2. 四川省动物疫病预防控制中心, 成都 610041;
3. 西藏自治区 动物疫病预防控制中心, 拉萨 850000;
4. 青海省海北州海晏县畜牧兽医站, 海晏 810200
2. Sichuan Center for Animal Disease Control and Prevention, Chengdu 610041, China;
3. Tibet Autonomous Region Center for Animal Disease Control and Prevention, Lhasa 850000, China;
4. Animal Husbandry and Veterinary Station of Haiyan County, Haibei Prefecture, Qinghai Province, Haiyan 810200, China
囊型棘球蚴病(Cystic echinococcosis, CE),又称囊型包虫病,是被忽视的热带人畜共患寄生虫病之一。该病呈世界性分布,造成了严重的公共卫生问题和畜牧业的经济损失[1]。该病的病原主要是细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus sensu lato)的中绦期幼虫,其主要以包囊的形式生长在中间宿主(绵羊、山羊和牛等)的肝和肺[2]。终末宿主(犬科动物)误食含有可育包囊的肝和肺后,原头蚴(Protoscolex, PSCs)在其肠道中外翻并附着在肠黏膜上,经过45 d左右发育为成虫。每条成虫每天产生上千个虫卵,虫卵随粪便排出体外。中间宿主误食虫卵后,六钩蚴从虫卵中孵化出并穿透肠黏膜,通过血液移行到肝等器官,最终长成数量、大小不等的包囊[3]。
泛素化是蛋白质翻译后修饰的重要过程,广泛存在于真核生物中,它调节蛋白质的稳定性和活性,从而调节多条信号通路[4]。蛋白质泛素化需要三种关键酶:泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme, E1)、泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme, E2) 和泛素连接酶(ubiquitin ligase, E3)。E1的半胱氨酸残基在ATP的能量供应下与泛素(ubiquitin, Ub) 的C端甘氨酸残基结合,随后E1将激活的Ub转移到E2上,E2单独或通过E3协作将Ub转移到靶蛋白上。Ub以这样的方式不断转移到靶蛋白上形成单泛素化、多单泛素化或聚泛素化[5],聚泛素化常见的泛素连接方式是Lys11、Lys48和Lys63,这是由E2s决定的。Lys11和Lys48通常参与蛋白酶体降解过程,而Lys63参与非蛋白水解过程,如免疫调节、DNA修复和信号转导等[6]。在人类中,部分E2s的下调会增加p53蛋白的稳定性从而引起细胞凋亡,同时,它们也可能通过修饰蛋白分子(TRAF2/5/6、RIP1、IKKγ等)而调节某些重要的信号通路(NF-κB)[7]。目前,高粱[8]、玉米[9]、水稻[10]、葡萄[11]和龙眼[12]等植物E2s基因家族的鉴定分析已完成,而寄生虫E2s基因家族的研究还局限于曼氏血吸虫[13]。
2013年以来陆续出现了细粒棘球绦虫的组学研究报道,其测序多为二代测序如:Roche 454[14]和Illumina Solexa[15-16],但其准确率不高,且难以检测序列的变异情况[17]。因此,本研究通过T-A克隆对细粒棘球绦虫泛素结合酶(EgE2s)家族进行序列鉴定和生物信息学分析,通过qRT-PCR分析EgE2s在PSCs和28日龄童虫中的转录水平,为探索EgE2s可能的生物学功能、发挥功能的调节机制以及构建优势表位疫苗等研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 虫体材料 细粒棘球绦虫包囊取自中国四川省的某屠宰场,从自然感染的绵羊肝和肺中无菌采集包囊。囊液和PSCs的分离和处理如前所述[18-19]。采用0.4%台盼蓝染液检测PSCs的活力,将活性大于95%的PSCs用于后续试验[20]。收集的虫体统一进行基因型鉴定为G1型[21]。28日龄童虫由四川农业大学寄生虫病研究中心提供。
1.1.2 主要试剂 总RNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、GoldViewTM核酸染料、2× Taq PCR MasterMix、D2000 Marker和DH5α感受态细胞均购自天根生化科技(北京)有限公司;pMD19-T Cloning Kit、2×PrimeSTAR Max Premix和TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ均购自大连宝生物工程有限公司;PBS干粉、0.4%台盼蓝染液和氨苄青霉素干粉均购自北京索莱宝科技有限公司;八联管购自爱思进生物技术(杭州)有限公司;RevertAid RT逆转录试剂盒购自赛默飞世尔科技公司;LB肉汤购自青岛海博生物技术有限公司。
1.2 方法1.2.1 总RNA的提取和cDNA合成 将PSCs和28日龄童虫置于灭菌和过夜冷冻的研钵中,加入适量液氮分别进行研磨。参照总RNA提取试剂盒说明书进行RNA的提取,采用NanoDrop 2000分光光度计测定其浓度。以提取的RNA作为模板,反转录合成cDNA置于-20 ℃备用。
1.2.2 EgE2s基因家族的克隆测序 根据Gene DB (https://www.genedb.org/)和NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)已发表的EgE2s的mRNA序列,使用SnapGene version 2.3.2设计引物,引物序列(表 1)交由上海生工生物工程有限公司合成。
目的基因的克隆方法参照文献[22]所述,将连接有pMD19-T载体的质粒转化至DH5α感受态细胞中,置于37 ℃恒温摇床以150 r ·min-1培养90 min后涂于含Amp的固体LB培养基表面,37 ℃倒置培养12 h。每个基因挑取8个单菌落于1 mL的含Amp的液体LB中培养6 h后进行PCR鉴定,将阳性样品送公司测序。
将测序结果与NCBI下载的EgE2s序列进行比对,若有问题则重复进行以上试验过程,以确定最终序列。
1.2.3 EgE2s家族氨基酸序列的分析 从Gene DB和NCBI中下载细粒棘球绦虫基因组数据,并根据克隆测序的情况进行适当修正。开放阅读框、分子量、理论等电点、信号肽、跨膜区、亚细胞定位的预测参照文献[23]所述方法进行。
1.2.4 EgE2s家族蛋白的二级结构和三级结构分析 将EgE2s家族的氨基酸序列提交至在线网站(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)预测其二级结构。于在线网站(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)预测EgE2s的活性位点半胱氨酸位置。SWISS-MODEL在线网站(https://swissmodel.expasy.org/interactive)预测其三级结构。
1.2.5 EgE2s家族的多序列比对和系统发育分析 通过Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)进行EgE2s的多序列比对,手动裁减两端非保守序列。从UniProt (https://www.uniprot.org/)和NCBI中下载多房棘球绦虫E2s (Echinococcus multilocularis, EmE2s)、亚洲带绦虫E2s (Taenia asiatica, TaE2s)、曼氏血吸虫E2s (Schistosoma mansoni, SmE2s)和秀丽隐杆线虫E2s (Caenorhabditis elegans, CeE2s)的氨基酸序列。利用MEGA 7.0软件对其进行多序列比对,TBtools version 1.098 32自动删除歧义比对的序列以产生140个氨基酸的比对,用于随后的邻接法(Neighbor-joining, NJ)分析并构建系统进化树,Bootstrap值设置为1000。
1.2.6 EgE2s家族的基因结构和蛋白保守基序分析 提取EgE2s基因组序列和编码序列(Coding sequence, CDS),将其与EgE2s家族的树文件输入在线网站GSDS (http://gsds.gao-lab.org/)进行基因结构图的绘制。
使用在线网站MEME version 5.3.3 (https://meme-suite.org/meme/tools/meme)分析EgE2s基因家族的保守基序,参数设置:motif最大查找数为7,其他参数为默认值。
1.2.7 EgE2s的组织特异性表达分析 以Zheng等[24]测得的细粒棘球绦虫4个发育阶段(成虫、六钩蚴、原头蚴、包囊)的转录组数据为准,获取EgE2s基因的RPKM (Reads Per Kilobase Million)值,用以表示基因的表达丰度。为方便统计,对每个表达数值取以2为底数的对数(log2),使用TBtools version 1.098 32绘制基因表达热图。
1.2.8 qRT-PCR检测EgE2s在PSCs、28日龄童虫中的转录水平 为测定和分析EgE2s在不同发育阶段的转录水平,筛选PSCs阶段特异性表达的EgE2s。将EgE2s序列上传至生工生物工程(上海)股份有限公司网站(https://www.sangon.com/userLogin)设计特异的qRT-PCR引物(表 2)。BLSAT(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)检查引物是否特异。
以各阶段虫体cDNA为模板进行qRT-PCR扩增,EgGAPDH和EgEFα作为内参基因进行分析,反应体系及反应条件参考前人所述[21]。结果采用ΔΔCt(Qr=2-ΔΔCt)法进行分析。
1.2.9 EgE2D2和EgE2N的B/T细胞抗原表位预测 抗原表位的研究对疾病的诊断、免疫治疗及疫苗分子结构的设计等具有重要意义。细粒棘球绦虫组学文献表明, EgE2D2和EgE2N通过外泌体[25]/胞外囊泡[26]分泌出去。故本研究通过在线网站IDBE(http://tools.immuneepitope.org/main/)和ABCpred(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html)对其B/T细胞抗原表位进行了预测。T细胞抗原表位预测分别选择HLA-A*0201(人类)与DLA-88*50101(犬),%Rank<0.5%与%Rank>2%的分别为强结合MHC Ⅰ类分子和弱结合MHC Ⅰ类分子[27]。
2 结果 2.1 EgE2s基因家族的克隆测序结果成功克隆测序了19个EgE2s基因,其中EgE2I为相扑结合酶(SUMO-conjugating enzyme),EgE2V2为泛素结合酶突变体。所有EgE2s有完整的ORF框,PCR结果条带清晰,较为单一(图 1),其CDS序列在350~1 600 bp之间。EgE2L3的CDS序列与数据库序列相差了12个碱基,EgE2J1的CDS序列与数据库序列两端有差异,本团队向NCBI重新上传了其CDS序列,登录号分别为EgE2L3: MZ277618;EgE2J1: MZ277619,且EgE2J2的CDS序列(XM_024496294.1)与NCBI数据库序列一致。
将19个EgE2s的氨基酸序列提交至ExPASY等软件进行蛋白质的长度、分子量、等电点、跨膜区、信号肽和活性位点等进行分析(表 3)。结果显示,EgE2s的CDS序列在354~1 605 bp之间,氨基酸长度在117~534 aa之间,对应的分子量为13.39~57.17 ku。EgE2s的等电点为4.41~9.06,除了EgE2-25、EgE2S、EgE2I外,其余蛋白质的等电点均小于7.00。信号肽预测显示EgE2s均没有信号肽。跨膜位点预测显示,只有EgE2J1和EgE2J2具有跨膜区,分别位于第505~527和214~236位氨基酸。EgE2s蛋白大部分位于细胞质和细胞核中;分布于细胞膜的有EgE2L3、EgE2J1和EgE2C;分布于内质网的只有EgE2G2。使用InterPro在线网站预测了EgE2s的半胱氨酸活性位点的位置(表 3)且标注在了三级结构中(图 2)。EgE2V2与泛素结合酶在氨基酸序列和结构上高度相似,但其不具有活性位点半胱氨酸,因而缺乏催化活性。
EgE2s家族蛋白二级结构预测(表 3)表明:19个EgE2s蛋白均含有α-螺旋(17.14%~51.47%),除EgE2V2和EgE2J1的α-螺旋占比分别为17.14%和28.65%外,其余EgE2s的α-螺旋占比均大于30%。EgE2s的β-转角占比在2.61%~6.88%之间,延伸链占比在10.58%~21.05%之间,无规则卷曲占比在29.90%~58.57%之间。
三级结构预测显示:19个EgE2s蛋白基本上都含有4个α-螺旋,4个β-折叠,构成了EgE2s家族的保守催化“核心”结构域(UBC结构域)(图 2)[28]。结合三级结构的预测及相关文献对E2s的分类[29],认为EgE2A、EgE2B、EgE2D2、EgE2G1、EgE2G2、EgE2I、EgE2L3、EgE2N、EgE22、EgE2-24属于Class Ⅰ,EgE2C、EgE2V2属于Class Ⅱ,EgE2H、EgE2J1、EgE2J2、EgE2R1、EgE2S、EgE2-25属于Class Ⅲ。
2.4 EgE2s基因家族的多序列比对和系统进化分析将EgE2s氨基酸序列进行了多序列比对,发现该家族内部的氨基酸序列相似性较低(图 3)。然而,这并不影响其具有150~200个氨基酸组成的UBC结构域。
为探究细粒棘球绦虫与其他物种E2s家族的进化关系,本研究下载了多房棘球绦虫E2s (Echinococcus multilocularis, EmE2s)、亚洲带绦虫E2s (Taenia asiatica, TaE2s)、曼氏血吸虫E2s (Schistosoma mansoni, SmE2s)和秀丽隐杆线虫E2s (Caenorhabditis elegans, CeE2s)各19、11、20和16条氨基酸序列。根据与曼氏血吸虫E2s蛋白的同源性[30],对细粒棘球绦虫的E2s的名字进行了标注并构建了系统发育树(图 4)。结果表明,细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫和曼氏血吸虫的E2s之间亲缘关系较近。
为更好地了解EgE2s基因的结构多样性,本研究将EgE2s基因的内含子/外显子排列和保守基序做了比较。结果显示,EgE2A和EgE2B只含有1个外显子,且无内含子,EgE22含有2个外显子,其余EgE2s基因都含有3~7个外显子。不同EgE2s成员的基因结构差异较大。EgE2R1含有下游结构,EgE2I和EgE2C含有上游结构,其他EgE2s无上、下游结构(图 5)。
EgE2s家族蛋白的保守基序预测表明(不同颜色的方块表示不同的motif)(图 5):该家族蛋白序列含有的保守基序较为一致,大部分EgE2s都含有6个保守基序。EgE2s最少,只含有3个。
2.6 EgE2s在4个发育阶段中的表达谱分析从转录组数据提取了19个EgE2s在细粒棘球绦虫4个发育阶段中的基因表达谱。结果表明,EgE2s的表达量在不同发育阶段有较大的差异(图 6)。值得注意的是,EgE2D2在4个发育阶段均呈现出了极高的表达水平。EgE2J1和EgE2J2在4个阶段的表达量都较低甚至在六钩蚴(Oncospheres)时期不表达,EgE2A、EgE2V2和EgE2L3在六钩蚴时期也不表达。同时,EgE2G2在PSCs中不表达。
以PSCs、28日龄童虫的cDNA为模板,对19个EgE2s基因进行qRT-PCR扩增,采用内参基因EgGAPDH、EgEFα的几何平均值进行分析[31],表明EgE2s的转录水平在各个阶段存在差异,其中EgE2A、EgE2J1在PSCs阶段相对于28日龄童虫阶段高表达,具有显著的统计学差异(P<0.001,P<0.01,图 7)。
将ABCpred预测阈值>0.8[32]与IEDB预测的氨基酸序列区域整合后确定为最终EgE2D2、EgE2N的优势B细胞抗原表位区域分别为:38-54、59-63、70-86、114-119、129-137;14-21、36-48、57-65、117-122、139-157。
IEDB预测EgE2D2、EgE2N与人MHC Ⅰ类分子强结合的位点分别为:91-99(0.52%);58-66(0.07%)、104-113(0.34%)。EgE2D2、EgE2N与犬MHC Ⅰ类分子强结合的位点分别为:5-13(0.38%);8-16(0.09%)、104-113(0.35%)。
3 讨论在NCBI和DB数据库中各提取到22条[24]和19条[30]EgE2s序列,通过DNAMAN进行序列比对后整合为22条EgE2s序列。在本研究中,对EgE2-17、EgE2F、EgUBC12更换引物多次均未能克隆出正确序列,这可能是因为二代测序技术本身的缺点,即PCR扩增前后的DNA会发生相对频率和丰度的改变,且该技术难以检测变异的碱基,从而影响了测序结果的准确性[33];且不能完全避免序列的拼接错误。因此,根据研究需求组合多种测序技术[34]以及运用多种识别错误拼接的方法[35]对提高序列的准确性是有必要的。
泛素结合酶是泛素蛋白酶体系统的核心,它决定了靶蛋白的泛素连接类型而影响靶蛋白的生物学活性[36]。有研究表明癌细胞中高表达的E2s活跃调节各个信号通路,从而认为这些E2s可能为潜在的癌症诊断标志物[37]和治疗靶点[38],例如:抑制人肺癌细胞的E2D可稳定p53,从而促进肺癌细胞凋亡[39];E2D2通过修饰TRAF2/5以及IκBα参与NF-κB信号的传递,从而调节炎症反应和免疫应答[4]。本研究表明,EgE2s拥有与哺乳动物相似的UBC结构域和活性位点,在细粒棘球绦虫的4个发育阶段中EgE2D2均呈现出了极高的表达水平,说明EgE2D2可能在细粒棘球绦虫各个生长发育阶段起着抗凋亡的功能,还可能参与了抵抗宿主免疫反应的调节。仅有的几项寄生虫E2s功能研究表明,旋毛虫E2L3被分泌到宿主成肌细胞,影响宿主的泛素蛋白酶体系统,从而有利于寄生虫的生存[40];阿米巴原虫E2G2的失活显著抑制其噬红细胞功能[41];布氏锥虫E2R1的失活导致胞质分裂受阻而影响其在小鼠体内的生存[42]。这说明,目前寄生虫E2s的功能研究主要集中在其如何促进寄生虫在宿主体内生存,推测EgE2D2的功能也是如此。
Platts等[43]表明,泛素蛋白酶体系统的组成部分是畸精症患者精子中差异表达较强的部分。E2A的突变或缺乏主要与X连锁智力障碍有关[44],而敲除E2J1使雄性小鼠精细胞胞质去除不完全,影响成熟精子细胞向生精小管腔的释放而导致不育,且E2J2不能弥补这种效应[45]。本研究发现, EgE2A和EgE2J1在PSCs时期的转录水平相对于28日龄童虫高表达,且有显著性差异。因此推测,EgE2A和EgE2J1在原头蚴生长发育中可能有重要作用。
寄生虫病仍是发展中国家亟待解决的公共卫生问题,尤其是我国西部地区,犬的放养及其感染后无明显临床表现使其成为细粒棘球绦虫传播的重要原因[46]。目前,预防包虫病较好的疫苗源于细粒棘球绦虫(G1型)的EG95基因工程亚单位疫苗,由于其对G6/G7型的交叉保护作用减少或消失[47],且免疫中间宿主的人力和时间消耗较大,研制预防终末宿主感染的疫苗迫在眉睫。反向疫苗学缩短了疫苗开发的时间和成本,其第一步是通过基因组信息寻找优势抗原表位[48]。因此,本研究通过B细胞抗原表位预测发现,EgE2N的139-157区域位于EgE2s保守区域外。同时,EgE2N的T细胞抗原表位预测对人和犬MHC Ⅰ类分子各有2个强结合位点,且有一个共同的抗原表位位点104-113,二级结构显示β转角和无规则卷曲的比例达到45%,表明这两段区域可能是药物研究和疫苗开发的靶序列[49]。
4 结论基于细粒棘球绦虫基因组数据,本研究在细粒棘球绦虫中成功克隆并测序19个EgE2s基因,更正了两个原序列有误的EgE2s,登录号分别为EgE2L3: MZ277618; EgE2J1: MZ277619。三级结构和保守基序预测结果表明EgE2s高度保守。qRT-PCR结果显示EgE2s的转录水平在PSCs和28日龄童虫中存在差异,其中EgE2A、EgE2J1在PSCs阶段高表达。B细胞抗原表位预测表明EgE2N的139-157区域位于EgE2s保守基序外。同时,T细胞抗原表位预测表明EgE2N与人和犬MHC Ⅰ类分子各有两个强结合位点,且有一个共同的抗原表位位点104-113。综上,EgE2A和EgE2J1可能在PSCs的生长发育中起重要作用。EgE2N的139-157和104-113区域可能是药物研究和疫苗开发的靶序列。本研究将为细粒棘球绦虫的生长发育和疫苗研发提供新的思路、新的方向。
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(编辑 范子娟)