褐黄血蜱(Haemaphysalis flava)，隶属于硬蜱科血蜱属，广泛分布于我国南方各省与东亚各国，是一种常见寄生于哺乳动物体表的吸血寄生虫[1-2]。褐黄血蜱可传播立克次体(Rickettsia)[3]、贝纳柯克斯体(Coxiella burnetti)[3]、巴尔通体(Bartonella)[4]、森林脑炎病毒(Forest encephalitis virus)[5]等病原体，严重威胁着人类健康和畜牧养殖业[6]。筛选蜱源优质抗原是开发抗蜱疫苗的先决条件。热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)是一类高度保守的伴侣蛋白，参与细胞内蛋白质的折叠、装配、降解和修复过程，具有促进抗原提呈与识别、调控免疫应答等生物学功能[7]。对比蜱不同发育阶段，发现热休克同源蛋白70(heat shock cognate 70, HSC70)的表达量在半饱血状态的成虫中显著高于其他发育阶段[8]。通过体外抗凝血测定，发现褐黄血蜱HSC70重组蛋白具有显著的抗凝血活性[9]。上述研究表明，蜱在吸血时，体内有HSP家族蛋白会变得活跃，且可能参与蜱抗凝血过程。本课题组已通过转录组学建立了半饱血和饱血雌性褐黄血蜱中肠转录组文库[10]，并发现Contig41014是褐黄血蜱中肠转录组文库中负责编码HSP70-b2的Unigene，但缺失3′端序列。
HSP家族蛋白不仅参与蜱的抗凝血过程，还具有一定免疫原性。研究证实，外源性HSP70通过主要组织相容性复合体Ⅰ和Ⅱ类(MHCⅠ和Ⅱ)分子递呈抗原，以刺激T和B细胞产生免疫[11-13]。14-Mer肽是HSP70家族蛋白中具有免疫功能的肽段，位于450—463位氨基酸[14]。而对蜱HSP70家族蛋白的一级氨基酸序列进行比对时，发现蜱HSP家族蛋白的14-Mer肽段个别氨基酸发生了变化，为类14-Mer肽[15]。类14-Mer肽是否影响蜱HSP70-b2的免疫原性尚不明确。基于此，本研究通过cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends，RACE)技术扩增Contig41014基因，以得到褐黄血蜱HSP70-b2基因全长，并定点突变HSP70-b2编码类14-Mer肽段的核酸序列为编码14-Mer肽段的核酸序列，以获得HSP70-b2M基因全长。为进一步探究HSP70-b2、HSP70-b2M是否具有抗凝血作用，及类14-Mer肽是否影响蜱HSP70-b2的免疫活性，本研究将构建HSP70-b2、HSP70-b2M原核表达载体，表达、纯化获得重组HSP70-b2和HSP70-b2M蛋白(rHSP70-b2、rHSP70-b2M)；采用四项凝血试验，测定rHSP70-b2、rHSP70-b2M抗凝血活性；以弗氏完全/不完全佐剂乳化rHSP70-b2、rHSP70-b2M并皮下免疫Sprague Dawley(SD)大鼠，测量各组血清抗体水平以评估HSP70-b2、HSP70-b2M免疫原性。
1 材料与方法 1.1 主要设备和仪器EasyPure RNA Kit，2×TransTaq HiFi PCR SuperMixⅡ，TransStart®KD Plus DNA Polymerase，BL21(DE3)Chemically Competent Cell，限制性内切酶(Eag I、Xho I、Nco I)购自北京全式金生物技术有限公司, Premix Taq(TaKaRa Taq Version 2.0)、pMD19-T Vector Cloning Kit、Escherichia coli DH5α Competent Cells、DNA Ligation Kit Ver.2.1、SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit购自TaKaRa公司, 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒(DP103)购自天根生化科技(北京)有限公司，Ni-NTA His Bind Resin镍柱购自上海七海复泰生物科技有限公司，小鼠抗His单克隆抗体、过氧化氢标记的山羊抗小鼠抗体购自天津博士德生物科技有限公司，BCA蛋白定量试剂盒、ELISA包被液、ELISA封闭液、ELISA终止液、10×ELISA洗涤液、双组分TMB显色液、酶标抗体稀释液购自北京博奥森生物技术有限公司，VER 155008(10 mmol·L-1 in DMSO，adenosine-derived inhibitor)购自美国Apex Bio Technology公司，凝血酶原时间(PT)测定试剂盒、凝血酶时间(TT)测定试剂盒、活化部分凝血酶时间(APTT)测定试剂盒、纤维蛋白原(FIB)测定试剂盒购自上海太阳生物技术公司，弗氏完全/不完全佐剂购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，血凝分析仪MC-1000购自德国TECO公司，酶标仪Epoch2购自美国BioTek公司、7周龄SD大鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。
1.2 引物设计基于褐黄血蜱中肠转录组文库中的Contig 41014序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物，交由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列见表 1。引物HSP70-b2-F、HSP70-b2-M下划线部分分别为NcoⅠ、XhoⅠ酶切位点，引物HSP70-b2-Mr、HSP70-b2-Mf下划线部分为EagⅠ酶切位点，其所包含的突变碱基已斜体显示。
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表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences |
用EasyPure RNA试剂盒提取褐黄血蜱总RNA，SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit反转录合成褐黄血蜱3′RACE-Ready cDNA。以合成的cDNA为模板，以3′RACE-OP和UPM为引物，进行第一轮PCR，反应体系：上、下游引物(10 mmol·L-1)各1.5 μL、cDNA 1 μL、2×TransTaq HiFi PCR SuperMixⅡ 15 μL、ddH2O 11 μL。扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，20个循环；72 ℃ 7 min；4 ℃保存。切胶回收第一轮PCR扩增产物。以回收产物为模板，以3′RACE-IP和UPS为引物，进行第二轮PCR扩增，反应体系及扩增条件同第一轮。切胶回收第二轮PCR扩增产物，连接于pMD19-T载体，转化至DH5α感受态细胞，在含氨苄西林、异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)、X-gal的LB固态培养基过夜培养，挑取阳性菌落，PCR验证，提取扩增出正确条带菌液的质粒送至北京擎科生物科技有限公司测序。DNAman 6.0软件对3′端测序结果和Contig 41014序列进行比对、分析和拼接，得到褐黄血蜱HSP70-b2基因全长，并用SignalP 6.0软件、ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)对其进行生物信息学分析。
1.4 HSP70-b2基因的克隆、定点突变及重组表达质粒的构建以cDNA为模板，HSP70-b2-F和HSP70-b2-R为引物，扩增HSP70-b2基因的开放阅读框(open reading frame, ORF)，反应体系：上、下游引物(10 mmol·L-1)各2 μL、cDNA 2 μL、2×TransTaq HiFi PCR SuperMixⅡ 25 μL、ddH2O 19 μL。扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。切胶回收扩增产物并连接于pMD19-T载体，构建克隆质粒pMD19-HSP70-b2。以pMD19-HSP70-b2为模板，HSP70-b2-F和HSP70-b2-Mr为引物，扩增P1片段。反应体系：上、下游引物(10 mmol·L-1)各2 μL，模板1 μL，2.5 mmol·L-1 dNTPS 4 μL，TransStart® KD Plus DNA Polymerase 1 μL，5×TransStart® KD Plus Buffer 10 μL，ddH2O 30 μL。扩增条件同上。以HSP70-b2-Mf和HSP70-b2-R为引物，按同上条件，扩增P2片段。切胶回收P1、P2片段，EagⅠ酶切后凝胶电泳纯化并切胶回收。DNA Ligation Kit连接酶切产物P1、P2的黏性末端，得到突变后的序列P3，即HSP70-b2-ORFM。以P3为模板，HSP70-b2-F和HSP70-b2-R为引物，按上述条件扩增HSP70-b2-ORFM。扩增产物经凝胶电泳、切胶回收后，连接pMD19-T载体，构建克隆质粒pMD19-HSP70-b2M。NcoⅠ、XhoⅠ酶切质粒pET-28a、pMD19-HSP70-b2和pMD19-HSP70-b2M，用DNA Ligation Kit分别将HSP70-b2-ORF、HSP70-b2-ORFM片段分别与线性质粒pET-28a进行连接，转化至大肠杆菌BL21。挑选阳性菌落，PCR验证并测序，构建表达质粒pET-28a-HSP70-b2和pET-28a-HSP70-b2M。
1.5 诱导表达、纯化蛋白及Western blot挑取阳性菌落至含卡那霉素(50 mg·mL-1)的LB培养液扩大培养，37 ℃，180 r·min-1至OD600 nm值0.6。加入IPTG(0.5 mmol·L-1)诱导表达，6 h后收集菌液，4 ℃，5 000 r·min-1离心20 min，去上清，加入20 mL破菌缓冲液(20 mmol·L-1 Tris，250 mmol·L-1 NaCl，0.5% Triton X-100，1 mmol·L-1PMSF，pH 7.5)重悬，冰浴中超声波裂解(15 min，功率180 W，开5 s关5 s)，12 000 r·min-1，4 ℃离心15 min，收集上清液。用Ni-NTA His Bind Resin镍柱进行纯化。待目的蛋白与镍柱结合后，使用洗杂缓冲液(20 mmol·L-1 Tris，250 mmol·L-1 NaCl，20 mmol·L-1 imidazole)和洗脱缓冲液(20 mmol·L-1 Tris，50 mmol·L-1 NaCl，200/500 mmol·L-1 imidazole)洗脱目的重组蛋白。纯化的目的蛋白通过SDS-PAGE和Western blot进行检测和验证。在Western blot中，小鼠抗His单克隆抗体为一抗(1∶2 000稀释)，过氧化氢标记的山羊抗小鼠抗体为二抗(1∶5 000稀释)。
1.6 重组蛋白HSP70-b2和HSP70-b2M抗凝血活性测定用生理盐水将rHSP70-b2或rHSP70-b2M稀释至4 μmol·L-1。以同浓度的牛血清蛋白溶液(BSA)作为空白组，rHSP70-b2或rHSP70-b2M加入VER155008(100 μmol·L-1)作为抑制组。对SD大鼠进行眼眶静脉采血，用3.8%柠檬酸钠抗凝(柠檬酸钠∶血液=1∶9)，3 000 r·min-1离心10 min，取上层淡黄色血浆。根据凝血四项试剂盒说明书，分别测试rHSP70-b2、rHSP70-b2M对TT、PT、APTT、FIB四项数据的影响，每项测量平行重复8次，重组蛋白液、血浆、测量试剂均在测量前于37 ℃进行预温。
1.7 重组蛋白HSP70-b2和HSP70-b2M免疫原性测定用PBS将rHSP70-b2或rHSP70-b2M的浓度稀释至600 μg·mL-1，制备前预热弗氏完全/不完全佐剂至37 ℃，分别吸取等体积佐剂和rHSP70-b2或rHSP70-b2M至装有双孔乳化接头的针筒内，进行乳化。取7周龄SD大鼠24只，随机分成HSP70-b2组、HSP70-b2M组、阴性对照组和空白组。采用背部皮下多点注射法进行3次免疫，第1次免疫用弗氏完全佐剂乳化的重组蛋白，第2、3次免疫用弗氏不完全佐剂乳化的重组蛋白。重组蛋白浓度为300 μg·mL-1；每只大鼠注射100 μL乳化蛋白，即每只大鼠注射30 μg蛋白，阴性对照组注射100 μL生理盐水。空白组不做任何处理，直接采血。每次免疫两周后，眼眶静脉采血，4 ℃过夜析出血清，3 000 r·min-1离心10 min，吸取上清至干净离心管中，间接ELISA法测定HSP70-b2组、HSP70-b2M组、阴性对照组血清抗体效价。rHSP70-b2及rHSP70-b2M浓度为40 μg·mL-1(用ELISA包被液稀释)；被检血清用酶标抗体稀释液稀释至1∶2 000倍；过氧化氢标记的山羊抗小鼠抗体为二抗(1∶20 000倍稀释)。
2 结果 2.1 Contig 41014序列3′端扩增结果以褐黄血蜱3′RACE-Ready cDNA为模板，3′RACE-OP和UPM为引物进行第一轮PCR扩增后，再以3′RACE-IP和UPS为引物，进行第二轮PCR扩增，扩增后得到大小为1 065 bp的片段(图 1)。通过序列测定和DNAman 6.0软件拼接，获得褐黄血蜱中肠转录组文库中的Contig 41014序列3′端，其大小为859 bp，拼接后的Contig 41014序列全长为2 413 bp。
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M. DNA相对分子质量标准；A. 3′端扩增产物；N. 阴性对照 M. DL2000 DNA marker; A. 3′end amplification products; N. Negative control 图 1 褐黄血蜱中肠转录组文库中Contig 41014序列3′端扩增 Fig. 1 Amplification of the 3′end of the Contig 41014 sequence in the midgut transcriptome library of Haemaphysalis flava |
对比同源蛋白基因序列发现，褐黄血蜱Contig 41014与血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineus; No. XP037504077)、微小扇头蜱(Rhipicephalus microplus; XP037282991)、亚洲璃眼蜱(Hyalomma asiaticum; No.KAH6948317)、全沟硬蜱(Ixodes persulcatu; No.KAG0426161)、肩突硬蜱(Ixodes scapularis; No.XP029837103)的HSP70-b2高度相似(相似度97.8%)且结构特点一致。序列分析显示，褐黄血蜱Contig 41014的ORF框长度为1 905 bp，5′非编码区为97 bp，3′非编码区为411 bp，无信号肽序列。ORF框编码的蛋白为634 aa，相对质量为70 ku，其序列有如下特点：具有核酸结合区、底物结合区、C端结构域3段；有IDLGTTYSCV、IFDLGGGTFDVSI、IVLVGGSTRIPRIQ 3个HSP70家族标签；含有亚细胞定位模体DEVD(图 2)，上述结果表明褐黄血蜱中肠转录组文库中Contig 41014的全长序列为褐黄血蜱的HSP70-b2基因序列，其序列已上传至NCBI数据库(No. MN518895)。
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HSP70 family signature-1/-2/-3为3个HSP70家族蛋白标签；ATP/GTP binding site为HSP70-b2蛋白与三磷酸腺苷/三磷酸鸟苷结合位点；14mer TKD equivalent peptides为HSP70-b2蛋白类14-Mer等效肽段；C-End motif为HSP70-b2蛋白C端定位基序；红色分隔符区分HSP70-b2蛋白3个功能域，分别是核酸结合区(NBD)、底物结合区(SBD)、C端结构域(CTD) HSP70 family signature-1/-2/-3 was three HSP70 family protein tags; ATP/GTP binding site was adenosine triphosphate/guanosine triphosphate binding site of HSP70-b2 protein; 14mer TKD equivalent peptide was a 14-Mer-like peptide of HSP70-b2 protein; C-End motif was HSP70-b2 protein C-terminal localization motif; The red separator distinguishes three functional domains of HSP70-b2 protein, namely the nucleic acid binding region (NBD), the substrate binding region (SBD), and the C-terminal domain (CTD) 图 2 褐黄血蜱HSP70-b2基因全长及氨基酸序列 Fig. 2 The full length of Haemaphysalis flava HSP70-b2 cDNA and amino acid sequence |
由HSP70-b2-F和HSP70-b2-Mr为引物，扩增获得P1片段，其长度为1 396 bp；HSP70-b2-Mf和HSP70-b2-R引物，扩增获得P2片段，其长度为546 bp(图 3A)。P1、P2的黏性末端连接后获得P3(HSP70-b2-ORFM)，其长度为1 923 bp(图 3B)。将HSP70-b2-ORFM克隆至pMD19-T后测序，测序结果与HSP70-b2进行比对，发现第455、459、461、463位氨基酸成功由H(CAC)变为N(AAC)、T(ACC)变为R(CGC)、D(GAC)变为E(GAG)、M(ATG)变为S(TCG)。
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A. 突变碱基片段电泳图；B. HSP70-b2-ORFM电泳图。M. DNA相对分子质量标准；P1. 突变碱基片段P1；P2. 突变碱基片段P2；P3. HSP70-b2-ORFM A. Agarose gel electrophoresis of the mutant base fragment; B. Agarose gel electrophoresis of the HSP70-b2-ORFM. M. DL2000 DNA marker; P1. Mutant base fragment P1; P2. Mutant base fragment P2; P3. HSP70-b2-ORFM 图 3 褐黄血蜱HSP70-b2碱基定点突变扩增结果 Fig. 3 Amplification of Haemaphysalis flava HSP70-b2 base by site-directed mutagenesis |
将pMD19-T-HSP70-b2和pMD19-T-HSP70-b2M双酶切后，获得表达片段，再将纯化后的表达片段与双酶切处理的线性原核表达载体pET-28a相连接；重组质粒转化至Trans BL21(DE3)感受态细胞，挑取阳性菌落，酶切验证表明，重组质粒均含有表达片段(图 4A、B)。经测序分析，表达片段插入位置正确，无变异，表达质粒pET-28a-HSP70-b2和pET-28a-HSP70-b2M重组成功。
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A. pET-28a-HSP70-b2酶切验证；B. pET-28a-HSP70-b2M酶切验证。M. DNA marker；E. 空pET-28a质粒；F. 双酶切空pET-28a质粒；1. HSP70-b2-ORF；2. pET-28a-HSP70-b2质粒；3. 双酶切pET-28a-HSP70-b2质粒；4. HSP70-b2-ORFM；5. pET-28a-HSP70-b2M质粒; 6. 双酶切pET-28a-HSP70-b2M质粒。所有质粒均使用Nco I、Xho I双酶切进行验证 A. pET-28a-HSP70-b2 digestion verification; B. pET-28a-HSP70-b2M digestion verification. M. DNA marker; E. Empty pET-28a plasmid; F. Double digested empty pET-28a plasmid; 1. HSP70-b2-ORF; 2. pET-28a-HSP70-b2 plasmid; 3. Double digested pET-28a-HSP70-b2 plasmid; 4. HSP70-b2-ORFM; 5. pET-28a-HSP70-b2M plasmid; 6. Double digested pET-28a-HSP70-b2M plasmid. All plasmids were validated using Nco I, Xho I double digestion 图 4 重组表达质粒pET-28a-HSP70-b2和pET-28a-HSP70-b2M的酶切验证 Fig. 4 Restriction analysis of recombinant expression plasmid pET-28a-HSP70-b2 and pET-28a-HSP70-b2M |
活化菌液经IPTG诱导培养6 h后，超声破碎并进行His亲和层析柱纯化。经SDS-PAGE凝胶结果显示，在所有泳道中70 ku处均存在一条高丰度蛋白条带(图 5A、B)。rHSP70-b2、rHSP70-b2M均以可溶性蛋白和包涵体两种形式同时存在。洗脱液电泳条带粗且清晰，杂蛋白少，纯度较高。对纯化后的蛋白进行Western blot检测，出现特异性蛋白条带(图 5C)。结果显示, 纯化后蛋白为rHSP70-b2、rHSP70-b2M，表明通过纯化成功获得了以可溶性形式存在于上清液中的重组蛋白。
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A. rHSP70-b2表达纯化SDS-PAGE电泳图；B. rHSP70-b2M表达纯化SDS-PAGE电泳图；C. rHSP70-b2和rHSP70-b2M的Western blot验证。M. 蛋白相对分子质量标准；1和a分别为未破碎菌液总蛋白；2和b分别为纯化前rHSP70-b2和rHSP70-b2M破菌上清液；3和c分别为纯化前rHSP70-b2和rHSP70-b2M破菌沉淀溶解液；4和d分别为rHSP70-b2和rHSP70-b2M过柱穿出液；5、6、7和e、f、g分别为rHSP70-b2和rHSP70-b2M洗杂液；8、9和h、i分别为rHSP70-b2和rHSP70-b2M洗脱液；m.rHSP70-b2M; 70.rHSP70-b2 A. SDS-PAGE analysis of purified rHSP70-b2 expression; B. SDS-PAGE analysis of purified rHSP70-b2M expression; C. Identification of rHSP70-b2 and rHSP70-b2M by Western blot. M. Protein marker; 1 and a are the total protein of unbroken bacteria solution, respectively; 2 and b are the broken bacteria supernatants of rHSP70-b2 and rHSP70-b2M before purification, respectively. 3 and c are the broken bacteria precipitation of rHSP70-b2 and rHSP70-b2M before purification. 4 and d are the effluent liquids of rHSP70-b2 and rHSP70-b2M, respectively. 5, 6, 7 and e, f, g are the wash liquids of rHSP70-b2 and rHSP70-b2M, respectively. 8, 9 and h, i are the eluents of rHSP70-b2 and rHSP70-b2M, respectively. m is rHSP70-b2M; 70 is rHSP70-b2 图 5 rHSP70-b2、rHSP70-b2M表达、纯化和Western blot Fig. 5 Expression and purification and Western blot of rHSP70-b2 and rHSP70-b2M |
rHSP70-b2和rHSP70-b2M对大鼠血浆PT和APTT体外抗凝血结果与对照组相近，凝血时间均处于正常区间(P＞0.05)(图 6A、B)，说明rHSP70-b2及rHSP70-b2M基于PT和APTT途径无抗凝血效果。rHSP70-b2和rHSP70-b2M对大鼠血浆TT和FIB体外抗凝血结果与对照组相比，rHSP70-b2和rHSP70-b2M凝血时间显著延长(P＜0.05)(图 6C、D)；rHSP70-b2与rHSP70-b2M之间无差异(P＞0.05)，说明rHSP70-b2和rHSP70-b2M基于TT和FIB途径具有抗凝血效果，二者抗血凝效果相近。在TT和FIB体外抗凝血结果中，抑制组与对照组凝血时间均处于正常区间(P＞0.05)(图 6C、D)，说明抑制剂(VER155008)可有效抑制rHSP70-b2及rHSP70-b2M体外活性。
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A. rHSP70-b2和rHSP70-b2M对凝血酶原时间(PT)的影响；B. rHSP70-b2和rHSP70-b2M对活化部分凝血酶时间(APTT)的影响；C. rHSP70-b2和rHSP70-b2M对凝血酶时间(TT)的影响；D. rHSP70-b2和rHSP70-b2M对纤维蛋白原(FIB)的影响。浓度与重组蛋白相等的BSA作为阴性对照；抑制剂(VER155008)以终浓度为100 μmol·L-1作为抑制组；每项数据平行测定8次。*表示组间差异显著(P＜0.05) A. The effect of rHSP70-b2 and rHSP70-b2M on prothrombin time (PT); B. The effect of rHSP70-b2 and rHSP70-b2M on activated partial thrombin time (APTT); C. The effect of rHSP70-b2 and rHSP70-b2M on thrombin time (TT); D. The effect of rHSP70-b2 and rHSP70-b2M on fibrinogen (FIB). BSA solutions with concentrations comparable to recombinant protein were used as the negative controls. Inhibitor (VER155008) with a final concentration of 100 μmol·L-1 was used as the inhibition group. Each data was measured eight times in parallel. * indicate significant differences between groups (P<0.05) 图 6 rHSP70-b2和rHSP70-b2M四项凝血参数结果 Fig. 6 Results of rHSP70-b and rHSP70-b2M on the four coagulation parameters |
rHSP70-b2组和rHSP70-b2M组大鼠首次免疫后2周，均产生了特异性抗体，表明rHSP70-b2和rHSP70-b2M均具有一定免疫原性。rHSP70-b2组和rHSP70-b2M组第二次免疫产生的抗体水平明显高于首次免疫，第三次免疫抗体水平增长不明显；rHSP70-b2组产生的抗体水平在每次免疫后均显著强于rHSP70-b2M组(P＜0.01)(图 7)，表明含有类14-Mer肽的rHSP70-b2诱导产生抗体的能力优于含14-Mer肽的rHSP70-b2M(P＜0.01)。
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First为第一次免疫；Second为第二次免疫；Third为第三次免疫。**表示组间差异极显著(P＜0.01) First represents the first immunization; Second represents the second immunization; Third represents the third immunization.** indicate significant differences between groups (P<0.01) 图 7 大鼠免疫后血清抗体水平 Fig. 7 Serum antibody concentration in rats after immunization |
本研究基于褐黄血蜱中肠转录组库中的Contig 41014序列，通过比对分析，发现其3′端有缺失。设计特异性引物对3′残缺序列进行补全后，克隆得到其全长序列，比对分析结果显示，褐黄血蜱Contig 41014序列编码蛋白含有HSP70家族的典型标签(IDLGTTYSCV、IFDLGGGTFDVSI、IVLVGGSTRIPRIQ)[16-18]，确定其为HSP70家族成员。在人类与褐黄血蜱HSP70家族蛋白(ASA45615、AIS39468、APO36715)中发现存在EEVD的末端定位基序[19-20]，但本研究中褐黄血蜱Contig 41014序列的3′残缺序列中，其末端定位基序却为DEVD。目前，尚无DEVD基序的人源HSP70成员[21]，但是这种定位基序在蜱中并不罕见。NCBI蛋白数据库中已公布了血红扇头蜱、微小扇头蜱、亚洲璃眼蜱、全沟硬蜱、肩突硬蜱等的HSP70-b2，与本研究获得的序列均高度相似(相似度97.8%)，且C末端基序一致。为此作者将补全3′残缺序列的Contig 41014与上述不同蜱种的HSP70-b2视为同一类热休克蛋白，并命名为褐黄血蜱HSP70-b2。
HSP70广泛存在于各种动物体内，其最初被发现在果蝇的热休克反应中大量表达，并被证明在热适应和应激状态中发挥保护作用[22]。HSP70家族蛋白中包括13个家族成员，它们在表达水平、表达形式、氨基酸的组成方面均存在差异[23]。而有研究表明，蜱在吸血过程中，其体内的HSP70表达量会明显增加，说明HSP70可能在蜱吸血过程中发挥一定作用[24]。同时，有研究证实HSP70在诱导大鼠高温应激试验中大量表达，可起到保护血管、阻止血栓形成的作用[25]；Allende等[26]同样发现HSP70具有有效预防血栓形成且无出血风险的作用。上述研究表明，HSP70家族中的部分成员具有一定抗凝血活性。为明确褐黄血蜱HSP70-b2是否具有抗凝血作用，以及突变类14-Mer肽的HSP70-b2M是否会增强或减弱抗凝血作用，本研究经原核表达、纯化获得了rHSP70-b2和rHSP70-b2M，并对其进行凝血四项指标PT、APTT、TT和FIB测定，其中，PT和APTT分别反映外源性和内源性凝血途径的指标[27]；TT反映了纤维蛋白原向纤维蛋白的转化时间；FIB反映了纤维蛋白原产生纤维蛋白的能力[28]。本研究结果显示，rHSP70-b2和rHSP70-b2M均可通过TT和FIB途径产生抗凝血效果，说明二者可通过抑制凝血酶活性或阻止可溶性纤维蛋白原转变为不可溶的纤维蛋白而发挥抗凝血作用，这与褐黄血蜱HSC70的抗凝血作用相一致[9]。
原核表达微小扇头蜱肠道抗原Bm86制备的有效防控微小扇头蜱疫苗，已说明抗蜱疫苗是一种可行的控蜱策略[29]。开发抗蜱疫苗的先决条件是筛选出在蜱生理过程中发挥重要作用的蛋白分子，且该蛋白应具有较好的免疫原性。研究表明，HSP70可与特异性多肽结合，形成的HSP70-多肽复合物被特殊的抗原呈递细胞摄取后，递呈给MHC分子并被T细胞识别[30]，且HSP70的14-Mer肽可增强NK细胞的增殖与活性[14]。本研究结果表明，未突变的含类14-Mer肽的rHSP70-b2诱导产生抗体的能力强于突变后含14-Mer肽的rHSP70-b2M，这可能是由于突变后的14-Mer肽虽强化了NK细胞活性，但NK细胞对刺激抗体表达并未发挥正面效应[31]。尽管如此，本研究结果依然证明了rHSP70-b2、rHSP70-b2M能够刺激大鼠对相应抗原产生特异性抗体，这与蔺焕然等[32]用原核表达的犬吉氏巴贝斯虫(Babesia gibsoni)HSP70蛋白免疫小鼠产生抗体的研究结论相一致。
4 结论rHSP70-b2和rHSP70-b2M可通过抑制凝血酶活性或阻止可溶性纤维蛋白原转变为不可溶的纤维蛋白而发挥抗凝血作用。rHSP70-b2和rHSP70-b2M均可刺激机体产生特异性抗体，且rHSP70-b2的免疫原性强于rHSP70-b2M。
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(编辑 白永平)