西农萨能奶山羊是经过长期选育出的优良地方奶畜品种,具有良好的泌乳性能和遗传稳定性,其年平均产奶量超过500 kg[1]。近年来,随着人们对奶山羊乳制品营养价值的认可,奶山羊产业进入加速发展阶段。山羊乳中富含多种营养物质和功能活性乳蛋白,包括单不饱和脂肪酸、乳铁蛋白和酪蛋白等[2]。奶山羊乳腺上皮细胞的增殖、乳脂的形成和乳蛋白的分泌受到众多转录因子的调控[3-4]。目前,转录因子间调控网络尚不清楚。有研究表明,αS1-酪蛋白基因和乳铁蛋白基因的启动子区域含有转录激活因子5(signal transducer and activator of transcription 5, STAT5)、YinYang-1(YY1)、CCCTC结合因子(CCCTC-binding factor, CTCF)和特异性蛋白1(specialized protein 1, SP1)等转录因子,在乳腺上皮细胞中STAT5和CTCF能够影响乳蛋白基因的转录[5-6]。除此之外,固醇调节元件结合蛋白1 (sterol regulatory element-binding factor 1, SREBF1)作为反刍动物机体中重要的转录因子,通过调控乙酰辅酶A短链脂肪酸合成酶2 (acetyl-CoA synthetase 2, ACSS2)基因转录参与乳腺脂肪酸代谢过程[7]。过氧化物酶体增殖物激活受体α (peroxidase extracted proliferator activated receptor a, PPARα)通过结合在硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1, SCD1)的启动子区影响其转录表达,进而提高奶山羊乳腺上皮细胞中单不饱和脂肪酸的表达[8]。肝X受体α(liver X receptor α, LXRα)能够结合在SREBF和SCD1的启动子区调控长链不饱和脂肪酸如C18∶1和C18∶2的合成[9]。因此,研究奶山羊乳脂代谢和乳蛋白合成的转录调控机制,在提高乳品品质方面具有重要意义。
转录激活子4 (ATF4) mRNA在反刍动物的多种组织中广泛表达,其影响蛋白质合成场所的内质网稳态、参与调控蛋白质转运和脂代谢过程[10-12]。有研究表明,ATF4直接调控脂肪细胞分化,ATF4与CTCF共定位于CCAAT/增强子结合蛋白Delta(CCAAT enhancer binding protein C/EBPδ, Cebpd)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARg)等关键成脂基因的启动子区,共同调控脂代谢相关基因的表达[10-13]。在奶牛乳腺上皮细胞中,ATF4与雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)相互作用调节乳脂和乳蛋白的合成,靶向调节氨基酸转运载体SLC7A1表达[14]。正常条件下培养牛乳腺上皮细胞,ATF4与转录因子核因子E2结合调节SLC7A1表达;氨基酸饥饿条件下培养牛乳腺上皮细胞,ATF4诱导去乙酰化酶6表达干预氨基酸转运[14]。但在小鼠乳腺过表达ATF4基因影响乳腺的正常发育,乳腺上皮细胞受损,细胞凋亡率上升,细胞增殖率降低[15]。由此可见,ATF4在器官发育、乳蛋白合成、脂代谢等生物过程中发挥着重要的作用。
乳腺的泌乳功能对于母体与子代的生长发育具有重要的影响,而乳脂和乳蛋白含量是评价乳品质量的重要指标。ATF4在奶山羊乳腺上皮细胞中的功能尚不清楚。本研究旨在对奶山羊ATF4基因序列进行克隆、生物信息学分析及组织差异性表达分析。并通过干扰ATF4基因表达,初步分析ATF4基因对奶山羊乳腺上皮细胞乳蛋白合成和乳脂代谢的影响,从而为深入探究ATF4的转录调控机制提供依据,为构建奶山羊乳蛋白、乳脂代谢网络提供基础资料。
1 材料与方法 1.1 材料及试剂试验动物:选用西北农林科技大学萨能奶山羊原种场(陕西省咸阳市杨陵区)处于泌乳高峰期的西农萨能奶山羊3只,屠宰后,手术采集心、肝、脾、肺、乳腺、肾、瘤胃、小肠等组织1~2 g;选取泌乳前期(分娩后15 d)、泌乳盛期(分娩后60 d)、泌乳末期(分娩后120 d)和干奶期(分娩前60 d)体况良好、胎次相同的奶山羊各3只。利用普鲁卡因对羊只乳腺施行局部麻醉,手术采集乳腺组织1 g左右,用灭菌的DEPC水漂洗,除去外层薄膜及残余血迹后,迅速放入无RNA酶冻存管中,置于液氮罐中冻存备用。
试验试剂:质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司(北京);DL2000 DNA Marker、Primer Star MAX聚合酶、DNA marker、pMD19-T载体和质粒提取试剂盒;TRIzol购自Invitrogen (美国);荧光定量PCR试剂盒购自北京擎科生物科技有限公司。
1.2 仪器7500 Real time PCR仪(ABI,美国),分光光度计Nanodrop 2000 (Thermo,美国),MM400UVP凝胶成像系统(BioSpectrum,美国),EPS 300电泳仪(天能科技有限公司, 上海),倒置显微镜(徕卡公司,德国)。
1.3 试验方法1.3.1 西农萨能奶山羊ATF4基因CDS区克隆 根据NCBI中山羊ATF4基因序列(GenBank No. XM_018 048 794.1),通过Premier6.0软件设计引物,引物序列见表 2。提取山羊乳腺上皮细胞总RNA,通过反转录得到的cDNA作为模板,进行PCR扩增,扩增产物大小应为1 059 bp。PCR反应体系20 μL:cDNA模板1 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,Primer Star Max 10 μL,ddH2O 7 μL。PCR扩增程序:98 ℃预变性3 min;98 ℃变性10 s,58 ℃退火5 s,72 ℃延伸10 s,共33个循环;72 ℃延伸3 min;12 ℃终止反应。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离后,回收目的条带。将目的片段与pMD-19 T载体在16 ℃条件下连接12 h。连接产物转化氨苄抗性的DH5α感受态细胞,涂板倒平板放置于37 ℃培养箱生长12 h,挑取单克隆于氨苄抗性的LB液体培养基中扩繁,用质粒小提试剂盒提取质粒,然后进行电泳,选出一个阳性的克隆质粒送上海生工生物公司测序,将测序正确的质粒保菌备用。
1.3.2 西农萨能奶山羊ATF4基因的生物信息学分析 相关的生物信息学分析软件及网址如表 1所示。
1.3.3 西农萨能奶山羊ATF4基因组织表达谱分析 使用RNAiso plus试剂TRIzol法提取乳腺组织总RNA,乳腺总RNA通过0.8%琼脂糖电泳检测其完整性。应用NanoDrop2000测定RNA浓度。cDNA第一链的合成参考RT Reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒说明书,荧光定量PCR按照TB Green Ⅱ试剂盒说明书进行,以泛表达转录子(ubiquitously expressed transcript,UXT)和核糖体蛋白S(9ribosomal protein S9,RSP9)作为内参基因,qPCR引物序列参考表 2。qPCR反应程序如下:1)95 ℃预变性30 s;2)95 ℃ 5 s至60 ℃ 30 s,设置45个循环;3)添加熔解曲线。以反转录后的cDNA为模板,通过荧光定量PCR检测其相对表达量。ATF4基因的组织相对表达量采用2-ΔΔCt法计算并采用GraphPad Prism v7.0.4进行绘图,ATF4基因的qRT-PCR引物如表 2所示。
1.3.4 细胞转染及相关基因表达分析 按照北京擎科生物科技有限公司siRNA说明书将si-ATF和si-NC用无酶水溶解,置于-20 ℃冰箱保存,si-ATF序列见表 2。将奶山羊原代乳腺上皮细胞消化后布板于12孔细胞培养板,细胞培养密度达80%转染siRNA。SiRNA转染复合物:siRNA体积∶转染试剂Lip2000=2∶1,孵育15 min将混合液加入细胞培养板,终浓度为100 nmol·L-1。乳腺上皮细胞转染siRNA48 h后,参照“1.3.3”提取RNA并反转录合成cDNA,检测ATF4基因干扰对奶山羊乳腺上皮细胞脂代谢和乳蛋白相关基因表达的影响。试验采用的qRT-PCR引物如表 2所示。
1.3.5 Bodipy脂滴染色试验 将奶山羊原代乳腺上皮细胞消化后布板于12孔细胞培养板,细胞培养密度达60%转染siRNA。Si转染复合物:siRNA体积∶转染试剂Lip2000=2∶1,孵育15 min将混合液加入细胞培养板,终浓度为100 nmol·L-1。转染48 h后,PBS清洗去除培养基,用4%多聚甲醛固定30 min,分别用Bodipy和DAPI对细胞进行染色,具体方法参照藏赛鸽[16]试验步骤。
1.4 统计分析对于两组结果的比较,使用独立样本t检验分析试验结果的显著性;对于两组以上结果的比较,利用软件SPSS 17.0进行One-Way ANOVA显著性检验,试验结果均以“平均值±标准差”表示。当P < 0.05时,统计学差异显著;当P < 0.01时,统计学差异极显著。
2 结果 2.1 克隆得到山羊ATF4基因CDS序列通过PCR扩增获得ATF4基因CDS片段后,经过1%琼脂糖凝胶检测,扩增条带如图 1所示,全长为1 059 bp,测序后进行序列比对,与XM_018048794.1的相似度为99.81%,可以初步确定为山羊ATF4 CDS区序列,但存在两处碱基突变,分别为150位(C→T)和1 000位(A→G)。其碱基含量分别为:A=26.8%,T=21.5%,C=25.1%,G=26.5%。
通过ExPASy分析西农萨能奶山羊ATF4蛋白的氨基酸组成,结果如图 2所示,该蛋白含有352个氨基酸;西农萨能奶山羊在18、23、30、49、57、68、70、73、79、101、147、166、171、172、177、179、184、189、193、197、200、215、224、228、231、235、237、239、242、246、249、254、256、257、327位氨基酸处共有35个丝氨酸磷酸化位点。
西农萨能奶山羊ATF4蛋白质含有氨基酸352个;氨基酸分子量38.545 24 ku;理论等电点为4.61;总分子式为C1 683H2 678N442O562S14(表 3)。结果表明不稳定因子为55.93。氨基酸成分分析表明,Ser的出现频率高达11.6%,Trp的出现频率很低,只有0.6%。其中,总共65个带负电荷的残基(Asp+Glu)和42个带正电荷的残基(Arg+Lys+His)。通过NetCTL-1.2在线软件进行CTL表位预测,结果显示其氨基酸序列中存在7个MHC配体。ATF4蛋白在第277~341氨基酸含有1个亮氨酸(bZIP)结构域,表明其可能是一种调控细胞增殖和脂质代谢过程的功能蛋白。
通过PSORT在线预测亚细胞定位,结果显示ATF4蛋白在细胞核占比最高82.60%,在细胞质占比13.00%,在线粒体占比4.30%。通过TMHMM在线预测,ATF4蛋白无跨膜结构(图 3)。通过SignalP 5.0在线预测,ATF4蛋白无信号肽(图 4)。
NPS在线分析结果显示,西农萨能奶山羊ATF4蛋白的二级结构中α-螺旋、延伸链、无规则卷曲、β-转角分别为39.77%、7.10%、51.14%和1.99%。利用SWIS-MODEL在线分析得到ATF4蛋白三级结构,且与二级结构的预测结果基本一致。ATF4蛋白质的二级结构、三级结构分别如图 5和图 6所示。
采用STRING交互式数据库分析ATF4蛋白与其他蛋白的相关性,预测图如7所示,结果显示,ATF4与CEBPB、CEBPG、ATF3、FOSL2、ATF1、DDIT3、TRIB3、BTRC、CREB1、DISC这10个蛋白存在相互作用。
利用软件MEGA7.0将ATF4基因转化为氨基酸序列,利用NCBI对羊、水牛、牛、美洲野牛、鼠、人和大猩猩的7个氨基酸序列进行了分析(图 8)。山羊ATF4氨基酸序列与绵羊、牛、美洲野牛、小鼠、人和大猩猩的同源性分别为97.45%、91.48%、91.48%、80.79%、85.55%和85.55%,显示山羊与绵羊和牛的亲缘关系最近。
检测ATF4基因在不同组织中的表达量,结果如图 9所示,ATF4基因的表达量在瘤胃组织中最高,其次为肌肉;在脂肪及肾组织中的表达水平很低。分析不同泌乳阶段的ATF4基因的表达情况,结果表明在泌乳前期表达水平最高,在泌乳盛期次之。
由图 10A可见,干扰ATF4基因表达后奶山羊乳腺上皮细胞脂滴累积显著降低(P < 0.05)。如图 10B所示,干扰ATF4基因表达,乳脂代谢相关基因FASN和FABP3基因mRNA表达量下降,PPARα和PPARγ基因mRNA表达量上调(P < 0.05);如图 10C所示,与si-NC组相比,乳蛋白相关基因BLG基因mRNA表达量下降(P < 0.05),LALBA基因mRNA表达量上调(P < 0.05),CSN2和CSN3基因无显著差异(P>0.05)。
ATF家族是具有亮氨酸结构域的转录因子,已有研究表明,ATF4能够调节脂代谢、糖代谢和氨基酸代谢[16-19]。任路平等[20]研究证实,在人肝肿瘤细胞中敲减ATF4能够下调脂质从头合成并调节肝脂沉积。郭非凡等[18]研究也证实了全身性敲除ATF4小鼠的脂肪细胞面积减少,脂代谢相关基因SCD1表达量降低。目前,有关ATF4的研究多集中在人和小鼠中,在反刍动物方面鲜有报道。本研究克隆得到西农萨能奶山羊ATF4基因序列全长1 059 bp,编码352个氨基酸。生物信息学分析结果表明,ATF4基因编码的是一种不稳定酸性蛋白质,不含跨膜结构域和信号肽,预测有35个丝氨酸磷酸化位点,亚细胞定位主要在细胞核,这与前人在其他反刍动物的研究一致[10]。ATF4蛋白在第277~341氨基酸含有1个亮氨酸结构域(bZIP)[21],表明其可能是一种调控细胞增殖和脂质代谢过程的功能蛋白。本研究通过对ATF4基因的序列同源性分析发现,山羊ATF4蛋白氨基酸序列与绵羊和牛的亲缘关系最近,说明ATF4进化符合物种进化规律。前人研究表明,ATF4基因在绵羊、牦牛和奶牛等反刍动物的繁殖性能有重要的作用,进而推测ATF4基因参与调控奶山羊的生产性能[10-12, 14]。
ATF4蛋白相互作用结果显示,西农萨能奶山羊ATF4蛋白可能与CREB1、CEBPB、CEBPG、ATF1、ATF3、DDIT3、TRIB3等蛋白存在相互作用。有研究表明,CREB1在奶山羊泌乳盛期的表达量较高,过表达CREB1基因,显著上调乳脂合成相关基因如SREBP1、FASN和ACACA等基因的表达,表明其在乳脂合成过程中的重要作用[10-12, 14];ATF1、ATF3和ATF4均属于转录因子ATF/cAMP应答元件结合蛋白[22-26],ATF1基因介导BCL-2基因调节细胞凋亡[27];ATF3基因通过PPARγ、CEBPα和AP2等转录因子调控山羊肌内前体脂肪细胞脂滴的积聚[28];韦张其[29]在将DDIT3作为改善牛奶品质关键基因研究时发现,干扰DDIT3基因的表达,影响脂质代谢相关基因如ACSL6、ELOVL6和SCD1的表达;TRIB3基因在奶山羊小肠、心和乳腺等10种组织中表达差异较大,在乳腺组织中表达量相对最高,干扰TRIB3基因的表达上调PPARG和DGAT1基因mRNA水平,负向调控奶山羊甘油三酯的合成[30]。分析蛋白质互作结果表明,与ATF4蛋白相互作用的蛋白参与奶山羊乳脂合成过程,影响脂代谢相关基因的表达,进而推测ATF4基因与奶山羊泌乳功能具有强相关性。
实时荧光定量结果表明,ATF4基因在西农萨能奶山羊瘤胃、肌肉和肝组织中高表达,说明ATF4的生物学功能广泛,这与在人、猪、牦牛和绵羊研究ATF4在不同组织普遍表达结果一致[10, 12, 31-32]。本研究结果显示,ATF4基因在奶山羊乳腺组织中表达量相对较少,但不同泌乳时期均有表达。ATF4在奶山羊泌乳早期表达量最高,盛期较高,末期和干奶期表达较低。这与ATF4在小鼠不同时期乳腺组织中表达趋势一致[15]。泌乳早期、盛期是乳腺发育时奶山羊乳腺上皮细胞增殖分化的重要时期,ATF4基因在这两个重要时期的高表达说明其可能参与奶山羊乳腺发育和泌乳过程。本研究中,干扰ATF4基因表达后,脂滴累积减少,FASN表达量降低,脂肪酸从头合成受阻[33]。干扰ATF4基因表达能够激活PPARα基因表达,细胞内脂肪酸运输相关FABP3基因表达降低,这与已有研究一致[34]。提示ATF4可能在乳脂代谢过程中具有正向调节作用。干扰ATF4基因表达后,BLG基因mRNA表达量下降,LALBA表达量上调,表明乳蛋白合成可能发生紊乱,推测ATF4基因与mTOR和STAT5相互作用,影响乳蛋白的合成,但调控机制还需要进一步探索。在同为奶畜的奶牛乳腺上皮细胞的研究发现,ATF4可以调控β-酪蛋白的表达[14]。但在本研究中干扰ATF4基因表达后,CSN2和CSN3基因无显著变化,CSN2表达有降低趋势。推测其原因可能为CSN2、CSN3与ATF4不存在潜在的调控关系,也可能与si-ATF处理浓度和时间有关。
4 结论本研究成功克隆西农萨能奶山羊ATF4基因的CDS区序列,长度为1 059 bp,编码352个氨基酸,为不稳定酸性蛋白质,并可能与CREB1、CEBPB、CEBPG、ATF1、ATF3、DDIT3、TRIB3等蛋白存在相互作用。ATF4基因在奶山羊泌乳早期表达量最高。干扰ATF4基因表达后奶山羊乳腺上皮细胞脂滴累积显著降低,乳蛋白合成发生紊乱。上述结果揭示了ATF4在奶山羊泌乳过程中的重要作用,为深入研究ATF4调控乳腺组织脂质代谢和乳蛋白合成的分子机制提供了基础资料。
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(编辑 孟培)