PhiC31整合酶来源于链霉菌属的放线菌噬菌体,属于丝氨酸整合酶(serine integrases)。在没有辅助因子存在的情况下,其可介导细菌和噬菌体基因组上特异性附着位点attB/attP之间的DNA重组反应,产生两个新的杂合位点attL和attR,这两个新位点再也不能被PhiC31整合酶所识别,因而这一重组反应是不可逆的[1]。此外,在发生重组反应时,PhiC31整合酶对attB序列的保守性要求很高,但是对attP序列的保守性要求不高。近年来,在哺乳动物和植物基因组中发现了与野生型attP位点类似的序列,它们能被PhiC31整合酶识别,并与携带有attB位点的donor质粒发生特异性整合,这些位点被称为伪attP(pesudo attP)位点。如人[2-3]、小鼠[4]、猪[5]、山羊[6]等生物中都发现了这类伪attP位点。PhiC31整合酶介导的重组反应具有这些特点:单向特异性整合、转基因稳定表达并整合至宿主基因组转录激活区域的安全位点,而且对宿主基因组的结构和功能不会产生异常调节作用,因而已经被用于鉴定哺乳动物的基因组安全位点。利用CRISPR/Cas9技术将两侧翼带有野生型attP位点(landing pad, LP)的报告基因敲入某个安全位点(如Rosa26),就可以获得转基因胚胎或个体,再将两侧翼带有attB位点的转基因donor质粒与PhiC31 mRNA/DNA共注射至上述单细胞胚胎原核中,通过PhiC31介导的重组反应,完整的单拷贝基因在attP位点上产生特异性整合,完成基因盒交换(recombinase-mediated cassette exchange, RMCE),整合效率达40%,而且可将转基因完整传递给后代[7-8],这项转基因技术称为TARGATT。其另一个优点就是,在转基因小鼠中,大片段DNA敲入效率高,长达22 kb的DNA片段已成功插入小鼠基因组[7]。这为生产转基因动物提供了新的思路[5]。
目前,PhiC31整合酶主要是通过质粒DNA[9]、mRNA[5]或者腺病毒载体[10]的形式发挥作用。但是,PhiC31整合酶质粒长期表达引起宿主细胞的DNA损伤和染色体重排[11],染色体重排的发生率高达15%[12]。RNA转染缺乏稳定性,在宿主细胞内容易降解。然而,PhiC31整合酶以蛋白质递送时,则不需要转录或翻译,使重组反应更快、更有效。Zhang等[13]将纯化的TAT-PhiC31融合蛋白转染293-PB(EGFP)细胞,成功介导了attP与attB之间的重组反应,使EGFP得以表达;Guha和Calos[14]应用核转染技术将PhiC31整合酶蛋白和带有attB位点的人源卵泡抑素donor质粒共转染HEK 293细胞,目的基因成功整合至宿主细胞基因组的伪attP位点上。但是,到目前为止有关PhiC31整合酶在鸡转基因方面的应用鲜有报道,PhiC31整合酶介导的RMCE相关报道更为少见。本研究的目的是,利用原核表达技术纯化SUMO-His-PhiC31融合蛋白,利用电穿孔技术先将带有attPTT-DsRed2-attPCT片段的LP质粒导入鸡胚成纤维细胞DF-1,再将带有attBTT-EGFP-HiBiT-attBCT的donor质粒连同PhiC31蛋白再次电穿孔上述DF-1细胞,监测PhiC31蛋白能否介导DsRed2与EGFP-HiBiT之间的基因盒交换事件。本试验将为鸡基因组安全位点的验证和转基因鸡研究奠定技术基础。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 主要试剂 pCMVInt和pBCPB+质粒购自美国Addgene公司,pCMVInt、pLVX-attBTT-EGFP-HiBiT-attBCT-puro和pLVX-DsRed2质粒、感受态DH5α和BL21由本实验室保存;限制性内切酶XhoⅠ和BamHⅠ、pMD18-T载体、T4 DNA连接酶、HisTALON重力柱、2×Premix TaqTM购自日本TaKaRa公司;卡那霉素、IPTG、溶菌酶、PMSF、胰蛋白酶、青霉素/链霉素购自中国索莱宝公司;BCA试剂盒购自中国碧云天公司;30k MWCO蛋白浓缩柱、DMEM、LipofectamineTM3000、Opti-MEM购自美国Thermo Fisher Scientific公司;SUMO蛋白酶购自美国Lifesensors公司;胎牛血清购自加拿大Wisent Corporation公司。
1.1.2 主要仪器 ECM-830电转仪(美国BTX公司),ECLIPSE Ti-S倒置荧光显微镜(日本Nicon公司)。
1.2 载体构建PhiC31原核表达载体构建。以pCMVInt(addgene:#18935)载体为模板扩增PhiC31整合酶的DNA序列片段(NLS-C31)。引物PhiC31-F(5′-GGATCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGTGGACACGTACGCG-3′)5′端引入21 bp的核定位信号序列(nuclear localization signal,NLS,下划线部分)和BamHⅠ酶切位点(斜体部分);引物PhiC31-R(5′-TATA CTCGAGCGCCGCTACGTCTTCCGTG-3′)5′端引入XhoⅠ酶切位点(斜体部分)和保护碱基(加粗字母)。反应体系(20 μL):pCMVInt 40 ng,PhiC31-F 1 μL,PhiC31-R 1 μL,2×Premix TaqTM 10 μL、ddH2O 7 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,30个循环;72 ℃延伸10 min。胶回收产物连接pMD18-T载体,BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pMD18-T-PhiC31与pET-28a(+)-SUMO空载体,T4 DNA连接酶连接。
无启动子pMD18-T-EGFP供体载体构建。以pLVX-attBTT-EGFP-HiBiT-attBCT-puro质粒为模板,用引物EGFP-F(5′-CTCGAGGTGCGGGTGCCAGGGC-3′)、EGFP-R(5′-GGATCCGGAGTACGCGCCCGGG-3′)扩增attBTT-EGFP-HiBiT-attBCT片段,胶回收连接pMD18-T载体。反应体系(20 μL):pLVX-attBTT-EGFP-HiBiT-attBCT-puro 40 ng,EGFP-F 1 μL、EGFP-R 1 μL,2×Premix TaqTM 10 μL,ddH2O 7 μL。PCR反应程序:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30个循环;72 ℃延伸10 min。
1.3 SUMO-His-PhiC31融合蛋白表达和纯化pET-28a-SUMO-PhiC31转化感受态细胞BL21。在含有100 μg·mL-1卡那霉素的LB固体培养基中培养单菌落,挑取单菌落接种到含30 μg·mL-1卡那霉素的5 mL LB培养基中,37 ℃、220 r·min-1下培养至OD600 nm达到0.6~0.8,向菌液加入终浓度为0.2 mmol·L-1 IPTG于16 ℃或37 ℃振荡培养6 h,收集菌液。然后,取部分变性处理后的菌液进行12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),并利用考马斯亮蓝染色1 h,脱色液(25 mL无水乙醇、8 mL冰醋酸、蒸馏水67 mL混匀)脱色,并拍照记录。
将表达SUMO-His-PhiC31融合蛋白的阳性菌接种至5 mL LB培养基中,37 ℃、220 r·min-1振荡培养10 h。将菌液按1∶100的体积比接种到300 mL含30 μg·mL-1卡那霉素的新鲜LB培养基中,37 ℃、220 r·min-1培养至OD600 nm达到0.6~0.8。向菌液中加入IPTG至浓度为0.2 mmol·L-1,16 ℃振荡培养20 h。菌液于4 ℃ 4 000×g离心20 min,收集菌体沉淀并称重。0.3 g菌体沉淀加入5 mL Lysis Buffer(50 mmol·L-1 NaH2PO4·2H2O、300 mmol·L-1 NaCl、pH8.0)重悬沉淀,加入终浓度为1 mg·mL-1的溶菌酶和0.2 μmol·L-1的PMSF,振荡混匀并冰上孵育30 min。菌体超声破碎30 min,4 ℃下9 000×g离心30 min,收集上清。
将上清液装入用缓冲液Lysis Buffer平衡后的HisTALON重力柱中,轻轻摇动混匀20 min后,将重力柱直立静止5 min后再过柱。待所有上清液过柱后,用5倍柱体积Wash Buffer(50 mmol·L-1 NaH2PO4·2H2O、300 mmol·L-1 NaCl、20 mmol·L-1 imidazole、pH8.0)洗脱杂蛋白,最后用5倍柱体积Elution Buffer(50 mmol·L-1 NaH2PO4·2H2O、300 mmol·L-1 NaCl、250 mmol·L-1 imidazole、pH8.0)洗脱目的蛋白。收集蛋白溶液,按照BCA试剂盒说明书测定蛋白浓度。先用蛋白标准品绘制标准曲线。在96孔培养板的每个计量孔中加入20 μL蛋白(3个重复),然后各孔再加入200 μL BCA工作液,37 ℃孵育25 min。设定波长为575 nm,用酶标仪读取各孔吸光度,根据标准曲线计算蛋白样品浓度。
1.4 切除SUMO-His标签释放PhiC31将洗脱后的SUMO-His-PhiC31蛋白溶液装入蛋白浓缩柱,以4 500 g离心15 min进行浓缩、脱盐。将1 mg的SUMO-His-PhiC31融合蛋白与11 U的SUMO蛋白酶混合,30 ℃孵育1 h后4 ℃过夜。12% SDS-PAGE检测切割效果。
也可以通过一步法纯化方式切除SUMO-His标签,获得PhiC31蛋白。表达目标蛋白的细菌经超声破碎,4 ℃下9 000×g离心30 min,将上清液装入用Lysis Buffer平衡后的HisTALON重力柱中,晃动混匀20 min后直立静止5 min。待裂解液上清流穿重力柱,用5倍柱体积的Wash Buffer洗脱杂蛋白,再用5倍柱体积的Lysis Buffer洗脱咪唑。3 mL SUMO蛋白酶溶液(1 U·mL-1)加入HisTALON重力柱中,4 ℃孵育过夜以切除SUMO-His标签。最后,从流穿液中收集天然PhiC31蛋白。12% SDS-PAGE检测SUMO-His标签切除效率。
1.5 PhiC31重组蛋白介导的分子内重组反应将1 μg pBCPB+质粒与1 μg SUMO-His-PhiC31或1 μg PhiC31蛋白质在37 ℃孵育24 h后,95 ℃变性10 min,利用引物attL-F(5′-GGCGAGAAAGGAAGGGAAGA-3′)和attL-R(5′-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3′)PCR扩增重组后形成的attL片段,初步验证PhiC31重组蛋白的生物活性。反应体系(20 μL):重组反应液0.5 μL,attL-F 1 μL,attL-R 1 μL,2×Premix TaqTM 10 μL,ddH2O 7.5 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,57.5 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,30个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,ImageJ分析电泳结果,重组效率=(重组后条带灰度值/重组与未重组条带总灰度值)×100%。
1.6 PhiC31蛋白介导的DsRed2-EGFP基因盒交换首先,将LP和donor质粒与PhiC31真核表达质粒(pCMVInt)共转染鸡胚成纤维细胞DF-1,以验证该置换系统的有效性。DF-1的基础培养剂为高糖DMEM,其中添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素,在饱和湿度、5% CO2和37 ℃条件下进行培养。DF-1细胞接种六孔板(4×105个·孔-1),待细胞汇合度达到80%时,根据LipofectamineTM3000说明书转染。配置转染试剂A液:3.75 μL LipofectamineTM 3000稀释在125 μL Opti-MEM中;B液:5 μL P3000TM、pCMVInt(1.5 μg)、pMD18-T-EGFP(1.5 μg)和pLVX-DsRed2(1.5 μg)稀释在125 μL Opti-MEM中。然后,将B液加入A液吹打混匀,室温静置15 min,逐滴加入细胞培养皿,并轻柔晃动培养板使之均匀。阴性对照组不添加pCMVInt质粒。20 h后更换新鲜DMEM培养基,48 h后用荧光显微镜观察绿色荧光的表达。
在上述试验取得预期结果后,在细胞水平上进一步验证PhiC31蛋白生物活性。将1×106个DF-1细胞接种至6 cm培养皿,待细胞达到80%的汇合度。吸去培养液并用PBS洗涤后,使用0.25%胰蛋白酶-EDTA离散DF-1细胞,以1 000×g离心5 min,再用PBS重悬细胞沉淀。将1×106个DF-1细胞悬液转移至新离心管中,1 000×g离心5 min。细胞沉淀用200 μL Opti-MEM重悬,加入1 μg pLVX-DsRed2质粒,轻轻吹打混匀后转移至2 mm电极杯中进行电穿孔。电穿孔参数是电压190 V,1个电脉冲,持续时间为3 ms。电穿孔后室温孵育20 min,再将细胞转移至六孔板中进行培养。培养24 h后,再收集细胞,以Opti-MEM制备细胞悬液,添加1 μg pMD18-T-EGFP和3 μg PhiC31整合酶蛋白,再次进行电穿孔,电穿孔参数同上。细胞继续培养48 h,荧光显微镜观察绿色荧光表达。
2 结果 2.1 载体构建及融合蛋白表达将PCR扩增产生的PhiC31片段连接pMD18-T载体,重组质粒经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切获得了预期大小DNA片段(1.8 kb)(图 1A、B)。从pMD18-T-PhiC31截取的PhiC31片段亚克隆至pET-28a-SUMO载体,成功构建了pET-28a-SUMO-PhiC31,因为重组质粒经双酶切鉴定均获得了预期结果(图 1C)。PCR扩增得到的attBTT-EGFP-HiBiT-attBCT片段(0.8 kb)TA克隆至pMD18-T载体,重组质粒经双酶切鉴定(图 2),证明无启动子pMD18-T-EGFP载体构建成功。
如图 3A所示,pET-28a-SUMO-PhiC31转化大肠杆菌BL21,分别于37 ℃和16 ℃条件下,IPTG诱导SUMO-His-PhiC31融合蛋白表达。SDS-PAGE分析表明,16 ℃适宜于该融合蛋白的诱导表达;SUMO-His-PhiC31主要以可溶性形式高效表达(图 3B)。
如图 3C所示,用HisTALON重力柱纯化获得的SUMO-His-PhiC31融合蛋白,经过浓缩产量达到12 mg·L-1,蛋白分子量与预期大小一致(大约82 ku)。将纯化的SUMO-His-PhiC31与SUMO蛋白酶共孵育,SDS-PAGE显示PhiC31蛋白和SUMO-His标签成功分离,SUMO蛋白酶切割效率超过90%(图 4A)。为了获得不含SUMO-His标签的PhiC31蛋白,本研究尝试了一步法纯化途径。洗脱杂蛋白后,将含有SUMO酶的缓冲液加入纯化柱,孵育过夜,使SUMO-His融合标签与PhiC31蛋白分离。SDS-PAGE显示,从流穿液样品中看到了大约67 ku的PhiC31蛋白条带,其纯度超过90%(图 4B)。该流穿液,经30k MWCO的蛋白浓缩柱浓缩、脱盐处理,共获得1 mg PhiC31蛋白。
报告质粒pBCPB+含有attB和attP两个位点,具有生物活性的PhiC31整合酶可以介导分子内重组反应,产生两个新的环状质粒pB-attL(3 351 bp)和pB-attR(3 870 bp)(图 5A)。将SUMO-His-PhiC31融合蛋白和切除SUMO-His标签的PhiC31蛋白分别与pBCPB+质粒共孵育诱导分子内重组反应。如图 5B所示,重组产物经1%琼脂糖凝胶电泳,两种PhiC31蛋白均可诱发分子内attP与attB之间的重组反应,形成了约3.3和3.8 kb片段,而阴性对照组则显示了1个约7 kb条带,这与预期结果相一致。以重组反应产物为模板,利用引物attL-F/R PCR扩增重组attL片段,得到约0.4 kb的条带,阴性对照组则得到约0.75 kb的条带,这也与预期结果一致(图 5C)。由此证明,SUMO-His-PhiC31融合蛋白和PhiC31蛋白均保持了催化活性,经ImageJ分析,二者的重组效率为大致相等(50% vs. 52%)。
PhiC31整合酶介导attB与attP序列发生不可逆重组,形成attL和attR。按照本试验设想,PhiC31整合酶能介导侧翼带有attB位点的EGFP-HiBiT与侧翼带有attP位点的DsRed2发生置换,使EGFP-HiBiT基因表达,而DsRed2表达消失(图 6)。为了验证该置换系统的有效性,先采用脂质体转染方法,将PhiC31真核表达质粒pCMVInt与pMD18-T-EGFP和pLVX-DsRed2质粒共转染DF-1细胞,荧光显微镜观察证实了DsRed2-EGFP置换现象。但是,无论是pLVX-DsRed2和pCMVInt质粒共转染,还是pMD18-T-EGFP或pLVX-DsRed2单独转染都未发生这种置换现象(图 7)。由此证明本研究构建的双荧光置换系统有效。
随后通过电穿孔pLVX-DsRed2质粒转染DF-1细胞,使DsRed2表达。24 h后再次电穿孔转染pMD18-T-EGFP和PhiC31整合酶蛋白,48 h后EGFP阳性(EGFP+)细胞增多,DsRed2阳性(DsRed2+)减少乃至消失(图 8)。由此表明,PhiC31整合酶蛋白能够介导DsRed2-EGFP置换,该蛋白具有生物活性。
本研究利用原核表达技术获得了可溶性SUMO-His-PhiC31融合蛋白,产量达到12 mg·L-1。分子内重组反应验证了SUMO-His-PhiC31融合蛋白和移除SUMO-His标签的天然PhiC31蛋白都具有催化活性,重组效率大致相等(50% vs. 52%)。此外,电穿孔PhiC31蛋白在DF-1细胞中成功实现了DsRed2-EGFP荧光置换,也表明PhiC31蛋白具有生物活性。
利用原核表达系统能够快速获取目的蛋白,产量大、成本低[15-16]。但是,由于部分蛋白溶解性低,形成包涵体等原因,可通过加入融合标签来提高蛋白的溶解性[17]。如谷胱甘肽S-转移酶(GST)[18]、麦芽糖结合蛋白(MBP)[19]、触发因子(TF)[20]、泛素(SUMO)[21]等。其中SUMO标签是最为常用的,将SUMO标签融合蛋白N端,可增强原核和真核表达系统中功能性蛋白质的产生,显著改善蛋白质的稳定性和溶解度[22]。据此,构建了pET-28a-SUMO-PhiC31原核表达载体,实现了SUMO-His-PhiC31融合蛋白在BL21大肠杆菌中的可溶性表达。在16 ℃经IPTG诱导,该重组蛋白表达产量达12 mg·L-1。另外,SUMO蛋白酶能够识别SUMO的三级结构,水解甘氨酸(Gly-Gly)之间的肽键,以切除SUMO标签而获得天然蛋白[23],这也是本研究选择SUMO标签的一个重要原因。在本研究中,SUMO蛋白酶能够切除SUMO-His-PhiC31融合蛋白中的SUMO-His标签,切除效率达90%。Zhang等[24]利用SUMO蛋白酶切除与选择性诱导癌细胞凋亡(selective for apoptosis induction in cancer cells, SAC)蛋白融合的SUMO标签,切割效率超过95%。通过一步法纯化PhiC31蛋白,共获得1 mg蛋白,蛋白纯度超过90%。因此,采用一步法纯化天然PhiC31蛋白,可以在保证质量的前提下简化操作流程,提高目的蛋白产量。
PhiC31整合酶能特异性介导attB、attP位点之间的重组反应,产生两个新的杂合位点attL和attR。在本研究中,为了初步验证纯化后的SUMO-His-PhiC31融合蛋白和切除SUMO-His标签的天然PhiC31蛋白的功能活性,利用pBCPB+质粒进行分子内重组反应。凝胶电泳以及PCR扩增attL初步证明两种形式的PhiC31蛋白均具有生物活性,也说明融合SUMO-His标签不会影响PhiC31的蛋白活性,二者的重组效率无明显差异,这与Guha和Calos[14]、Sekhavati等[25]的研究结果相一致。
丝氨酸整合酶是丝氨酸位点特异性重组酶的一个亚家族[26]。迄今为止,已经鉴定出超过4 000种假定的丝氨酸整合酶[27],其中16种已经过生物化学研究得以认定[28],链霉菌噬菌体PhiC31和分枝杆菌噬菌体Bxb1是广泛应用的整合酶,二者识别各自的attP和attB位点,而不会发生交叉反应。单个PhiC31整合酶介导的RMCE,通常在报告基因/抗性基因两侧翼引入两个方向相反、序列相同的attP位点,利用TALENs、CRISPR/Cas9等基因编辑工具将该LP片段敲入基因组,再将PhiC31和两侧翼含有attB位点(方向相反)的目的基因导入宿主细胞或胚胎,完成RMCE。涉及果蝇[29]、杆状线虫[30-31]、猪[32]等动物的此类RMCE研究已有报道。但是,单一PhiC31介导的RMCE存在缺点,如非预期的载体骨架整合、donor基因盒被切割以及反向置入等问题[33-34]。双整合酶介导的基因盒交换(dual integrase cassette exchange, DICE)[35-36]可使目的基因精确插入预定位点,而且保持方向不变,规避了单一PhiC31介导的RMCE缺点。该方法就是在报告基因/抗性基因两侧翼分别引入PhiC31和Bxb1各自的attP位点,将该LP片段敲入宿主基因组指定位点,再将这两种整合酶与含有各自attB位点的目的基因donor质粒共转染宿主细胞或胚胎实现RMCE。但这种DICE的缺点是,需要PhiC31和Bxb1整合酶共同发挥作用才能达到目的。其实,能被丝氨酸整合酶所识别和切割的attP/attB位点,其中央核心序列不只有TT,还有CT、GT、CA、CC、TC[37],也就是说一种丝氨酸整合酶可以同时催化6对核心序列不同的attP/attB之间的整合反应,例如attPTT只能与attBTT发生整合反应,attPCT只能与attBCT发生整合反应,以此类推。因此,本研究仍然使用了单一PhiC31整合酶,在LP质粒的DsRed2基因两侧分别引入attPTT、attPCT位点,donor质粒的EGFP-HiBiT两侧分别引入attBTT、attBCT位点,PhiC31整合酶电穿孔DF-1细胞成功实现了DsRed2-EGFP基因盒交换(图 8),获得了与DICE同样的效果,进一步证明获得的PhiC31蛋白具有生物活性。这是本研究的创新之处。Low等[38]利用CRISPR/Cas9将attPGT、attPGA的序列敲入小鼠ROSA26位点,并通过显微注射Bxb1 mRNA和donor质粒至受精卵,其后代中转基因整合的综合效率为15%。这与本研究结果相似。
在CRISPR/Cas9基因编辑中,Cas9蛋白在37 ℃下进行基因编辑不仅能保持其功能活性,还能提高基因编辑的效率[39]。但本研究发现,PhiC31整合酶蛋白在37 ℃时整合效率仍有提升空间, 猜测可能的原因之一是温度对酶活性有影响。据文献报道,PhiC31整合酶的最适温度可能在30 ℃[40-41]。据Sumikawa等[42]报道,PhiC31整合酶蛋白在体外介导质粒重组中,随着温度的上升(30 ℃),整合酶活性逐渐降低,增加蛋白浓度仍未奏效。此外,该研究小组还发现,用人造锌指蛋白(AZP)将LP质粒与donor质粒相连接,整合酶的重组效率得到进一步提升。因此,可以推测,如果将本研究中的LP质粒与donor质粒相连接,将两个DNA片段同时递送至DF-1细胞,有可能提升整合效率。电穿孔的效率与电脉冲参数有关,如电压、持续时间和脉冲次数等[43]。参考Liu等[44]报道的HEK 293 T细胞电穿孔优化参数,本研究选择DF-1细胞的电穿孔参数为电压190 v,1个电脉冲,持续时间为3 ms,但未对其进行深入、系统的优化,未获得最适的电穿孔参数。这也可能是影响PhiC31整合效率的另一个因素。
依赖同源重组修复途径的CRISPR/HDR技术通常用双链DNA作为donor,在宿主细胞内同源重组效率过低(1~10%)。此外,在非分裂和慢分裂细胞中,几乎不发生同源重组[45]。Quadros等[46]和Miura等[45]将纯化的Cas9蛋白和sgRNA组装成RNP复合体,并结合长单链DNA(LssDNA)一起注射至小鼠胚胎,在出生后代中转基因敲入效率达到30%~60%,平均每注射50个胚胎就能获得一个正确敲入的转基因小鼠,而且在其后代中转基因检出率达100%。这种技术称为Easi-CRISPR(efficient additions with ssDNA inserts-CRISPR),其不仅能提高转基因敲入效率,还可以减少脱靶效应[47]。因此,利用TARGATT技术,即在转基因两侧翼分别引入核心序列不同的attP位点,应用高效的Easi-CRISPR技术将此LP片段整合至宿主基因组的安全位点,只需一种整合酶,使donor质粒中的目的基因片段替代LP片段,顺利实现体外(ex vivo)或体内(in vivo)RMCE,这可能是转基因动物研究的一种新策略。本试验获得的PhiC31蛋白将在这类研究中发挥重要作用。
家禽为人类日常生活提供禽蛋和禽肉,是动物性蛋白的重要来源。家禽也是发育生物学、免疫学和生物医学的研究模型。家禽转基因研究中遇到的瓶颈问题,就是将转基因整合至鸡基因组的哪些位点,以实现转基因表达沉默最小化和转基因表达最大化的问题还没有解决,还没有发现类似于哺乳动物Rosa26这样的基因组安全位点。本课题组借助PhiC31整合酶系统发掘了3个鸡基因组伪attP位点,并利用电穿孔介导的Easi-CRISPR-TARGATT技术将带有attPTT-DsRed2-attPCT片段的LssDNA导入鸡胚成纤维细胞DF-1,获得了表达DsRed2的单克隆细胞株,通过再次电穿孔将带有attBTT-EGFP-HiBiT-attBCT的donor质粒连同PhiC31蛋白导入上述单克隆细胞,实现了DsRed2-EGFP基因盒交换(未发表资料)。本研究获得的PhiC31蛋白已经得到了实际应用,效果良好。
4 结论本研究通过原核表达和蛋白纯化获得的天然PhiC31蛋白具有生物活性,有望成为一种重要试剂而用于电穿孔结合Easi-CRISPR-TARGATT生产转基因鸡的相关研究。
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(编辑 郭云雁)