肤色性状是鸡的重要经济性状。鸡的肤色主要分为白色、黄色和黑色3种颜色,其中白色和黄色是市场上鸡的主要肤色类型,而黑肤性状是乌骨鸡的重要特征之一[1]。乌骨鸡作为我国宝贵禽类品种资源,其富含蛋白质、氨基酸、矿物质、乌鸡肽和微量元素等有益成分,具有丰富的营养价值及药用价值,深受消费者青睐[2]。乌骨鸡的肤色深浅与皮肤组织内黑色素沉积程度有关,且黑色素含量的高低直接影响其药用价值。相比于浅色皮肤,具有深色皮肤的乌骨鸡有更好的营养价值和药用价值[3]。因此,对鸡的肤色性状进行选育和改良,提高乌骨鸡皮肤组织中的黑色素含量对于乌骨鸡产业具有重要的经济价值。
黑色素是皮肤组织中的天然色素分子,其生物合成发生在黑色素细胞的特殊细胞器黑素体中[4]。黑色素在机体内具有多种生理功能,包括延缓机体衰老,抗氧化和提高机体免疫力等,同时也是乌骨鸡体现其药用价值的最关键成分[5-6]。黑色素由酪氨酸经过一系列生化反应而生成,首先由酪氨酸酶(TYR)催化酪氨酸生成多巴(DOPA),再进一步氧化为多巴醌(DQ),DQ可通过转变为半胱氨酰多巴,进而生成伪黑色素,也可转变为多巴色素被多巴色素异构酶(DCT)催化,最终生成真黑色素[7]。黑色素的复杂生成过程受到许多调控因子(小眼畸形相关转录因子(MITF)、酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白-1(TYRP1)等)以及信号通路(黑皮质素受体1(MC1R)/α-黑素细胞刺激激素(α-MSH)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路、环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)信号通路等)的相互调控[8-11]。尽管对黑色素合成的主要调控机制已经有一些认识,但仍然存在很多问题有待阐明,如正常和疾病条件下黑色素产生的不同调控机制,黑色素与免疫间的调控关系等。本研究通过转录组和蛋白组联合分析来筛选调控乌骨鸡肤色性状相关的候选基因,为进一步研究黑色素调控机制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物及样本采集本试验动物采用杭州市农业科学研究院自主培育的HW1系黑羽乌骨鸡,该试验群体是由江西省地方品种东乡绿壳蛋鸡和浙江省地方品种江山乌骨鸡培育而成。具体选育路线如下:东乡绿壳蛋鸡(公)和江山乌骨鸡(母)以1∶6比例配种产生F1代个体,随后F1代自交产生F2代分离群体,经过连续加代扩群,稳定建系,逐步剔除杂羽个体,并开展生长性状和产蛋性能选育,最终育成HW1系黑羽乌骨鸡群体。在相同的遗传背景下,HW1系黑羽乌骨鸡群体中存在乌肤和白肤两种肤色,其中乌肤率约为70%。HW1群体饲养于杭州市农业科学研究院双江实验基地,饲养期间按程序接种疫苗,允许自由采食和饮水。本研究从HW1群体中选择体重等其他生产性状基本一致的6只白肤和6只乌肤健康个体分为两组作为试验样本。
试验个体于150日龄屠宰,屠宰前12 h内禁食、自由饮水。屠宰后,剔除试验个体胸部羽毛,用75%酒精消毒,采集胸部皮肤组织样,RNase-free水冲洗干净后于液氮中保存。随后,将每组中两个个体的皮肤组织等量混合为一个混合样本,共6个混合样本,即3个白肤组混合样本(white skin,WS)、3个乌肤组混合样本(black skin,BS),送至北京百迈客生物科技有限公司,进行转录组测序和蛋白组检测。
1.2 转录组测序和蛋白组检测使用Trizol法提取样本的总RNA,通过NanoDrop ND-2000(Agilent)对总RNA的纯度及浓度进行检测。将合格的RNA样品进行cDNA文库的构建,并在Illumina Novaseq 6000平台上进行双端测序。利用SeqPrep[12]软件对raw reads进行质控,TopHat2[13]软件将质控后的clean reads比对到鸡(Gallus gallus)的参考基因组上,Cufflinks[14]软件完成转录本的拼接、表达定量,获得原始的基因表达量数据。
使用总蛋白提取试剂盒和Bradford蛋白浓度测定试剂盒对样本进行蛋白的提取和浓度定量。利用同位素标记和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)技术标记肽段,在质谱仪中进行LC-MS/MS分析。
1.3 DEGs、DEPs筛选及功能富集分析使用R语言(version 4.1.2),通过R包DESeq2[15]对基因表达量数据进行标准化和差异分析,差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)筛选的阈值为矫正的P值(P_adjust) < 0.05和|log2Fold-Change|≥0.58。利用t检验对两组样本间蛋白表达量进行检验,差异表达蛋白(differentially expressed proteins, DEPs)筛选的阈值为P < 0.05和|log2Fold-Change|≥0.58。合并DEGs和DEPs,并通过在线网站DAVID[16]进行GO功能富集和KEGG信号通路分析,P < 0.05为显著富集的阈值。
1.4 荧光定量PCR验证随机选择出5个DEGs(CRP、EDN3、GPNMB、PRDM10、SPOUT1),使用GAPDH作为内参基因进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的验证。利用NCBI Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在线工具设计引物(表 1),引物由北京擎科生物科技有限公司合成。荧光定量PCR反应体系如下:上、下游引物各0.4 μL,cDNA模板4 μL,酶Mix 10 μL,ddH2O 5.2 μL;反应程序为:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性10 s,60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s,40个循环。采用2-ΔΔCt方法计算DEGs的相对mRNA表达量,并通过t检验进行统计分析。
利用在线数据库STRING[17]构建DEGs和DEPs的蛋白互作网络(protein-protein interaction network,PPI),并通过Cytoscape软件可视化,同时也对黑色素相关GO条目和通路中的候选基因构建PPI网络,进一步筛选黑色素相关的候选基因。利用cytoHubba[18]插件的10种算法(MCC、DMNC、MNC、Degree、EPC、BottleNeck、EcCentricity、Closeness、Radiality、Betweenness)计算出各算法中排名前30的基因,并将重叠次数排名前10的基因作为网络的Hub基因,最后将黑色素相关的候选基因和网络Hub基因合并构建PPI网络,并进行可视化与分析。
2 结果 2.1 DEGs、DEPs筛选原始转录组测序数据经过质控、比对和定量后,平均获得2.75×107条clean reads,平均注释效率为92.15%,最终获得19 272个基因的mRNA表达量。样本蛋白的质谱分析结果经过定量后获得3 253个基因的蛋白表达量。利用DESeq2包进行基因表达量差异分析,共鉴定出293个DEGs,其中有238个基因表达量上调,55个基因表达量下调。对两组样本的蛋白表达量进行t检验得到4个DEPs,其中3个基因的蛋白表达量上调,1个基因的蛋白表达量下调(图 1)。在DEGs和DEPs联合分析中,有3个基因(CRP、DCT、GPNMB)是重叠的,且这3个基因的mRNA和蛋白表达趋势也相同(表 2)。
对随机选择的5个DEGs进行RT-qPCR验证,如图 2所示,4个基因(CRP、EDN3、GPNMB、PRDM10)在BS组表达量上调,1个基因(SPOUT1)在BS组表达量下调,其表达量变化趋势与转录组测序结果一致。
将DEPs和DEGs进行合并,共有294个差异表达基因。通过在线网站DAVID进行GO功能富集和KEGG信号通路分析,获得71个显著的GO条目(49个生物学过程(biological process,BP),12个细胞组分(cellular component,CC),10个分子功能(molecular function,MF))和4个显著的KEGG通路(图 3)。显著的GO条目和KEGG通路主要与免疫系统相关(如免疫系统过程、炎症反应、免疫反应、Cytokine-cytokine受体相互作用等)。其中有4个GO条目(黑素细胞分化、肽基酪氨酸磷酸化的正向调节、黑素体和黑素体膜)和1个KEGG通路(黑素原生成通路)与黑色素生成相关,包括17个基因,分别为OCA2、EDN3、SOX10、PTPRC、HCLS1、PTK2B、CD3E、TFRC、DCT、MLANA、RAB38、RAB17、EDNRB2、PRKCB、CREB3L1、TCF7和ASIP(表 3)。然而DEGs和DEPs重叠基因中的CRP和GPNMB未富集到黑色素相关通路中,但由于CRP和GPNMB都与黑色素合成相关,因此在后续PPI网络构建中依然加入了CRP和GPNMB。
通过在线数据库STRING构建了DEGs和DEPs的蛋白互作网络,其中与黑色素通路相关的基因位于网络外围(图 4A)。将CRP、GPNMB以及黑色素相关通路中的基因一起构建PPI网络,结果显示DCT基因明显处于网络中心位置,表明DCT对乌骨鸡皮肤组织的黑色素沉积起关键作用,同时发现CREB3L1、RAB17和TCF7在网络中没有互作关系(图 4B),故不考虑CREB3L1、RAB17和TCF7作为乌骨鸡肤色性状的候选基因。随后基于cytoHubba插件中的10种算法,得到了PPI网络里的10个Hub基因(PTPRC、MYO1G、CCLI10、ITGB2、MPEG1、MYO1F、RAC2、VCAM1、ZAP70、GPR174)。将Hub基因、黑色素相关基因以及GPNMB和CRP相连,发现整个PPI网络可以划分成两个子网络。这两个子网络可通过PTPRC、SOX10、GPNMB、CRP基因相联系,表明这些基因也可能在黑色素合成中扮演重要作用(图 4C)。总之,共筛选得到11个黑色素相关的候选基因,包括SOX10、EDN3、EDNRB2、MLANA、OCA2、DCT、GPNMB、ASIP、RAB38、PTPRC、CRP。
HW1系黑羽乌骨鸡具有相同的遗传背景,生产性能等方面均匀度较高,群体的肤色性状保留了一定程度的表型分离,其中HW1系乌骨鸡群体的乌肤程度相比于东乡绿壳蛋鸡要深(亮度值低),比江山乌骨鸡要略浅(亮度值高)。本研究以此作为试验材料,旨在揭示调控乌骨鸡肤色性状的关键基因。本研究在WS组和BS组鉴定到了CRP、DCT和GPNMB基因的mRNA和蛋白均呈现显著的上调表达,其相同的表达模式表明CRP、DCT和GPNMB可能是直接影响乌骨鸡肤色性状的关键基因。DEGs和DEPs功能富集分析结果主要与免疫调控相关,同时PPI网络的10个Hub基因也主要富集在免疫相关的GO条目和通路中,包括负胸腺T细胞选择、阳性胸腺T细胞选择、先天免疫反应等生物学过程,这表明BS组和WS组间的差异表达基因大部分与免疫相关。研究表明, 黑色素具有免疫调节的功能,但其潜在的调控机制尚未完全阐明[19]。黑色素细胞被感染性法氏囊病毒(IBDV)感染后,其免疫基因如TLR3、TLR7、IL15、SLA2等会呈现较高的表达量,表明黑色素细胞可以发挥重要的先天免疫调节作用[20]。本研究发现, PTPRC基因既是整个蛋白互作网络的Hub基因,又是黑色素生成相关的候选基因(图 3C)。PTPRC基因编码C型蛋白酪氨酸磷酸酶受体(PTP),是一种由成熟白细胞表达的跨膜受体,在黑色素瘤转移和调节T细胞和B细胞的抗原受体信号中发挥重要作用[21-22]。有研究在对黑色素瘤差异表达基因分析中发现,以PTPRC基因为标准后,黑色素瘤相关的功能基因表达量上调两倍,表明PTPRC基因在黑色素瘤形成的过程发挥重要作用[23]。
在11个黑色素相关的候选基因中,有10个基因(SOX10、EDN3、EDNRB2、MLANA、OCA2、DCT、GPNMB、ASIP、RAB38、PTPRC)已报道在黑色素合成和沉积中起重要调控功能,其中SOX10为转录因子。SOX10(SRY-Box transcription factor 10)已被证实是在黑色素合成过程中发挥重要作用的调节因子,对多个黑色素合成相关基因(如MITF、TYRP1、TYRP2)的表达起调控作用[24]。Zhu等[25]发现,SOX10基因附近一个7.6 kb非编码缺失导致鸡的羽毛颜色从深红色变为浅黄色,而转基因小鼠中SOX10基因上游非编码区域的缺失也导致小鼠皮肤内的色素几乎完全缺失,这些结果表明SOX10在调节黑色素合成过程中起到了关键的调控作用[26]。本研究中,SOX10在乌骨鸡皮肤中的mRNA表达同样显著高于白皮肤组。研究发现,在缺少SOX10的情况下,MITF无法诱导酪氨酸酶的表达,从而抑制黑色素的产生[27]。而MITF是被报道在黑色素合成和沉积过程中起关键作用的转录因子,其下游靶基因包括多个黑色素合成调控基因(EDN3、EDNRB2、MLANA、OCA2、DCT、GPNMB)[8, 28]。内皮素3(EDN3)位于20号常染色体上纤维黑色素基因座(FM)的一段420 kb基因序列上,其能够与内皮素受体B亚型2(EDNRB2)特异结合促进黑色素细胞增殖[29-30]。MLANA基因编码黑色素A(melan A)也被称为T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MART-1),是一种与黑色素生成相关的单结构域跨膜蛋白,可与黑素体特异结构蛋白PMEL17形成复合体,促进黑色素体内部基质纤维的产生以及黑素体的成熟[31]。OCA2基因可编码一种黑色素体特异性跨膜蛋白,该蛋白可通过细胞内的阴离子通道来调节黑色素体内的pH,影响黑色素的合成与沉积[32]。Klaassen等[33]利用CRISPR基因组编辑技术对OCA2基因进行编辑形成突变体,结果发现突变体的黑色素合成降低并呈现出白化病,确定了OCA2基因在鱼类黑色素合成和沉积中起着重要作用。在对6种不同羽毛颜色的鸡羽毛毛囊进行转录组分析时,发现OCA2、GPNMB、SOX10等基因在黑白羽毛毛囊中都显著差异表达[34]。GPNMB基因编码的非转移性黑色素瘤糖蛋白B(GPNMB)与PMEL17蛋白高度同源,但在黑素体发育成熟过程中具有不同的生理作用[35]。研究表明,抑制GPNMB基因表达会降低黑素体中PEML17和TRP1的表达,从而影响黑色素的生成[36]。Wang等[37]发现,细胞外可溶性的GPNMB(sGPNMB)可保护黑色素细胞免受细胞毒性和氧化应激所诱导产生的黑色素生成损伤。本研究所筛选的候选基因中只有刺豚鼠毛色基因(ASIP)表达量下调,而ASIP蛋白可以与α-促黑素(α-MSH)竞争结合MC1R,导致MC1R诱发的级联反应阻断,下调TYP和MITF表达量,降低真黑色素的合成[38]。Yu等[39]在ASIP基因启动子区域新发现一个单核苷酸多态性(c.-1826A>T)与鸡肤色显著相关,同时该突变影响启动子活性,然而该研究中黑肤个体的ASIP基因要高于白肤个体,这与本研究不同。RAB38为Rab蛋白家族成员之一,该蛋白家族高度保守,且对细胞膜分泌和转运的调节起着至关重要的作用[40]。研究表明,RAB38负责将TYR、TYRP1和DCT从反面高尔基体网络结构(tran-golgi network, TGN)转运至黑色素体中,从而调控黑色素的合成[41]。Yu等[42]也通过mRNA表达谱和长链非编码RNA的综合分析,鉴定到RAB38作为影响鸡肤色的候选基因。
在11个候选基因中只有CRP未明确与黑色素合成或沉积直接相关,但在本研究中该基因在BS组和WS组中的mRNA表达量和蛋白质表达量都呈现显著的差异。CRP(C-反应蛋白)为一种常见的炎症标记物,其参与调控炎症因子的产生,如白细胞介素-6和肿瘤坏死因子(TNFα),而炎症因子在黑色素合成过程中也具有关键作用,CRP可能是在黑色素合成与免疫调控中起重要作用的关键基因[43]。周鑫[44]通过差异表达基因分析和功能分析,发现CRP和OCA2在3个日龄段时(1、10、20日龄)鸡胫组织中都显著差异表达,同时在PPI网络中CRP的下游基因正是OCA2基因,表明CRP可能是通过OCA2来参与黑色素生成调控的。
4 结论本研究通过结合转录组和蛋白组进行联合分析,筛选到11个与黑色素合成和沉积相关的候选基因(SOX10、EDN3、EDNRB2、MLANA、OCA2、DCT、GPNMB、ASIP、RAB38、PTPRC、CRP),为乌骨鸡肤色性状的分子育种提供参考,其中SOX10、PTPRC、GPNMB和CRP可能参与免疫系统的调控,为进一步揭示黑色素调控机制提供理论依据。
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(编辑 郭云雁)