2. 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室, 武汉 430064;
3. 中国农业大学动物科技学院 动物营养与饲料科学国家重点实验室, 北京 100193
2. Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding, Animal Husbandry and Veterinary Research Institute of Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064, China;
3. State Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science, College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens，CP)诱导的坏死性肠炎(necrotic enteritis，NE)是一种主要的家禽肠道疾病，对家禽养殖造成了严重损害[1]。据估计，NE导致全球家禽业每年增加的养殖成本以及生产力损失高达60亿美元[2]。CP是一种革兰阳性厌氧芽孢杆菌，根据其α-毒素、β-毒素、ε-毒素、ι-毒素、肠毒素和NetB毒素的产生特点可分为7个亚型[3]。导致家禽发生NE的主要是A型和G型CP，其中A型CP可分泌α毒素，而G型CP可分泌α毒素和NetB毒素。α毒素通过其磷脂酶活性破坏细胞膜结构，NetB毒素是β成孔毒素家族的成员，通过形成跨膜孔，破坏细胞的双层磷脂膜，两种毒素因子均可破坏肠道上皮细胞。除毒素外，已有研究证实CP的基因组中包含多达56种碳水化合物活性酶基因，其可分泌唾液酸酶、半乳糖苷酶等，降解肠道黏液中的聚糖和蛋白质为自身提供营养物质[4]。CP通过多种毒力因子的综合作用而损害肠道形态、引发严重的肠道炎症反应，还损害肠上皮屏障功能，破坏肠道菌群平衡[5]。在饲料中添加促生长类抗生素(antibiotic growth promotors，AGP)是过去预防和控制NE发生的常规手段，而随着饲料中AGP的禁用，NE的发生急剧增加。因此，寻找有效的替代品来控制NE的发生成为当前养禽业急需解决的问题之一。
植物精油(essential oil, EO)是芳香植物中的次级代谢产物，具有抑菌、抗病毒、抗炎、抗氧化等广泛的生理功能[6]。天然EO的成分非常复杂，包括萜烯、萜类化合物、酚类、醛类、酮类和酯类[7]，其中醛类和酚类精油表现出最高的抗菌活性。在EO的成分中，百里香酚和香芹酚是百里香和牛至等常用芳香植物的主要活性成分[8-9]，具有突出的抑菌效果。在肉鸡生产中发现，日粮中添加EO可改善肉鸡的肠道组织形态，增强机体免疫力和抗氧化能力，并能提高肠道和胰腺消化酶活性，提高肉鸡生长性能[8, 10]。此外，日粮中添加EO有助于改善肠道菌群结构，添加包被精油和有机酸混合物降低了毛螺菌科和拟杆菌属的基因相对丰度，缓解了CP感染造成的肠道损伤[11]。还有研究表明，日粮中添加EO混合物(主要成分为百里香和香芹酚)抑制了肠道中变形杆菌的生长，从而减少肠道炎症，改善肠道健康[12]。
除了直接影响肠道菌群结构外，EO还可能影响肠道菌群的功能。有关EO对CP感染肉仔鸡肠道功能基因的影响还有待研究。与16S测序技术相比，宏基因组测序可以深入菌群功能层面进行分析。CAZy数据库是关于能够合成或者分解复杂碳水化合物和糖复合物的酶类的一个数据库资源，eggNOG数据库收集了全面的物种和大量的蛋白序列数据，并且能进行同源基因分类以及功能注释，是目前最先进、最完善的数据库。因此，本试验在日粮中添加EO以探明其对肉鸡NE造成的肠道损伤是否具有缓解作用，并采用宏基因组测序技术，通过eggNOG数据库和CAZy数据库来探究日粮中添加EO对CP感染肉仔鸡肠道菌群碳水化合物活性酶和毒力相关基因的影响，以期深入探究EO缓解NE的机制，为EO的有效利用及NE的防控提供一定数据参考和技术支持。
1 材料与方法 1.1 试验材料本试验所用的EO由诺伟司国际公司(美国)提供，该产品的活性成分为百里香酚和香芹酚，各含25%。另外，该产品含37%的二氧化硅(抗结块剂)和13%的甘油酯(包被剂)。
1.2 试验设计选取体重一致的1日龄雄性爱拔益加(Arbor Acres)肉仔鸡112只，随机分为2个处理，每个处理7个重复，每个重复8只鸡。处理组分为对照组(Ctrl, 饲喂基础日粮)和精油组(EO，在基础日粮中添加120 mg·kg-1的EO)。日粮参照中国鸡饲养标准(2004)配制，其原料组成及营养水平(计算值)见表 1，试验期共21 d。
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表 1 基础日粮组成和营养水平(风干基础) Table 1 Diet composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
本试验使用1株从NE鸡肠道内分离的A型CP(CVCC2030)来建立肉仔鸡NE模型，从第14日龄至20日龄，所有肉仔鸡连续每天经口接种新鲜培养的CP菌液1 mL(约1×108 cfu·mL-1), 该菌株购自中国兽医药品监察所。将菌株在庖肉培养基中37 ℃厌氧培养过夜，并使用亚硫酸盐-多黏菌素-磺胺嘧啶琼脂(SPS)进行活菌计数。
1.4 饲养管理饲养试验，采用笼养方式，肉仔鸡自由采食和饮水，24 h光照。并于第7日龄进行新城疫和传染性支气管炎二联苗免疫，于14日龄进行法氏囊疫苗免疫。试验第一周鸡舍温度保持在33~35 ℃，以后每天下调约0.5 ℃，直到25 ℃左右；鸡舍湿度控制在50%~60%，保持通风。
1.5 样品采集于第21日龄，从每个重复笼中随机挑选接近平均体重的肉仔鸡1只，颈静脉放血屠宰。肉眼观察整段肠道浆膜层和黏膜层病理变化，根据肠道损伤程度进行肠道损伤评分。无菌采集全部回肠食糜并混匀，液氮速冻后置于-80 ℃保存，用于宏基因组测序分析。
1.6 肠道损伤评分肠道损伤评分参考Dahiya等[13]和Liu等[14]的方法，检查整个肠段病变程度并进行总体评分。评分标准采用0~3分制：0分(没有明显损伤)、0.5分(小肠的浆膜面和肠系膜严重充血)、1分(肠壁变薄、变脆，有红色瘀点出现)、2分(肠腔内有气体，肠壁出现针尖样坏死或溃疡点)、3分(肠腔内充满气体，肠壁出现片状坏死或溃疡)。
1.7 宏基因组测序分析1.7.1 DNA的提取与样品检测 从每个处理中随机挑选3个重复，应用粪便微生物DNA提取试剂盒(QIAampⓇ Fast DNA Stool Mini kit, Qiagen公司，德国)提取回肠微生物菌群DNA。利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测(AGE)分析DNA的纯度和完整性；使用QubitⓇ dsDNA Assay Kit in QubitⓇ 2.0 Flurometer(Life Technologies, CA, USA)对DNA进行定量。取适量样本于离心管中，用无菌水稀释样品至OD值在1.8~2.0之间。
1.7.2 文库的构建 取样本的1 μg基因组DNA，使用NEBNextⓇ Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB, USA)进行文库的构建，用Covaris超声波破碎仪随机打断成长度约为350 bp的片段，经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至2 ng·μL-1，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度＞3 nmol·L-1)，以保证文库质量。
1.7.3 宏基因组测序 利用第二代测序技术(Next Generation Sequencing)对肠道微生物DNA进行宏基因组测序分析，进一步挖掘其功能基因信息。为避免宿主和肠道食糜中饲料原料所含DNA对微生物DNA的污染，将获得的clean data进行宿主过滤，包括筛除鸡(Gallus gallus)、小麦(Triticum aestivum)和大豆(Glycine max)的基因。将筛选后的DNA序列进行组装，采用MetaGeneMark进行基因预测，然后将基因与碳水化合物数据库(CAZy)和直系同源蛋白分组比对数据库(eggNOG)比对，进行基因功能注释和丰度分析。同时，基于功能丰度表进行样品PCA分析。
1.8 数据统计与分析数据用平均值和SEM(标准误)表示。采用SPSS17.0软件的Student’s t检验分析肠道损伤评分数据，P < 0.05表示组间差异显著。针对不同层级的功能基因相对丰度，利用Metastats方法对功能丰度数据进行假设检验得到P值，通过对P值的校正，得到q值，然后根据q值筛选具有显著性差异的功能基因(q < 0.05表示组间差异显著)，并绘制差异功能在组件的相对丰度热图。
2 结果 2.1 肠道损伤评分由表 2可知，CP感染引起肉仔鸡发生肠道损伤，基于对NE典型体征的观察，感染鸡只肠道出现了明显的出血、局部坏死等病理变化，本研究成功构建NE模型。与Ctrl组相比，EO组显著降低肉仔鸡的肠道损伤(P < 0.05)。
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表 2 植物精油对肉仔鸡肠道损伤的影响 Table 2 Effects of essential oils on intestinal injury of broilers |
为探索EO的添加对CP感染肉仔鸡肠道菌群功能基因的影响，本试验对其进行了宏基因组测序分析。分析结果显示，每个样品得到不低于10 G的原始数据(raw data), 97%以上为有效数据(clean data)，而经宿主过滤后得到的平均有效数据约为5.4 G。
2.2.1 回肠菌群碳水化合物活性酶基因 将回肠菌群基因与CAZy数据库比对，图 1直观地展示了CAZy第二层级差异基因在各个样品中相对丰度的高低。对于注释到CAZy第二层级的差异基因，EO的添加显著增加了糖基转移酶类(包括GT13、GT29、GT7和GT31)、糖基水解酶GE9，以及碳水化合物结合模块(包括CBM2和CBM14)的基因相对丰度，而降低了糖基转移酶类GT56家族、GT66家族以及糖苷水解酶类GH73家族这三种功能基因的相对丰度(q < 0.05)。
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图 1 CAZy第二层级基因(左图)和EC层级基因(右图)相对丰度热图 Fig. 1 Heatmap based on the relative abundance of annotated genes at CAZy level 2 (left) and EC (right) |
在EC层级水平上也发现多种差异酶类(图 1)，其中，EO降低了GT66家族中的EC 2.4.99.18和EC 2.4.99.19两种酶的基因丰度，而提高了GT7和GT31家族中的EC 2.4.1.226、EC 2.4.1.175、EC 2.4.1._ (1, 4-N-acetylgalactosaminyltransferase)、EC 2.4.1.149、EC 2.4.1.222、EC 2.4.1.122、EC 2.4.1.79和EC2.4.1.134等的基因相对丰度(q < 0.05)。
2.2.2 回肠菌群基因蛋白功能 对于注释到eggNOG第二层级的差异基因，EO的添加显著降低了绝大部分功能基因的相对丰度(q < 0.05)，仅提高了毒素-抗毒素系统中的hicB家族、醛酮还原酶(Aldo-keto reductase，AKR)、锌指蛋白(Zinc finger protein，ZFP)和N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶(GlcNAc-6-P deacetylase，NagA)等4种功能基因的相对丰度(q < 0.05，图 2)。
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图 2 eggNOG第二层级基因相对丰度热图 Fig. 2 Heatmap based on the relative abundance of annotated genes at eggNOG level 2 |
由直系同源群(Orthologous Group，OG)层级注释结果可知(图 3)，添加EO后，大多数与代谢过程、细胞过程和有机氮化合物代谢过程有关的基因相对丰度显著降低，如COG0671、COG0236、COG0519、COG0640、COG0006、COG1576、COG1502、COG0518、COG1061、COG0476、COG1192。在分子功能方面，下降的大多数基因与酶催化活性、转移酶活性和水解酶活性有关，如COG2893、COG0519、COG0006、COG1502、COG0518、COG1061、COG0476、COG0110、COG0242、COG2017。
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图 3 eggNOG OG层级基因相对丰度热图 Fig. 3 Heatmap based on the relative abundance of annotated genes at eggNOG level OG |
基于eggNOG数据库同源基因组(OG)进行功能基因相对丰度的PCA分析(图 4)，发现Ctrl组和EO组的样本分别聚类，结果表明EO的添加改变了回肠微生物同源基因组的构成。
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横坐标表示第一主成分，百分比表示第一主成分对样品差异的贡献值；纵坐标表示第二主成分，百分比表示第二主成分对样品差异的贡献值；图中的每个点表示一个样品，同一个组的样品使用同一种形状表示 The abscissa represents the first principal component, and the percentage represents the contribution value of the first principal component to the sample difference; The ordinate represents the second principal component, and the percentage represents the contribution value of the second principal component to the sample difference; Each point in the figure represents a sample, and the samples in the same group are represented by the same shape 图 4 基于eggNOG数据库同源基因组(OG)相对丰度的PCA分析结果 Fig. 4 Principal component analysis (PCA) based on the relative abundance of orthology group at eggNOG |
试验采用CP(CVCC2030菌株)感染AA肉仔鸡，建立了肉仔鸡NE模型。有研究表明，日粮中添加包被香芹酚显著降低了肉仔鸡由CP感染造成的肠道损伤[15]。Gharaibeh等[16]发现，添加混合EO(含有香芹酚、百里香酚、香芹酮和二甲基三硫)有效减少了肉仔鸡肠道中CP的数量，降低了血清中IFN-γ、IL-1β和IL-8细胞因子的水平，从而缓解了NE造成的肠道损伤。本研究结果显示，在日粮中添加以香芹酚和百里香酚为活性成分的EO明显改善了CP感染造成的肉仔鸡肠道损伤，与前人研究结果相似。
3.2 EO对肉仔鸡肠道菌群碳水化合物活性酶和毒力相关基因的影响体外试验已证实EO及其组成成分能够抑制CP在内的多种病原菌的生长[17]。然而在体试验中EO对肠道病原菌的影响不尽一致。前文已提到，有研究表明，混合EO有效减少了肠道中的CP数量[16]。而Sun等[18]和Du等[19]的研究表明，日粮中添加EO(香芹酚和百里香酚为主要成分)可显著降低CP感染肉仔鸡肠道损伤评分，改善肠道屏障功能，但是并没有影响CP的数量。在体试验往往比体外试验复杂，在动物体内，EO的抗菌作用受多种因素的影响，这可能意味着除了直接抑制CP数量外，EO可能通过干扰肠道细菌的毒力而缓解NE。因此，本试验采用宏基因组测序技术来探究EO对肉仔鸡回肠菌群碳水化合物酶和毒力相关基因的影响。
3.2.1 EO对肉仔鸡肠道菌群碳水化合物活性酶的影响 基于CAZy数据库的注释结果发现，在第二层级上存在许多差异显著的基因，糖苷水解酶(Glycoside Hydrolases，GH)是切割聚糖糖苷键的酶，却来越多的GH被认为是细菌病原体的毒力因子，例如内β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(GH73)[20]。在本研究中，EO的添加显著降低了GH73基因的相对丰度，可能意味着EO有助于抑制肠道内病原菌的毒力。此外糖基转移酶(Glycosyl Transferases，GT)和碳水化合物结合模块(Carbohydrate Binding Modules，CBM)两大家族已被证明与复杂多糖类的代谢密切相关[21]。同时，本研究在EC层级注释到大量差异性显著的酶类，得到的结果中GT家族占比最高，由于EO处理提高了多种GT基因的相对丰度，说明添加EO可能提高了回肠菌群糖基转移相关的代谢活动。
3.2.2 EO对肉仔鸡肠道菌群毒力相关基因的影响 单磷酸鸟苷(GMP)是一种用于信号传递，控制细菌毒性与生存的重要的细胞代谢物[22]。腺嘌呤和其他嘌呤类似物(如黄嘌呤和次黄嘌呤)转化为单磷酸肌苷(IMP)，进一步转化为单磷酸盐黄嘌呤(XMP)，最终通过GMP合酶(GUA)的作用转化为GMP。有研究表明，在艰难梭菌菌株630中，GMP合酶(GUA)失活导致细菌在最小生长条件下死亡；将GUA进行突变，艰难梭菌菌株630在小鼠肠道定植的能力显著降低[23]。本研究发现，添加EO显著降低了催化XMP转化为GMP的活性酶基因Catalyzes_ the synthesis of GMP from XMP的相对丰度。进一步在OG层级注释结果中发现，与GMP合酶活性密切相关的直系同源蛋白蔟COG0519和COG0518，其基因相对丰度均在EO处理后显著降低。因此，EO有可能通过抑制GMP合成相关途径而干扰细菌的代谢活力。旺盛的代谢活力是细菌分泌多种毒素和毒力相关因子的基础，GMP合成相关途径受阻，可能有助于抑制细菌毒力因子的产生，从而缓解肠道损伤。
DsbA是一种有助于提高细菌毒力的蛋白质折叠催化剂[24]。DsbA蛋白的氧化折叠系统在细菌毒力中起着重要作用。有研究表明，DsbA催化参与细菌致病性的蛋白质的正确折叠，例如与黏附、毒素产生和细胞传播相关的蛋白质[25]。DsbA的作用也与包括沙门菌在内的多种病原体的毒力和生物膜形成有关[26-27]。Trevisan等[28]发现，624 μg·mL-1的香芹酚抑制了鼠伤寒沙门菌的生物膜形成，且降低了DsbA蛋白质的合成，作者猜测香芹酚的抗生物膜作用可能与该蛋白质的合成减少有关。在本研究中，日粮中添加EO降低了DsbA基因的相对丰度，可能有助于降低肠道内病原菌的毒力，抑制其生物膜形成。生物膜的形成可提高细菌在不同环境中的耐受性和持久性。研究发现，生物膜是自然界和动物肠道中细菌的主要存在形式[29]，高达80%的感染都与生物膜有关[30]。DsbA可能抑制生物膜形成，减弱细菌的抵抗力，对改善肉仔鸡肠道损伤具有积极作用。
L-鼠李糖是一种常见的细菌细胞壁成分，通常通过增加病原体的黏附和免疫逃逸来促进病原体的毒力。用于形成活化的L-鼠李糖供体dTDP-L-鼠李糖的生物合成途径由4种酶(RfbA，RfbB，RfbC和RfbD)组成[31]，而添加EO显著降低了dTDP-4-dehydrorhamnose 3, 5-epimerase(RfbC)的基因相对丰度，可能有助于抑制L-鼠李糖的合成。与此同时，本研究在OG层级中发现COG0239通过降低细胞中的氟化物浓度来降低细菌毒性，EO的添加显著降低了COG0239基因相对丰度[32]。这些结果意味着EO很可能通过调控多种蛋白的表达而降低肠道中细菌的毒力，从而缓解肉仔鸡肠道损伤。
4 结论本试验结果表明，日粮中添加EO缓解了CP感染造成的肉仔鸡肠道损伤，其缓解作用可能与EO调控了肠道菌群的碳水化合物活性酶基因的相对丰度、抑制了肠道菌群GMP合成及毒力相关蛋白的基因相对丰度有关。
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(编辑 范子娟)