畜牧兽医学报  2023, Vol. 54 Issue (6): 2631-2640. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2023.06.039    PDF    
引用本文
曹西月, 纪晓霞, 张崇昊, 张亚峰, 陈雨涛, 张源淑. 二脒那秦通过内源性激活ACE2抑制AngⅡ-TGF-β1通路缓解小鼠肺纤维化[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(6): 2631-2640.  
CAO Xiyue, JI Xiaoxia, ZHANG Chonghao, ZHANG Yafeng, CHEN Yutao, ZHANG Yuanshu. Diminazene Aceturate Alleviates Pulmonary Fibrosis in Mice by Endogenous Activation of ACE2 to Inhibit AngⅡ-TGF-β1 Pathway[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2023, 54(6): 2631-2640.  
二脒那秦通过内源性激活ACE2抑制AngⅡ-TGF-β1通路缓解小鼠肺纤维化
曹西月, 纪晓霞, 张崇昊, 张亚峰, 陈雨涛, 张源淑     
南京农业大学动物医学院/农业部动物生理生化重点开放实验室, 南京 210095
收稿日期：2022-10-18
基金项目：国家自然科学基金项目(31972640)
作者简介：曹西月(1998-), 女, 汉族, 山东泰安人, 硕士研究生, 主要从事动物生物化学研究, E-mail: 2020107030@stu.njau.edu.cn.
通信作者：张源淑, 主要从事动物生物化学研究, E-mail: zhangyuanshu@njau.edu.cn.
摘要：本试验通过博来霉素诱导建立小鼠肺纤维化损伤模型, 探究二脒那秦(diminazene aceturate, DIZE)内源性激活血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)对小鼠肺纤维化发生发展的缓解作用。将24只雄性ICR小鼠随机均分为对照组(CON组)、模型组(MOD组)和二脒那秦处理组(DIZE组)。除CON组外, 其余2组小鼠一次性气管内注射博来霉素(5 mg·kg -1)建立肺纤维化损伤模型。造模1 d后, DIZE组小鼠给予DIZE[15 mg·(kg·d)-1]灌胃处理, CON组和MOD组小鼠同等剂量灌胃生理盐水。连续灌胃28 d, 采血后, 处死所有小鼠, 取肺组织, 进行如下试验: 1)肺组织称重, 计算小鼠肺系数; HE和Masson染色观察肺病理组织学变化; 碱水解法检测肺组织中羟脯氨酸的含量; 2)间接ELISA法检测血清中Ang Ⅱ和Ang 1-7含量; 3)RT-qPCR及Western blot法检测肺组织中纤维化相关因子基因和蛋白等的表达水平。结果表明: 1)与CON组相比, MOD组小鼠肺系数及羟脯氨酸含量极显著或显著升高(P < 0.01 & P < 0.05);肺组织出现明显病理变化, 主要表现肺泡塌陷, 炎性细胞浸润, 肺泡间隔充血、增厚, 有大量胶原纤维沉积。经DIZE处理后肺系数及羟脯氨酸含量显著或极显著降低(P < 0.05 & P < 0.01);肺纤维化程度明显减轻; 2)与CON组相比, MOD组小鼠肺组织中ACE2蛋白表达下调, 血清中Ang Ⅱ含量极显著升高(P < 0.01), Ang 1-7含量极显著降低(P < 0.01);DIZE处理逆转了以上变化; 3)与CON组相比, MOD组小鼠肺组织中Col1a1和Col3a1基因表达极显著上调(P < 0.01), α-SMA及TGF-β1基因和蛋白表达均极显著上调(P < 0.01), 上皮细胞的特征蛋白E-cadherin蛋白表达极显著下调(P < 0.01);与MOD组相比, DIZE组缓解了以上变化。一次性气管内注射博来霉素, 28 d后可成功诱导小鼠肺纤维化损伤, 高水平的Ang Ⅱ可能协同TGF-β1参与了小鼠的肺纤维化; DIZE可能通过内源性激活ACE2, 降低Ang Ⅱ的高水平, 对小鼠的肺纤维化具有一定的缓解作用。
关键词：小鼠    二脒那秦    血管紧张素转化酶2    Ang Ⅱ-TGF-β1通路    肺纤维化    
Diminazene Aceturate Alleviates Pulmonary Fibrosis in Mice by Endogenous Activation of ACE2 to Inhibit AngⅡ-TGF-β1 Pathway
CAO Xiyue, JI Xiaoxia, ZHANG Chonghao, ZHANG Yafeng, CHEN Yutao, ZHANG Yuanshu     
Key Laboratory of Animal Physiology and Biochemistry of Ministry of Agriculture, College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Corresponding author: ZHANG Yuanshu, E-mail: zhangyuanshu@njau.edu.cn.
Abstract: This study aims at investigating the alleviating effect of diazene aceturate (DIZE) on the development of mouse pulmonary fibrosis by endogenously activating Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2). Bleomycin induced pulmonary fibrosis injury model in mice was established for this aim. Twenty-four male ICR mice were randomly divided into control group (CON group), model group (MOD group) and DIZE group (DIZE group). Mice in the two groups other than CON group were injected with bleomycin (5 mg·kg -1) intratracheal only once to establish pulmonary fibrosis injury model. One day after establishing the model, mice in DIZE group were given DIZE (15 mg·(kg·d) -1) gavage, and mice in CON group and MOD group were given gavage with normal saline at the same dose. After continuous intragastric administration for 28 days, all mice were executed, serum and lung tissue were taken for the following tests: 1) Lung tissue was weighed and lung coefficient was calculated; HE and Masson staining were used to observe the pulmonary histological changes; the content of hydroxyproline in lung tissue was determined by alkaline hydrolysis; 2) The contents of Ang Ⅱ and Ang 1-7 in serum were determined by indirect ELISA; 3) The expression levels of fibrosis related factor genes and proteins in lung tissues were detected by qPCR and Western blot. Results showed that: 1) Compared with CON group, lung coefficient and hydroxyproline content in MOD group increased significantly (P < 0.01 & P < 0.05). The lung tissue showed obvious pathological changes, mainly manifested as alveolar collapse, inflammatory cell infiltration, alveolar septum congestion and thickening, and large amount of collagen fiber deposition. After DIZE treatment, the lung coefficient and hydroxyproline content decreased significantly (P < 0.01 & P < 0.05); The degree of pulmonary fibrosis reduced significantly; 2) Compared with CON group, the expression of ACE2 protein in lung tissue of MOD group was down-regulated, and the content of Ang Ⅱ in serum increased significantly (P < 0.01), the content of Ang 1-7 decreased significantly (P < 0.01); DIZE group showed a reverse on the changes happened in MOD group; 3) Compared with CON group, the expressions of Col1a1 and Col3a1 genes in the lung tissues of MOD group were significantly up-regulated (P < 0.01), α-SMA and TGF-β1 gene and protein expressions were significantly up-regulated (P < 0.01), the expression of the characteristic protein E-cadherin in epithelial cells was significantly down-regulated (P < 0.01); Compared with the MOD group, the DIZE group mitigated the above changes. After 28 days of one-time intratracheal injection of bleomycin, pulmonary fibrosis injury was successfully induced in mice. The production of Ang Ⅱ and the increased expression of TGF-β1 are the major factors of bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice. DIZE may reduce the high level of Ang Ⅱ by activating the expression of ACE2 and thus has a substantial relieving effect on pulmonary fibrosis in mice.
Key words: mice    diminazene aceturate    angiotensin converting enzyme    AngⅡ-TGF-β1 pathway    pulmonary fibrosis    

肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是特发性间质性肺炎(idiopathic interstitial pneumonia，IIP)中慢性致纤维化疾病中的一类。表现为肺部结构扭曲、肌成纤维细胞过度增殖活化、大量炎性细胞浸润、细胞外基质过度沉积等[1]。犬、猫和马等动物也出现了与人肺纤维化相似的临床症状，特别是在成年动物发病、临床病程和治疗方面困难较大[2]。因此，开发或寻找新的药物或治疗靶点是亟待解决的问题。

血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)是2000年发现的肾素-血管紧张素系统的新成员，多年来的研究已经证实，ACE2可将Ang Ⅱ转化为Ang 1-7，发挥舒张血管、抑制细胞增生和抗炎等作用[3]。但在肺纤维化中的研究还处于初步阶段。Rey-Parra等[4]研究证明，ACE2的遗传缺失会加重肺纤维化，同时肺功能下降和运动能力降低。Rathinasabapathy等[5]用重组ACE2蛋白治疗动物肺纤维化，发现肺血管肌化减少，纤维化程度缓解，死亡率降低。Wu等[6]研究证实，Ang Ⅱ通过TGF-β依赖性和独立途径诱导促纤维化因子TGF-β1表达，激活TGF-β1/Smad3信号通路，导致肾小管上皮细胞发生上皮-间质转化。Sygitowicz等[7]研究证实，在没有TGF-β1的情况下，Ang Ⅱ不能导致心肥大和纤维化，但可以诱导TGF-β1合成、Smad2/3磷酸化和Smad复合物易位进入细胞核，并促进Smad2/3与DNA的活性结合。这些研究提示：ACE2在肺纤维化发生发展中具有一定抵抗作用，可能是肺纤维化研究的一个新思路。

二脒那秦(diminazene aceturate, DIZE)是一种经FDA批准的抗寄生虫病药物[8]。动物研究表明，使用DIZE进行慢性治疗会对狗和骆驼造成脑损伤，但对牛、大鼠、小鼠等没有影响，并且DZIE已在早期非洲锥虫病的患者中使用，报道未见重大毒性[9]。近期的研究表明，DIZE具有激活ACE2，从而抑制肺泡上皮细胞中的上皮-间质转化，缓解矽肺纤维化的功能[10]。也有多项研究表明，DIZE可以改善大鼠心纤维化和舒张功能障碍[11]，抑制小鼠肝损伤和胆道纤维化[12]及显著抑制LPS诱导的小鼠肺纤维化[13]等作用。本实验室朱斌[14]首次明确了DIZE通过激活ACE2基因启动子对其转录起始具有激活作用。但DIZE是否可以通过激活ACE2缓解博来霉素诱导的小鼠肺纤维化，以及其作用机制尚不清楚。

总之，随着研究的深入，各种因素，特别是人类新冠病毒对肺功能的损伤及纤维化后遗症等的严重影响，结合前人的研究结果证明ACE2对肺纤维化能起到一定影响及作用，将会对肺纤维化的预防和治疗提供一个新的思路。本试验通过一次性气管内注射博来霉素，构建小鼠肺纤维化损伤模型，用DIZE处理，探究DIZE与肺纤维化及ACE2的相互关系，探讨其相关机制，为从ACE2的角度改善小鼠肺纤维化的研究和治疗奠定基础。

1 材料与方法 1.1 主要试剂及仪器

DIZE购自美国Sigma公司；博来霉素(Bleomycin, BLM)购自海正辉瑞制药有限公司；羟脯氨酸试剂盒购自南京建成生物工程研究所；小鼠Ang Ⅱ和Ang 1-7 ELISA试剂盒购自上海恒远生物科技有限公司；RIPA裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；ECL化学发光检测试剂盒购自上海天能科技有限公司等。转化生长因子TGF-β1抗体、山羊抗兔IgG二抗购自ABclonal公司；内参抗体GAPDH、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、ACE2抗体均购自英国Abcam公司。

Tecan Spark多功能酶标仪(瑞士，Tecan公司)；POWER-PAC300电泳仪和POWER-PAC HC转印仪(美国，Bio-Rad公司)；Tanon-3900全自动化学发光图像分析系统(上海天能科技有限公司)；LightCycler96荧光定量PCR仪(瑞士，Roche公司)等。

1.2 试验动物

6周龄SPF级雄性ICR小鼠，体重32 g± 2 g，购自南京市江宁区青龙山动物养殖基地，许可证号：SCXK(浙)2019-0002。饲养于南京农业大学实验动物中心，温度(22±2)℃，湿度50%~60%，(12 h/12 h)光/暗周期光照。动物试验遵循南京农业大学动物伦理规范要求(GB/T 35892-2018)。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与处理 　　24只ICR小鼠，分笼饲养1周后，随机分为对照组(CON组)、模型组(MOD组)和二脒那秦组(DIZE组)。各组处理见表 1。

表 1 小鼠分组及处理(n=8) Table 1 Group and treatment table of mice (n=8)

每笼8只，自由采食和饮水。每日观察各组小鼠精神状况等，试验周期为4周。

1.3.2 样品采集 　　连续灌胃至第28天，每只小鼠眶下静脉采血，3 000 r·min-1离心取血清，-20 ℃保存。所有小鼠颈椎脱臼处死，剖检取肺称重，按如下公式计算肺系数。

$ {\rm{肺系数}}={\rm{肺质量}}({\rm{mg}})/{\rm{小鼠体重}}({\rm{g}}) $
1.3.3 肺病理组织学切片制作

1.3.3.1 HE染色　　小鼠处死后，剪取一部分右上肺叶组织置于4%多聚甲醛固定24 h。后续组织切片的制作及HE染色交由武汉赛维尔生物科技有限公司进行。光学显微镜下观察。

1.3.3.2 Masson染色　　将制作好的石蜡切片脱水，Weigert铁苏木素染色，酸性乙醇分化液分化、水洗，Masson蓝化液蓝化，品红染液染色，苯胺蓝染色液复染，脱水后，光学显微镜下观察。

1.3.4 肺组织中羟脯氨酸含量的测定 　　取各组小鼠肺组织30 mg，碱水解法测定其中羟脯氨酸的含量。具体按照试剂盒说明书步骤进行操作，550 nm波长处检测吸光度(A)值。按照如下公式计算：

$\begin{array}{*{20}{c}} {{\rm{羟脯氨酸含量}}}\\ {\left( {\mu {\rm{g}} \cdot {\rm{m}}{{\rm{g}}^{ - 1}}{\rm{组织}}} \right)} \end{array} =\frac{A_{\text {测定 }}-A_{\text {空白 }}}{A_{\text {标准 }}-A_{\text {空白 }}} \times C_{\text {标准 }} \times \frac{V_{\text {水解液 }}}{W} $

V水解液：水解液总体积，5 mL；W：组织质量，mg

1.3.5 血清中Ang Ⅱ和Ang 1-7含量的测定 　　间接ELISA法测定。按照试剂盒说明书方法操作，450 nm波长处测定各孔吸光度值，根据标准品得出标准曲线及回归方程，计算出各组Ang Ⅱ和Ang 1-7的含量(单位: pg·mL-1)。

1.3.6 肺组织中纤维化相关因子基因表达水平的RT-qPCR检测

1.3.6.1 引物设计　　利用Primer Premier 5.0设计Col1a1、Col3a1、α-SMA、TGF-β1和内参GAPDH引物，引物参数指标见表 2，引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

表 2 目的基因和内参引物序列 Table 2 Primer sequences of target genes and GAPDH

1.3.6.2 总RNA提取及反转录　　取各小鼠肺组织约100 mg放入匀浆管中，加入1 mL Trizol Reagent匀浆，提取肺组织总RNA，紫外分光光度测定总RNA浓度。然后根据反转录试剂盒说明书步骤将总RNA反转录为cDNA，-20 ℃保存。

1.3.6.3 qPCR扩增　　以c DNA为模板进行qPCR。按下述反应体系进行Real-time qPCR反应：2×SYBR Green Pro Taq HS Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。扩增程序：95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。数据使用2-ΔΔCt法进行分析。

1.3.7 肺组织中α-SMA、TGF-β1、E-cadherin及ACE2蛋白表达水平的Western blot检测 　　取各组小鼠肺组织100 mg，加入RIPA蛋白裂解液匀浆，离心，收集上清液获得总蛋白提取物。BCA法测定蛋白浓度，并统一蛋白浓度。取30 μg蛋白按照浓缩胶80 V、分离胶110 V的条件，进行SDS-PAGE电泳；随后选用PVDF膜，100 V，湿法转印90 min；转印结束后，5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST洗膜，分别加入一抗(α-SMA、TGF-β1、E-cadherin、ACE2及GAPDH兔源抗体均为1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜；TBST洗膜，加入羊抗兔二抗(1∶10 000稀释) 室温孵育。TBST洗膜，ECL显影，凝胶成像系统分析并拍照。Image J软件检测各蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参蛋白，以目的蛋白与内参蛋白的灰度值之比定量分析蛋白相对表达水平。

1.3.8 统计学分析 　　所有数据均以“均数±标准误($ \bar x \pm {s_{\bar x}}$)”的形式表示，采用GraphPad Prism 8.0.1软件进行数据分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。P＜0.05，认为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 小鼠肺纤维化损伤模型的建立

2.1.1 小鼠肺系数及羟脯氨酸含量的变化 　　结果如表 3所示。与CON组相比，MOD组小鼠肺系数极显著升高(P＜0.01)，肺组织中羟脯氨酸含量显著升高(P＜0.05)；DIZE组小鼠肺系数和羟脯氨酸含量显著或极显著低于MOD组(P＜0.05 & P＜0.01)。结果提示：博来霉素处理可引起小鼠肺组织重量增加及羟脯氨酸的含量升高，DIZE处理缓解了博来霉素处理导致的肺组织重量增加及羟脯氨酸含量的升高。

表 3 小鼠肺系数、肺组织羟脯氨酸含量($ \bar x \pm {s_{\bar x}}$，n=8) Table 3 Lung index, hydroxyproline content in lung tissue of mice ($ \bar x \pm {s_{\bar x}}$, n=8)
2.1.2 肺病理组织学观察结果

2.1.2.1 HE染色结果　　如图 1所示。CON组小鼠肺组织结构正常，肺泡间隔和肺泡腔结构正常，无炎症细胞浸润和间质增生。MOD组小鼠肺组织结构混乱，肺泡塌陷，肺间质增厚，有大量炎性细胞浸润，伴有充血现象(如箭头所示)。与MOD组相比，DIZE处理后小鼠肺泡塌陷、肺泡间隔增厚、肺组织结构破坏程度减轻，炎性细胞浸润减少。

图 1 小鼠肺组织HE染色结果(200×) Fig. 1 Results of HE staining of mouse lung tissue (200×)

2.1.2.2 Masson染色结果　　Masson染色是一种经典的胶原纤维染色方法，通过Masson染色胶原纤维染为蓝色，肌纤维染为红色。结果见图 2。CON组小鼠肺组织中蓝色胶原纤维沉积较少，肺泡壁结构完整。MOD组可见有大量蓝色胶原纤维沉积，且有纤维结节生成(如箭头所示)。DIZE组小鼠肺组织蓝色胶原纤维较MOD组明显减少。

图 2 小鼠肺组织Masson染色结果(200×) Fig. 2 Results of Masson staining of mouse lung tissue (200×)
2.2 小鼠肺组织ACE2蛋白表达及血清Ang Ⅱ和Ang 1-7含量变化

2.2.1 肺组织中ACE2蛋白表达结果 　　结果如图 3所示。与CON组相比，MOD组小鼠肺组织中ACE2蛋白表达极显著下调(P＜0.01)。DIZE处理小鼠肺组织中ACE2蛋白表达水平较CON组和MOD组均极显著上调(P＜0.01)。提示：ACE2参与了小鼠的肺纤维化损伤过程，DIZE处理可内源性激活ACE2。

与CON组相比，**.P＜0.01；与MOD组相比，##.P＜0.01 Compared with CON, **. P < 0.01; Compared with MOD, ##. P < 0.01 图 3 小鼠肺组织ACE2蛋白表达($ \bar x \pm {s_{\bar x}}$，n=8) Fig. 3 Expression of ACE2 protein in mouse lung tissue ($ \bar x \pm {s_{\bar x}}$, n=8)

2.2.2 血清中Ang Ⅱ和Ang 1-7的含量 　　由表 4可见，与CON组相比，MOD组小鼠血清Ang Ⅱ含量极显著升高(P＜0.01)，Ang 1-7含量极显著降低(P＜0.01)；DIZE处理组二者含量均显著低于对照组(P＜0.05)。与MOD组相比，DIZE组Ang Ⅱ含量极显著低于MOD组(P＜0.01)，Ang 1-7含量显著高于MOD组(P＜0.05)。提示，DIZE处理激活的ACE2，高活性的ACE2降解Ang Ⅱ产生Ang 1-7能力增强。

表 4 小鼠血清Ang Ⅱ、Ang 1-7含量($ \bar x \pm {s_{\bar x}}$，n=8) Table 4 Serum Ang Ⅱ and Ang 1-7 levels in mice ($ \bar x \pm {s_{\bar x}}$, n=8) 
2.3 小鼠肺组织纤维化相关基因的表达结果

结果如图 4所示。与CON组相比，MOD组小鼠肺组织中细胞外基质的主要成分——Col1a1，Col3a1，肌成纤维细胞的标志蛋白α-SMA以及促纤维化因子TGF-β1的基因表达均极显著上调(P＜0.01)，DIZE组以上4个基因的表达均极显著低于MOD组(P＜0.01)。与CON组相当。提示：MOD组小鼠肺组织中有大量的细胞外基质产生，且过度沉积。DIZE处理能够减少以上基因的过度表达，具有一定的缓解作用。

与CON组相比，**.P＜0.01；与MOD组相比，##.P＜0.01 Compared with CON, **. P < 0.01; Compared with MOD, ##. P < 0.01 图 4 小鼠肺组织纤维化相关基因的表达(n=8) Fig. 4 Expression of fibrosis related genes in mouse lung tissue (n=8)
2.4 小鼠肺组织纤维化相关蛋白的表达结果

结果如图 5所示。与CON组相比，MOD组小鼠肺组织中上皮细胞标志蛋白E-cadherin的表达水平极显著下调(P＜0.01)；DIZE处理较MOD组上调，但无显著差异(P>0.05)。MOD组小鼠肺组织中促纤维因子TGF-β1及α-SMA蛋白表达均极显著高于对照组(P＜0.01)；DIZE处理组TGF-β1及α-SMA蛋白表达显著低于MOD组(P＜0.01、P＜0.05)。与基因表达结果趋势一致。

与CON组相比，**.差异极显著(P＜0.01)；与MOD组相比，#.差异显著(P＜0.05)，##.差异极显著(P＜0.01) Compared with CON, **. P < 0.01; Compared with MOD, #.P < 0.05, ##. P < 0.01 图 5 小鼠肺组织纤维化相关蛋白的表达(n=8) Fig. 5 Expression of fibrosis related proteins in mouse lung tissue (n=8)
3 讨论 3.1 小鼠肺纤维化模型的建立

肺纤维化是以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱，肺间质纤维化为特征的疾病，发病率高，预后差，由纤维化级联驱动，如上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal trans differentiation, EMT)、细胞外基质(extracellular matrix, ECM)产生和肺部胶原蛋白的生成[15]。主要表现为肺组织充满大量炎性细胞，纤维组织增生，其标志性指标主要是TGF-β1表达上调，以及肺系数和羟脯氨酸含量增加。羟脯氨酸是纤维中标志性氨基酸之一，其含量越高，表明纤维化程度越高。

动物模型对研究PF发病机制、开发和研究潜在药物具有重要作用[16]。博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型被广泛用于研究人类PF，并用作评估临床应用的新型抗纤维化药物的筛选[15]。博来霉素是从轮生链霉菌中提取出来的一种抗肿瘤药物，可引起肺纤维化，其诱导的肺纤维化模型与人肺纤维化病变相似，因此成为构建肺纤维化模型的常用药物[17]。可通过气管、腹腔、静脉、皮下等给药途径给药，其中, 气管给药具有单次给药即可诱导肺纤维化，且时间短、临床相关性好等优点。Sun等[18]用气管内注射博来霉素成功制备了小鼠肺纤维化损伤模型，肺组织表现为肺泡壁增厚，炎性细胞浸润到间质以及胶原蛋白沉积。本试验参照Sun等[18]的方法，采用气管单次注射博来霉素(5 mg·kg-1)的方法给药小鼠，28 d后，小鼠表现精神不振，呼吸急促，毛发凌乱、缺少光泽，肺组织呈现弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱，肺间质大量胶原纤维沉积，肺系数和羟脯氨酸含量增加。与Sun等[18]的结果一致，本试验成功建立了小鼠肺纤维化损伤模型。可用于后续试验。

3.2 DIZE通过激活ACE2表达缓解小鼠肺纤维化

研究已经证实，ACE2在心肌和肺中发挥重要作用，其表达降低时可发生心肌肥大、心力衰竭、肺损伤、肺炎、肺纤维化等相关疾病[19]，且证实ACE2能够将Ang Ⅱ转化为Ang1-7，从而发挥抗炎、抗纤维化的作用。最近的研究表明，DIZE能够激活ACE2，该功能在与心血管、肺和肾系统相关的多种病理学中显示出有益和保护作用[20]。Lambert等[21]在试验性肺纤维化动物模型中检测到Ang Ⅱ水平升高，通过AT1受体拮抗剂和ACE抑制剂可降低肺损伤程度，提示Ang Ⅱ在肺纤维形成中起重要作用。Shenoy等[22]通过DIZE处理大鼠心肌梗死模型4周后，结果发现改善了心重塑，并且证实该过程与ACE2 mRNA和蛋白质表达上调有关。

本研究使用15 mg·(kg·d) -1 DIZE处理博来霉素诱导的肺纤维化小鼠28 d，发现MOD组小鼠肺组织中ACE2蛋白表达下调，Ang Ⅱ含量升高；相反，DIZE处理使ACE2蛋白表达上调，Ang Ⅱ含量降低。说明肺局部高水平的Ang Ⅱ参与了小鼠肺纤维化损伤的发生发展，Lambert等[21]研究结果一致。提示DIZE内源性激活ACE2的表达，可以通过降低Ang Ⅱ，改善小鼠肺功能的损伤和肺组织的纤维化。

3.3 DIZE对肺纤维化相关基因和蛋白表达的影响

研究发现，肺泡毛细血管屏障基底膜完整性的破坏、上皮细胞和内皮细胞的再生修复功能抑制、转化生长因子-β(TGF-β)信号功能异常均参与了肺间质纤维化的形成。研究已经证实，在EMT过程中E-cadherin表达受到抑制，上皮细胞间的黏连被破坏，转变为具有迁移能力的间质细胞[23]。另外，肌成纤维细胞是纤维化过程中产生细胞外基质的主要细胞类型，特征性表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，产生具有收缩功能的胶原(Colla1、Col3a1)[24]。Xu等[25]在二氧化硅诱导的小鼠肺纤维化组织中检测到α-SMA、Colla1及Col3a1表达上调。TGF-β1也是迄今发现的最强的促进细胞外基质积聚或沉积的因子。已有研究证实TGF-β参与肺、肾、肝等脏器纤维化的发生和发展过程[26]。TGF-β在哺乳动物中有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 3种存在形式，其中致纤维化作用最为明显的是TGF-β1[27]。

本试验采用RT-qPCR或Western blot法分别检测了肺组织中以上与纤维化相关因子的基因或蛋白表达水平，进一步研究了DIZE的作用及其内源性激活ACE2对小鼠肺纤维化的作用及其机制。结果发现，与对照组相比，模型组小鼠肺组织中上皮细胞标记物E-cadherin蛋白表达水平下调，间质细胞标记物α-SMA和TGF-β1的基因和蛋白表达均上调，同时Col1a1和Col3a1基因表达上调，提示博莱霉素诱导的小鼠发生纤维化的过程中上皮细胞减少，成纤维化细胞及肌成纤维细胞增多，细胞外基质大量产生，且过度沉积。DIZE处理后，以上纤维化损伤得到缓解。

肺纤维化时TGF-β1表达的升高，可促进小鼠的肺纤维化进程。α-SMA大量出现，致细胞合成大量的Colla1、Col3a1，细胞外基质异常沉积加剧。本研究结果发现博莱霉素诱导小鼠肺纤维化损伤时肺组织及血液中Ang Ⅱ的含量及TGF-β1的表达均有明显升高，即AngⅡ-TGF-β1作为一种通路促进了肺纤维化。Ang Ⅱ可能通过TGF-β依赖性和独立途径在肺纤维形成中发挥了促进或协同作用，相关具体机制有待进一步研究。

4 结论

二脒那秦(DIZE)可以通过激活内源性激活血管紧张素转化酶2(ACE2)降解Ang Ⅱ，缓解小鼠肺纤维化，提示ACE2或DIZE改善肺纤维化的开发潜力，也为从ACE2的角度对肺纤维化的研究和治疗提供思路。

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(编辑   白永平)