2]；降低鱼类的生长速度和繁殖率[3]；降低蛋鸡的产蛋率和蛋品质[4]。FAO和WHO已将镉确立为第三种先行检测的食品污染物，镉残留超标是造成我国食品不合格的一个重要因素，市售动物性食品中，Cd超标率最高的为畜禽肾(36.36%)和肉类(33.33%)[5]。镉在生物体内的半衰期长达30年，且迁移率高。肝作为镉蓄积的一种主要靶器官[6]，过量镉离子可使肝产生强烈的脂质过氧化反应，干扰凋亡基因的表达[7]，抑制巯基酶活性，使消化系统受损，影响消化和代谢[8]。经食物链进入人体的镉还会降低机体免疫力，引发骨质疏松、肾小管功能障碍以及高血压等一系列疾病[9]。Cd已被国际癌症研究机构(IARC)列为Ⅰ类致癌物[10]，联合国环境规划署也将镉列为12种具有全球意义的危险化学物之首。为了抑制和消除镉在动物体内的蓄积，人们尝试使用二巯基丙醇(BAL)、二乙基二硫代氨基甲酸(DDTC)和乙二胺四乙酸(EDTA)等重金属螯合剂，但其安全性不足，例如EDTA会加重肾损伤，DDTC会使镉在脑内重新分布[11]，因此，亟需寻找更加安全有效的镉螯合剂。研究表明，胶原肽对钙、铁、锌等金属离子具有螯合作用[12-14]，不仅安全性高，并且还表现出多种生物学活性，例如猪皮胶原肽可有效清除自由基[15]，猪骨胶原肽可增强成骨细胞活性，改善松质骨[16]，牛骨胶原肽可改善免疫功能[17]。本研究中的羊骨胶原肽(sheep bone collagen peptide，SBCP)是酶解羊骨粉制备的小分子多肽，含90.78%分子量＜1 000 u的短肽，含6.89%羟脯氨酸。课题组前期研究结果表明, 羊骨胶原肽可与Ca2+螯合[18]，促进钙的吸收，调节骨代谢平衡，改善骨质疏松[19]，并可提高动物的免疫力[20]和抗氧化性能[21]。本研究拟探究SBCP在肠道和血液环境中对镉的螯合作用，考察其对镉蓄积的清除效果，同时探究SBCP对镉致肝损伤的干预作用及对线粒体凋亡信号通路的影响，揭示其可能的作用机制，为动物慢性镉蓄积提供安全有效的防治新途径，从而保障动物健康和动物性食品安全。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器SBCP购自内蒙古锡盟肽好生物制品责任有限公司；氯化镉(CdCl2)、溴化钾(KBr)等常规试剂购自麦克林试剂有限公司；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；IL-2、IL-8、TNF-α和IFN-γ检测试剂盒及qRT-PCR相关试剂购自北京赛文创新生物科技有限公司。主要仪器有全自动血液生化分析仪(SK9000，盛信康)，傅里叶红外光谱仪(FTIR-650，德国BRUKER)，酶标仪(SpectraMax M4，美国MolecularDevices)，冷冻干燥机(GOID-SIM，美国SIM)等。
1.2 动物分组及处理海兰褐雏鸡(1日龄)由山西省晋中市康牧禽业提供，分笼饲养于山西农业大学动物研究中心[SYXK(晋)2021-0003]，温度维持在(27±2)℃，相对湿度保持在60%~65%，自由采食和饮水，适应性饲喂1周后随机分为对照组(Control)、模型组(Cd)、SBCP组和SBCP干预组(Cd+SBCP)，每组10只。对照组常规饲养，模型组饲喂添加140 mg·kg-1 CdCl2的含镉饲料，SBCP组每天灌胃3 g·kg-1的肽，Cd+SBCP组饲喂与Cd组相同的含镉饲料并灌胃与SBCP组相同的等剂量肽，42日龄最后一次给药结束后, 停饲12 h，心采血，脱颈处死，收集肝组织样品，每一份样品中一部分固定液固定，一部分冻存于-80 ℃备用。以上所有操作遵守山西农业大学实验动物伦理委员会要求(IACCU审查号：SXAU-EAW-2020SD0201)。
1.3 石蜡切片制备与观察肝组织经4%多聚甲醛固定48 h后修剪成约3 mm3厚的组织块，二甲苯浸渍透明后包埋于石蜡中，切片厚度5 μm，43 ℃去离子水中展片，44 ℃烤片，干燥后HE染色，封片观察。
1.4 镉含量的测定分别剪取约0.3 g肝和胸肌组织于有10 mL HNO3的硝化管中，双蒸水稀释至50 mL后送至上海微谱化工技术服务有限公司使用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定Cd含量，操作条件见表 1。
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表 1 电感耦合等离子体质谱仪操作条件 Table 1 ICP-MS operating conditions |
1.5.1 肝组织抗氧化指标 制备10%肝组织匀浆后按照试剂盒说明书测定T-SOD、GSH-Px活力以及MDA含量。
1.5.2 血清生化指标 血液生化分析仪检测血清总蛋白(TP)、球蛋白(GLB)、白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)等肝功能相关指标。
1.5.3 血清炎症因子水平 按照试剂盒说明对鸡血清中IL-2、IL-8、TNF-α、IFN-γ水平进行测定。
1.6 qRT-PCRTrizol提取鸡肝组织总RNA，选择OD260 nm/OD280 nm值为1.8~2.0的总RNA进行反转录。对应引物(表 2)由上海生工生物工程有限公司合成。qRT-PCR扩增体系：SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ(2×)5 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.2 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.3 μL，cDNA 1 μL，ddH2O补至10 μL。反应条件：预变性和变性温度为95 ℃，时间分别为10 min和15 s，退火(60 ℃，30 s)，延伸(72 ℃，10 s)，循环数为40。反应结束后, 采用2-ΔΔCt法，计算相关基因mRNA的表达水平。
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表 2 qRT-PCR引物序列 Table 2 qRT-PCR primer sequences |
1.7.1 肽镉螯合物制备及螯合率测定 参照羊骨胶原肽钙螯合物的制备流程[17]，在鸡肠道温度条件下制备肽镉螯合物，1.59 g SBCP溶解于10 mL人工无酶模拟肠液中，加入0.8 g CdCl2，40 ℃水浴螯合，加入8倍体积乙醇沉淀3 h，冷冻干燥后得到肽镉螯合物粉末。取醇沉淀之后的反应液5 mL，微滤后采用EDTA滴定法测定镉含量[23]，按式(1)计算Cd螯合率。
| $A=\left(C d_{\mathrm{T}}-C d_{\mathrm{F}}\right) / C d_T \times 100 \%$ | (1) |
式中: A为Cd螯合率；CdF表示未发生螯合反应的游离镉含量，mg；CdT表示5 mL反应液中加入镉的总质量，mg。
1.7.2 螯合物鉴定 精确称取2 mg羊骨胶原肽粉和经冷冻干燥之后的肽镉螯合产物，分别与KBr粉末在研钵中研磨混合，装入模具压片机内压制成片，傅里叶红外光谱仪测试：扫描波数4 000~400 cm-1，扫描次数为32，分辨率为4 cm-1。
1.7.3 肽镉螯合物稳定性分析 将肽镉螯合物冻干粉溶于去离子水，使其终浓度为2 mg·mL-1，分别于20、30、40、50、60、70 ℃保温1 h，测定溶液中的游离镉含量；用稀盐酸或氢氧化钠调节溶液pH，40 ℃恒温加热1 h，测定不同pH条件(pH2~8)下溶液中的游离镉含量。肽镉螯合物的稳定性用镉保留率来表示[24]，式(2)。
| $B=\left(C d_U-C d_M\right) / C d_M \times 100 \%$ | (2) |
式中: B为Cd保留率；CdU表示螯合物中镉总量，mg；CdM表示溶液中游离镉的总质量，mg。
1.8 数据处理采用SPSS 25.0对数据进行单因素方差分析，多重比较为LSD法，数据以“x±s”表示，P＜0.05则表示有显著差异，用不同字母表示。GraphPadPrism 8.0软件绘制柱状图。
2 结果 2.1 鸡生长性能变化在整个试验期内，与对照组相比，Cd组鸡精神沉郁，羽毛蓬乱，形体瘦小，多呈卧姿；SBCP组精神状态最佳，形体最大；肽干预组精神状态介于Cd组和SBCP组之间。如表 3所示，SBCP组平均日采食量和日增重显著高于对照组(P＜0.05)，说明SBCP具有促生长作用。与对照组相比，Cd组日采食量和日增重显著下降(P＜0.05)，而肽干预组则显著高于Cd组，并且与对照组差异不显著(P＞0.05)。各组料重比SBCP组与对照组差异不显著，Cd组显著高于对照组，肽干预组与模型组虽差异不显著(P＞0.05)，但呈下降趋势。
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表 3 各试验组鸡生长性能指标(x±s) Table 3 Performance indexes of chickens in each experimental group (x±s) |
图 1中ICP-MS分析结果表明，对照组和SBCP组肝和胸肌组织中均未检出镉，Cd组中肝镉含量达到412.57 μg·kg-1，胸肌镉含量达到129.47 μg·kg-1，Cd攻毒组经SBCP干预后，肝和胸肌镉含量分别下降至216.06和49.68 μg·kg-1，显著低于Cd组(P＜0.05)，且均低于中华人民共和国国家标准(GB 2762—2017)[25]中规定的镉残留限量0.5 mg·kg-1(肝)和0.1 mg·kg-1(肌肉)。
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相同组织数据，所标字母相异表示差异显著(P＜0.05)，所标字母相同表示差异不显著(P>0.05)，下同 Between the same tissues, different letters means significant difference between the treatments(P < 0.05), same letter means not significant difference between treatments(P > 0.05), the same as below 图 1 各组鸡肝和胸肌组织镉含量 Fig. 1 Cadmium content in liver and pectoral muscle of chickens in each group |
图 2中，对照组肝索排列规则，肝小叶形态完全，间质无出血现象。SBCP组与对照组相比无明显病变。Cd组肝细胞出现固缩坏死，颗粒变性现象严重，细胞间质增宽且有淋巴细胞浸润。与Cd组相比，Cd+SBCP组坏死细胞显著减少，细胞间质恢复到正常宽度，但仍有淋巴细胞浸润和颗粒变性现象。
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 .核固缩坏死；△.颗粒变性； .淋巴细胞浸润
.Pyknosis and necrosis of the nucleus; △.Granular degeneration; .Infiltration of lymphocytes
图 2 各组鸡肝组织病理切片(100×和400×)
Fig. 2
Histopathological sections from different groups (100× and 400×)
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MDA可直接体现体内氧自由基和过氧化的水平[26]，T-SOD和GSH-Px可有效清除体内过量活性氧[27]。表 4中的数据显示，与对照组相比，Cd组肝组织的T-SOD、GSH-Px活力显著下降(P＜0.05)，MDA含量则显著增加(P＜0.05)，说明Cd中毒使肝的抗氧化能力显著下降。SBCP组上述各指标与对照组相比抗氧化酶活力和MDA水平虽然差异不显著(P＞0.05)，但分别有上升和下降趋势，并且肽干预组(Cd+SBCP)中的T-SOD、GSH-Px活力显著高于Cd组(P＜0.05)，且MDA含量显著减少(P＜0.05)。
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表 4 各试验组鸡肝组织抗氧化指标测定结果(x±s) Table 4 Results of antioxidant indices of tested chicken liver (x±s) |
血清AST和ALT活力是评价肝细胞完整性的2个常用参数[28]，由图 3可见，Cd组血清AST、ALT活力显著高于对照组(P＜0.05)，说明Cd组鸡的肝细胞膜受损，导致这两种转氨酶进入血液。TP和ALB是反映肝蛋白合成能力的常用指标，镉中毒模型组(Cd组)中TP、ALB和GLB含量显著低于对照组(P＜0.05)，说明Cd蓄积使肝的蛋白合成能力显著降低，白球比下降至1以下，说明肝损伤严重，与小鼠酒精性肝中毒一致[29]。SBCP干预后，Cd+SBCP组两种转氨酶活力显著下降(P＜0.05)，TP、ALB和GLB含量显著上升(P＜0.05)，白球比回复至1以上，表明SBCP可明显改善Cd中毒鸡只的肝损伤状况。
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图 3 各组鸡肝功能相关血清生化指标 Fig. 3 Serum liver-associated biochemical indices of different chicken groups |
由图 4可以看出，与对照组相比，Cd组血清中IL-2、IL-8、TNF-α、IFN-γ水平显著上升(P＜0.05)，SBCP组与对照组差异不显著。与Cd组相比，Cd+SBCP组各炎症因子含量显著下降(P＜0.05)。
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图 4 各组鸡血清炎症因子含量 Fig. 4 Serum inflammatory factor content of chickens from different groups |
细胞凋亡过程中有许多蛋白酶家族参与，其中可改变线粒体外膜通透性的bcl-2蛋白家族负责凋亡途径第一步[30]。bax是一种与bcl-2同源但功能相反的蛋白质，bax同源二聚体有强大的促凋亡作用，而与bcl-2结合生成的异源二聚体却可抑制凋亡。半胱天冬氨酸蛋白酶家族(caspases)中的caspase-3和caspase-9是参与线粒体凋亡途径的主要蛋白。
图 5中，Cd组肝组织中的促凋亡基因cyt C、caspase-3、caspase-9和bax的mRNA表达水平显著高于对照组，而抗凋亡基因bcl-2的mRNA表达水平以及bcl-2/bax的比值显著低于对照组(P＜0.05)，说明Cd在肝的蓄积可促进肝细胞凋亡。SBCP组各基因表达水平与对照组相比无差异显著性。与Cd组相比，Cd+SBCP组各促凋亡基因除caspase-3外表达水平显著下降(P＜0.05)，凋亡抑制基因bcl-2的mRNA表达水平，以及bcl-2/bax比值显著上升(P＜0.05)，说明SBCP可通过线粒体途径抑制由镉中毒所导致的肝细胞凋亡。
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图 5 各组鸡肝线粒体凋亡基因的表达水平 Fig. 5 Expression of mitochondrial apoptosis genes in liver of chickens from different groups |
如图 6所示，羊骨胶原肽谱图中3 335.27 cm-1处的吸收峰是由N-H键的伸缩振动而引起，在与镉进行螯合后，该波段红移了46个波数，变为3 381.98 cm-1，并且波峰增宽，这是铵盐的特征吸收峰，2 240.26 cm-1处的峰在与镉螯合后消失，推测是C O伸缩振动所导致。此外，羊骨胶原肽中1 346.88 cm-1处的吸收峰在肽镉螯合物中变为了1 372.43 cm-1，与改性珠蚌多肽与钙螯合后的变化结果一致[31]，均为羧酸盐中COO—发生伸缩振动所表现出来的特征频率，这些结果证明羊骨胶原肽与镉真正融合成为一种物质，而非简单的混合作用。基于此，作者推测，SBCP与Cd2+的结合方式为COO—Cd和N—Cd，其中—COOH/—NH作为给电子基团，使C O和N—H的键合常数减小，引起振动频率降低而发生红移。
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图 6 羊骨胶原肽与肽镉螯合物的红外光谱图 Fig. 6 Infrared spectra of sheep ossein polypeptide and its cadmium-chelated form |
由图 7可知，在人工模拟无酶肠液中，SBCP和Cd反应60 min时，螯合率达到峰值(47.46%)，食物在鸡的胃肠道停留时间为3~6 h，说明SBCP有足够的时间与Cd在肠道进行螯合，且血液pH(7.35)与肠道pH(7.5)接近，说明肽和镉被吸收入血后，在血液中也可能发生螯合，由经肾排出。在不同的温度条件下，肽镉螯合物的镉保留率仍在80%左右，说明螯合物受温度影响不大，在较宽温度范围内稳定，不同pH下的结果表明肽镉螯合物在酸性条件下的稳定性较差，在中性和偏碱性的环境下较稳定。
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图 7 不同反应时间对肽镉螯合率的影响以及不同温度和pH对螯合物稳定性的影响 Fig. 7 Effects of reaction time on chelating rate and effects of temperature and pH on chelate stability |
动物饲料镉是我国畜禽镉暴露的主要来源，镉在动物体内具有很强的蓄积能力，通过抑制巯基酶活性对机体造成伤害，使包括肝在内的消化系统受损，降低机体的免疫功能[7]，干扰骨代谢和成骨相关基因的表达，对骨组织造成损伤[32]，SBCP不仅可以通过BMP-2信号通路正向调控骨代谢，提高骨密度并改善骨微观结构[33]，本研究结果表明SBCP还对镉造成的肝功能损伤、细胞完整性及组织结构破坏也有修复作用，并且SBCP还可缓解镉中毒对鸡生长发育的抑制，增加日增重和饲料利用率。
镉离子和钙离子同为二价阳离子，并且半径相近[34]，红外图谱分析结果表明, 肽镉螯合物与肽钙螯合物的螯合位点都以氨基端和羧基端居多[17]。螯合物稳定性分析结果表明, 经螯合后的镉在肠道和血液中不再以离子形式存在，而以SBCP-Cd螯合物形式稳定存在，从而解除了游离镉离子对机体巯基酶的抑制作用，进而对镉蓄积引发的肝组织损伤和蛋白合成能力减弱起到改善效果。SBCP干预后肝和肌肉中的镉含量显著下降，说明镉经螯合后降低了其在靶器官的蓄积能力，螯合形式的镉更易被机体排出。本研究使用的SBCP是经过风味蛋白酶和碱性蛋白酶等复合酶在最优化工艺条件下制备的分子量＜1 000 u的小分子多肽混合物，在体内即使是消化道内被进一步降解的概率极低，并且诸多研究表明肽在体内比游离氨基酸更容易被肠道吸收进入血液循环，随血流到达镉蓄积部位后与镉螯合形成产物，阻止了镉与巯基酶的结合，减轻镉致机体损伤。
镉毒性作用的另一个重要机制是促进羟自由基和超氧阴离子的产生，导致氧化还原失衡[35]。本研究表明镉蓄积使肝MDA水平上升，抗氧化能力下降，产生的大量自由基造成氧化应激，造成肝组织损伤。体内外试验结果表明, 羊骨胶原肽具有抗氧化能力[21]，本研究再次证实SBCP对镉中毒鸡干预后可显著提升其抗氧化能力，从而减轻了镉对肝结构和功能的损伤。
过量的氧化应激会引发持续性的炎症反应[36]，因此炎症反应也是镉损伤的一个重要表现，TNF-α、IL-2、IL-8、IFN-γ等这些促炎因子的过量产生，会引起肝微环境的改变，导致肝细胞损伤甚至凋亡。SBCP干预可显著降低Cd中毒鸡体内上述炎症因子的表达水平，说明SBCP具有抗炎能力，课题组前期体外研究结果也表明, SBCP在炎症初期具有促炎作用，炎症后期具有消炎作用[19]。
镉可以通过多种方式导致过量细胞凋亡，从而造成组织损伤[37]。细胞凋亡通常包含死亡受体途径，线粒体途径和内质网途径，镉中毒时产生的大量自由基会破坏线粒体的膜结构，使大量的cyt C释放到胞浆中，被释放的cyt C首先激活caspases-3，活化后的caspases-3继而活化caspases-9，最终激活线粒体凋亡途径[38]。bcl-2家族中的促凋亡基因和抗凋亡基因相互作用调节凋亡的发生[39]。过量的促炎介质也可通过激活半胱氨酸蛋白酶家族来触发细胞凋亡，例如TNF-α可激活caspase-3，被激活的caspase-3会切割各种细胞底物从而触发细胞凋亡。研究表明镉攻毒后鸡的cyt C、caspase-3、caspase-9、bax等促凋亡基因表达水平显著增加[40]，与本研究结果一致，并且SBCP干预降低了上述促凋亡基因的mRNA表达水平，增加了抑凋亡基因bcl-2的mRNA表达水平，从而缓解了镉中毒造成的肝细胞线粒体途径凋亡过程。
4 结论羊骨胶原肽(SBCP)对镉离子具有很好的螯合效果，SBCP干预可降低镉在机体的蓄积能力，提高肝抗氧化能力和蛋白合成能力、减少血清炎症因子产生，抑制肝细胞线粒体凋亡，改善肝组织微观结构，该研究结果为安全有效的重金属螯合剂研发，畜禽肝保护，减少动物性食品中的重金属残留和提高食品安全性提供了可借鉴的方法。
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(编辑 白永平)