2. 秦岭大熊猫研究中心(陕西省珍稀野生动物救护基地), 周至 710400
, ZHANG Qiang2, QU Jiahao1, WU Yaping2, HU Ruochen1, JIA Ruoyi2, GUO Ruhai1, MA Qingyi2, PAN Guanglin2
, WANG Xinglong1
2. Research Center for Qinling Giant Panda(Shaanxi Rare Wildlife Rescue Base), Zhouzhi 710400, China
大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)是以竹为主食的食肉目(Carnivora)动物，是我国特有的珍稀保护动物[1]，因其具有独特的饮食结构备受关注。消化系统疾病是导致大熊猫等野生动物数量减少以及种群濒危的重要因素之一[2]，当大熊猫的生活方式、饮食结构等因素发生变化时，可能导致肠道菌群的失衡，进而引发肠道性疾病并使机体处于亚健康状态甚至出现死亡[3-4]，因此研究大熊猫肠道菌群的结构组成，对保护大熊猫具有重要的意义。
肠道菌群在大熊猫的生长发育、营养吸收、代谢以及免疫等方面发挥重要作用[5-6]，由于目前暂未发现大熊猫体内含有与纤维素降解直接相关的基因，因此推测其主要依赖肠道菌群产生纤维素酶或编码纤维素代谢相关的基因来进行降解[7]。先前的研究表明，厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)是大熊猫肠道内主要优势菌门[8]，且年龄对大熊猫肠道菌群结构和数量会产生一定的影响[9]，但对于不同年龄段大熊猫在肠道菌群多样性、结构组成和功能上的动态变化及演替规律研究尚浅。因此本试验采集了16只不同年龄段大熊猫的新鲜粪便，基于16 S rRNA高通量测序技术[10]和层次聚类结果分为不同年龄段的5组进行分析，以探究不同年龄段大熊猫肠道菌群多样性、结构组成和功能的演替规律，为大熊猫肠道性疾病的防治提供思路。
1 材料与方法 1.1 样本采集与分组在秦岭大熊猫研究中心采集不同年龄段大熊猫的新鲜粪便共16份(表 1)，采样期间大熊猫状态良好，无疾病等异常情况，粪样采集后用冰盒保存带回实验室，-20 ℃冷冻保存。
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表 1 大熊猫基本信息 Table 1 Basic information of giant panda |
依照DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书步骤进行操作，提取粪便中所有细菌DNA，利用PCR扩增试剂盒结合引物515F-806R对细菌DNA的16 S rDNA V4区域进行扩增(前端引物：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′，后端引物：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，并对PCR产物的片段长度和浓度进行筛选，主带长度筛选条件为290~310 bp。按照标准流程进行建库操作，检测合格的文库用Illumina Nova 6000平台进行双末端250 bp测序。
1.3 数据分析fastp 0.23.2[11]软件对测序原始数据进行质控，usearch 10.0软件的UPARSE聚类方法对非重复序列进行聚类，以97% 相似性水平将有效序列聚类成操作分类单元(operational taxonomic units, OTU)，并基于SILVA数据库进行物种注释。ggplot2 3.3.6绘制样品的丰富度稀释曲线(richness rarefaction curve)以反映样品中微生物多样性信息，使用平均连接法(average-linkage clustering)的聚类分析方法和Chisq距离算法对样品进行层次聚类(hierarchical clustering)，并将聚类结果与属水平上物种相对丰度整合。QIIME 2 2 021.2软件计算样品的Chao1、Simpson和Dominance等Alpha多样性指数[12-13]，并基于单因素方差分析(one-way ANOVA)比较各指数间差异，R软件的vegan包进行非参数多元方差分析(non-parametric multivariate analysis of variance，ADONIS)和非度量多维尺度分析(non-metric multidimensional scaling，NMDS)，均采用bray_curtis距离算法。
ggplot2包绘制门和属水平肠道菌群共有以及特有OTUs的venn图，及肠道菌群相对丰度的柱状堆叠图，基于PICRUSt2软件分析各组间在COG(clusters of orthologous groups)的L2水平和KEGG通路(KEGG pathway database)的L2水平上的功能组成，进行通路聚类分析，其中聚类方式选择average。数据以“
对下机数据进行质控、拼接和去噪后，16份粪便样品共获得1 235 229条高质量序列，平均每个样品77 202条序列。基于97%相似性水平进行OTU聚类，共获得1 707个OTU，包括12个门，22个纲，47个目，68个科，90个属。
以重抽样抽出的序列数比例作为横坐标，OTU水平下物种丰富度(species richness)作为纵坐标，进一步构造物种稀释性曲线。由图 1可知，随着抽出序列数比例的增加，肠道菌丰富度先显著升高，后趋于平缓，这表明随着样品序列数量不断增加，检测到大熊猫肠道菌的种类数目逐渐稳定，即便样品序列数继续增加，检测到新的肠道菌种类也是有限的。因此本试验的测序数据量足够大，能够检测到样品中绝大部分的微生物信息，可用于后续分析。
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图 1 97%相似度水平下各样品的肠道菌群丰富度稀释曲线 Fig. 1 Dilution curve of intestinal flora abundance of each sample at 97% similarity level |
层次聚类分析能反映样品的肠道菌群结构及样品间的相似度。结果显示(图 2)，编号为16的老年大熊猫肠道菌群结构单独聚为一个类别，其余大熊猫聚为一个类别。编号为1、2、3、4的亚成年大熊猫位于同一树杈分支点下，编号为5、6，编号为9、10及编号为13、14、15的成年大熊猫分别聚类到不同的树杈分支点下，且相同年龄的雌性和雄性大熊猫肠道菌群没有明显差异。依据层次聚类结果，将16只大熊猫分为5组(表 2)，分别为2~3岁亚成年组(G1)、8~9岁成年组(G2)、13~14岁成年组(G3)、18~22岁成年组(G4)、34岁老年组(G5)。年龄相近的大熊猫肠道菌群结构相似性较高，年龄差异越大的肠道菌群结构差异越大，从而形成鲜明的菌群差异派别。
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聚类树后的数字为大熊猫编号，黑色数字表示雌性大熊猫，棕色数字表示雄性大熊猫 The number behind the cluster tree is the giant panda number, black numerals refer to female giant pandas and brown numerals refer to male giant pandas 图 2 各样品在属水平的层次聚类分析 Fig. 2 Hierarchical cluster analysis of samples at genus level |
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表 2 大熊猫分组信息 Table 2 Group information of Giant pandas |
Alpha多样性指数包括Chao 1指数、Simpson指数和Dominance指数等，能够分别衡量大熊猫肠道菌群丰富度、群落多样性以及物种均匀度等，其中Simpson指数值与群落多样性呈负相关。结果可知，不同年龄组的大熊猫在Chao1指数上无显著差异(P＞0.05)，2~3岁亚成年组和34岁老年组的Simpson指数显著高于18~22岁成年组(P＜0.05)，老年组的Dominance指数显著低于18~22岁成年组(P＜0.05)(表 3)。上述结果表明，不同年龄段大熊猫在菌群丰富度上差异不大，2~3岁亚成年大熊猫的肠道菌群在群落多样性上明显低于18~22岁大熊猫，34岁老年大熊猫在肠道微生物群落多样性以及均匀度上明显低于18~22岁大熊猫。综合3个指数结果表明，大熊猫肠道菌群Alpha多样性随着年龄增大呈现先增加后降低的趋势，且在18~22岁达到最高。
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表 3 不同年龄组大熊猫肠道菌群Alpha多样性指数( |
Beta多样性能对不同样本间的微生物群落构成进行比较。NMDS分析能在二维平面判断群落组成差异，结果如图 3所示，2~3岁亚成年大熊猫的肠道菌群较为聚集，与其余4组存在一定距离，而8~9、13~14及18~22岁成年大熊猫肠道菌群分离较明显，组间距离近。ADONIS分析能判断分组效果是否显著，结果可知，除仅有34岁大熊猫所在的G6不参与组间差异比较外，其余各比较组在OTU水平差异程度均>0.25且＜0.5，说明组间存在差异，但差异不大，且除G3 vs G4比较组外，其余差异比较组的P值均＜0.05，说明不同分组对样品差异的解释具有可信度(表 4)。综合以上结果表明，虽然各组内肠道菌群存在差异，但组间差异仍大于组内差异，即该分组具有可信度。
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图 3 不同年龄组间肠道菌群NMDS分析 Fig. 3 NMDS analyze of intestinal flora between different age groups |
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表 4 不同年龄比较组间ADONIS统计结果 Table 4 Statistical results of ADONIS between different age groups |
首先从门水平对大熊猫共有以及特有肠道菌群进行分析，如图 4A所示，5个年龄段组包含6个共有肠道菌门，34岁组包含1个特有菌门，为蓝细菌门(Cyanobacteria)。如图 5A所示，5个年龄组中共有优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和Epsilonbacteraeota，平均丰度为60.44%、38.69%和5.37%；变形菌门在2~3岁组的相对丰度最高，为66.50%；厚壁菌门在34岁组的相对丰度最高，为70.73%，由此推断出，随着大熊猫年龄增长，厚壁菌门的相对丰度逐渐增加，变形菌门的相对丰度逐渐降低。
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A. 在门水平的花瓣Venn图；B.在属水平的花瓣Venn图。图中不同颜色代表不同的分组，重叠区域表示5个年龄段共有的功能数目，非重叠区域表示5个年龄段各自特有的功能数目 A. Venn diagram of petals at the door level; B. Venn diagram of petals at the genus level. Different colors in the figure represent different groups. Overlapping areas represent the number of functions shared by the five age groups, while non overlapping areas represent the number of functions unique to each of the five age groups 图 4 大熊猫肠道菌群在门水平(A)和属水平(B)的Venn图 Fig. 4 Venn diagram of intestinal flora of giant pandas at phyla level (A) and genus level (B) |
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A. 门水平的物种相对丰度；B. 属水平的物种相对丰度。不同颜色表示不同肠道菌种类 A. Species relative abundance at the phyla level; B. Species relative abundance at the genus level. Different colors indicate different types of intestinal bacteria 图 5 大熊猫肠道菌群在门水平(A)和属水平(B)的物种相对丰度 Fig. 5 Species relative abundance of giant panda intestinal flora at phyla level (A) and genus level (B) |
在属水平上，如图 4B所示，5个年龄段组包含42个共有肠道菌属，2~3岁组包含7个特有菌属，占比前两个分别为冷杆菌属(Psychrobacter)和梭状芽胞杆菌属(Shuttleworthia)；8~9岁组包含7个特有菌属，占比前两个分别为Ruminiclostridium_5和帕拉苏特菌属(Parasutterella)；13~14岁组包含5个特有菌属，占比前两个分别为海洋芽胞杆菌属(Oceanobacillus)和根瘤菌属(Rhizorhapis)；18~22岁组包含3个特有菌属，占比前两个分别为黄杆菌属(Luteolibacter)和假黄色单胞菌属(Pseudoxanthomonas)；34岁组包含1个特有菌属，为Aliterella_CENA595。如图 5B所示，5个年龄组中共有优势菌属为变形菌门的埃希菌属-志贺菌属(Escherichia/Shigella)和厚壁菌门的狭义梭菌属1(Clostridium_sensu_stricto_1)，平均丰度分别为57.35%和15.17%；13~14岁组的优势菌属为魏斯菌属(Weissella)，其平均丰度为9.975%，显著高于其他四组(P＜0.05)，34岁组的优势菌属为八叠球菌属(Sarcina)，其平均丰度为53.29%，显著高于其他4组(P＜0.05)。
2.5 大熊猫肠道菌群基因功能预测通过统计COG的L2水平和KEGG通路的L2水平上的功能组成和丰度信息，并进行聚类分析，能预测出不同年龄段大熊猫的肠道菌群基因在功能上的差异。如图 6所示，在COG的L2水平上，13~14岁成年大熊猫肠道菌群基因在细胞运动(cell motility)功能的相对丰度最低，在脂质转运与代谢(lipid transport and metabolism)的相对丰度最高；34岁老年大熊猫在碳水化合物转运和代谢(carbohydrate transport and metabolism)、氨基酸转运和代谢(amino acid transport and metabolism)的相对丰度低于其他年龄段大熊猫，在转录(transcription)、防御机制(defense mechanisms)、信号转导机制(signal transduction mechanisms)的相对丰度高于其他年龄段大熊猫。如图 7所示，在KEGG通路的L2水平上，G2、G3、G4 3个成年大熊猫组别在代谢相关的途径上相对丰度相似，2~3岁亚成年大熊猫在信号传导途径(signal transduction)的相对丰度高于成年和老年大熊猫；34岁老年大熊猫在其他次级代谢物的生物合成途径(biosynthesis of other secondary metabolites)、复制和修复途径(replication and repair)、细胞生长与死亡途径(cell growth and death)等方面的相对丰度高于其他年龄段。由此可推断出，不同年龄段大熊猫肠道菌群中基因功能存在差异。
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横轴为不同分组，纵轴为各个COG编号，左侧聚类树为功能聚类树，上方聚类树为样品聚类树，色块表示每个分组对应的COG相对丰度，丰度高低用颜色深浅来表征 The horizontal axis refers to different groups, and the vertical axis refers to each COG number, the left clustering tree refers to the functional clustering tree, the upper clustering tree refers to the sample clustering tree. The color block represents the relative abundance of COG corresponding to each group, and the abundance is represented by the color depth 图 6 大熊猫肠道菌群基因功能在COG的L2水平的聚类热图 Fig. 6 Cluster heat map of gene function of giant panda intestinal flora at L2 level of COG |
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横轴为不同分组，纵轴为各KO编号，左侧聚类树为功能聚类树，上方聚类树为样品聚类树，色块表示每个分组对应的KO相对丰度，丰度高低用颜色深浅来表征 The horizontal axis refers to different groups, the vertical axis refers to each KO number, the left clustering tree refers to the functional clustering tree, the upper clustering tree refers to the sample clustering tree, and the color block refers to the relative abundance of KO corresponding to each group. The abundance is represented by the color depth 图 7 大熊猫肠道菌群基因功能在KEGG通路的L2水平的聚类热图 Fig. 7 Cluster heat map of gene function of giant panda intestinal flora at L2 level of KEGG pathway |
机体的消化代谢、免疫功能等与肠道菌群多样性息息相关，肠道菌群能通过刺激肠道上皮分泌黏液等多种途径加强肠道的屏障保护作用，以维持肠道结构完整性，当肠道菌群多样性降低时，肠道黏膜修复能力下降，更易引起病原体的侵入和肠道性疾病的发生[14-15]。Xue等[16]报道，雌性和雄性大熊猫肠道菌群没有显著性差异，本试验层次聚类结果也表明，相同年龄的雌性和雄性大熊猫肠道菌群结构没有明显差异，所以性别差异对本试验没有影响。
大熊猫年龄划分一直存在争议，胡锦矗曾根据大熊猫咬节值及粪团直径将大熊猫分为幼年组(0~1.5岁)、青年组(1.5~5.5岁)、成年组(5.5~20岁)和老年组(20岁以上)，而胡杰等[17]基于离差平方和聚类的方法对大熊猫年龄划分进行了优化，并认为该方法避免了人为因素，值得进一步实践和推广。但上述基于咬节值的年龄划分结果中，成年组跨度均较大，直接应用于大熊猫肠道菌群结构分析难以具有说服力，因此本试验采用层次聚类方法，通过聚类图对11只成年大熊猫进一步分组，最终将16只大熊猫分为2~3岁亚成年组(4只)、8~9岁成年组(4只)、13~14岁成年组(4只)、18~22岁成年组(3只)及34岁老年组(1只)，并通过Beta多样性分析得出，除仅有34岁大熊猫所在的G5不参与组间差异比较外，其余各组的组间差异均大于组内差异，即该分组具有可信度。层次聚类结果还显示，34岁老年大熊猫与亚成年、成年大熊猫肠道菌群的结构组成差异较大，罗亚等的研究结果也表明，亚成年、成年大熊猫在肠道菌群结构和优势菌群上与老年大熊猫具有显著差异[14]。这提示大熊猫肠道菌群结构随年龄增长处于动态变化过程中，饲养人员需要在大熊猫不同年龄阶段(尤其是老年阶段)补充不同的营养物质以维持肠道菌群的稳态。
崔明全等[18]的研究显示，成年圈养大熊猫的肠道菌群Alpha多样性最高，其次分别是亚成体和老年体。本试验进一步完善了崔明全等[18]的研究结论，即不同年龄段大熊猫肠道菌群Alpha多样性具有显著差异(P＜0.05)，其中群落多样性及均匀度呈现随年龄增长先增加后降低的趋势，在18~22岁达到最高。
大熊猫的肠道优势菌群以及与纤维素、半纤维素降解相关酶的丰度与食肉动物接近，而显著不同于食性相似的食草动物[19]。Tun等[20]证实，厚壁菌门和变形菌门是老年和成年大熊猫中最丰富的微生物群，且不同年龄段的大熊猫肠道内优势菌群既有相似性，也存在一定差异[21]。在门水平，本试验中不同年龄段的大熊猫共有优势菌门为厚壁菌门、变形菌门和Epsilonbacteraeota，且随着大熊猫年龄增长，厚壁菌门的相对丰度逐渐增加，变形菌门的相对丰度逐渐降低。目前对Epsilonbacteraeota的研究极少，据Waite等[22]报道，该门与变形菌门联系紧密，近些年才将变形菌门下的一些菌属划分到Epsilonbacteraeota，Yang等[23]的试验结果也证实，给高脂肪小鼠饮食补充香菇多糖时，变形菌门和Epsilonbacteraeota的变化趋势一致，由此推测Epsilonbacteraeota在大熊猫肠道中的功能和变形菌门相似。此外，老年大熊猫包含1个特有菌门，为蓝细菌门。蓝细菌是广泛分布于各种水体、土壤等地的光合细菌，在大熊猫采食竹子或饮水时进入体内，未被消化的蓝细菌随粪便排出体外，王立志和徐谊英[24]也在大熊猫粪便中发现过蓝细菌，推测它仅作为路过菌存在于大熊猫肠道中，与消化吸收无关。
在属水平上，本试验不同年龄段大熊猫共有优势菌属为变形菌门的埃希氏菌属-志贺氏菌属和厚壁菌门的狭义梭菌属1，梭菌属是常见的纤维素降解菌，埃希氏菌属能够维持大熊猫肠道内微生态平衡，这些菌属与大熊猫降解竹子中纤维素关系密切[25]。优势菌属间的相互作用会影响大熊猫对纤维素的消化能力，如Guo等[26]的研究结果显示，圈养大熊猫纤维素酶活性偏低，导致消化竹子的能力弱于野生大熊猫，其原因与肠道菌群结构和优势菌属的差异相关。本试验中13~14岁大熊猫特有的肠道优势菌属为魏斯菌属，34岁老年大熊猫特有的优势菌属为八叠球菌属。魏斯菌是广泛分布于发酵食物、发酵植物和土壤等处的一类乳酸菌，可以抑制人体肠道内腐败细菌的增殖，降低腐败霉菌素的产生[27-28]。魏斯菌为成年大熊猫肠道内的优势菌，说明其肠道处于较为健康的状态[29]，这也提示魏斯菌可进一步分离研究以制成大熊猫益生菌菌剂，从而抑制肠道内病原菌的滋生，提高大熊猫免疫水平。八叠球菌为革兰阳性厌氧性球菌，Debey等[30]和Owens等[31]的研究结果表明，八叠球菌为致病菌，黑猩猩感染后出现的“动物流行性神经和胃肠综合征”以及人类感染后出现的胃扩张和肺气肿性胃炎与其相关，但暂无大熊猫感染的相关报道，且本次采样时老年大熊猫表观健康，因此推测八叠球菌属是大熊猫肠道内的条件致病菌，在特定条件下会引起肠道疾病，且在抵抗力较弱的老年大熊猫肠道内相对丰度最高，不过这种推测有待进一步研究确认。
对大熊猫肠道菌群功能进行预测可得，不同年龄段大熊猫肠道菌群的功能存在差异，尤其是34岁老年大熊猫在碳水化合物转运和代谢、氨基酸转运和代谢方面相对丰度最低，在转录、防御机制、信号转导机制的相对丰度高于其他年龄段。Yang等[32]的研究结果表明，圈养野猪的小肠中由于梭状芽胞杆菌等微生物的富集，致使其在小分子营养物质代谢、氨基酸的合成、碳水化合物代谢等功能上丰度较高。猪作为一种杂食动物，与大熊猫在肠道菌群组成上存在相似性，由此可推测大熊猫肠道菌群在碳水化合物转运和代谢、氨基酸的转运和代谢功能上的富集与梭菌属的相对丰度存在一定联系。此外，转录通路和信号转导通路的激活与肠道炎性反应、代谢紊乱等密切相关[33-34]，防御机制通路的激活也表明肠道中可能存在应激源，这提示34岁老年大熊猫更易受到病原体的侵害，所以在饲喂老年尤其是高龄大熊猫时，需要格外注意其饮食卫生，可适量补充抗生素。
4 结论大熊猫肠道菌群多样性、结构及功能随年龄变化呈现一定演替规律。随年龄增长，厚壁菌门的相对丰度逐渐增加，变形菌门的相对丰度逐渐降低，肠道菌群Alpha多样性先增加后降低，在18~22岁达到最高。13~14岁大熊猫特有的优势菌属——魏斯菌属为肠道益生菌，34岁老年大熊猫特有的八叠球菌属为条件致病菌。结果为大熊猫肠道菌群研究数据作了进一步完善，同时可为大熊猫的饲养管理和疾病预防提供指导。
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(编辑 白永平)