丫杈猪原产于四川省古蔺县，属于中大型地方猪种，具有耐粗饲、适应性好、抗逆性强、性成熟早、肉质优异等优良特性，其背腰较平直，腹大不拖地，相比四川省其它地方猪种，生长速度更快、瘦肉率更高^[1]。在《中国畜禽遗传资源志-猪志》2011版中，丫杈猪作为湖川山地猪的一个重要类群被单独列出^[2]，并列入2012版《国家畜禽遗传资源品种名录》^[3]。丫杈猪已建立了保种资源场和备份场，并进行了细胞和精液的冷冻保存。同时，以丫杈猪作为专门化母本品系，培育了优质黑猪配套系，各项性能已达国家畜禽新品种(配套系)审定要求。

早期的分子标记主要有RFLP、RAPD、mtDNA、微卫星等，它们的共同缺点是检测密度和精度低。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)作为第三代分子标记，具有数量多、分布广、覆盖密度大、遗传稳定性好和易于检测等优势，被广泛应用于畜禽全基因组关联分析、群体遗传学分析、群体进化分析等领域^[4-12]。相较于基因组重测序，SNP芯片更为经济、高效，目前已有Illumina60K、Geneseek 50K/80K、KPSPorcine Breeding Chip v2(中芯一号)、液相50K芯片等成熟的商业化猪基因芯片，并被广泛应用于猪群体遗传结构和遗传多样性的分析评价^[13-18]。黄树文等^[19]利用Illumina60K和Geenseek 80K芯片分析了大花白猪、梅花猪、蓝塘猪、粤东黑猪、广东小花耳猪的遗传多样性、遗传结构及遗传距离，发现两广小耳花猪、大花白猪和蓝塘猪的遗传多样性较低。李晓等^[20]利用“中芯一号”芯片分析发现，里岔黑猪近交程度较高，需引入新的血缘并加强选配。莫家远等^[11]也通过“中芯一号”芯片研究发现，隆林猪可能已经受西方商业猪种血缘入侵，且东山猪中可能有陆川猪血统。袁娇等^[21]利用“中芯一号”芯片将通城猪保种群划分为10个家系。刘晨龙等^[22]发现，杭猪保种群公猪只有1个家系，母猪2个家系。杨祎挺等^[23]采用“中芯一号”芯片研究发现，伍隍猪与内江猪群体间的亲缘关系相对较远，是独立于内江猪外的一个群体。

受外种猪冲击和非洲猪瘟疫情影响，近两年丫杈猪数量减少近1/3，其保种工作受到严峻挑战，而且丫杈猪保种群的保种效果未知。鉴于此，本研究采用“中芯一号”SNP芯片对丫杈猪保种群遗传结构和多样性进行分析，评估其保种效果，为丫杈猪后续的保种和开发利用提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

在丫杈猪保种场采集丫杈猪耳组织样本166个，包含12头公猪和154头母猪。采集的耳组织样置于装有75%酒精的2 mL冻存管中，-20 ℃保存。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取与SNP分型 　　采用磁珠法提取DNA，首先用酒精消毒后的镊子从原始样本管夹出组织并用卫生纸吸干表面保护液，用消毒后的剪刀剪取大米粒大小的动物组织置于加入20 μL Proteinase K和300 μL Buffer WL的裂解管中，涡旋混匀振荡，将裂解管放入56 ℃恒温水浴锅裂解40 min，将裂解完成的裂解管放入离心机进行瞬时离心，转移上清液至96深孔板中，向96深孔板中加入相关试剂，然后用磁棒套进行磁珠吸附，最后将洗脱产物转移至1.5 mL收集管中低温保存。

提取好的DNA经紫外分光光度仪(NanoDrop2000)和凝胶电泳进行质量检测，检测合格后的DNA样本使用“中芯一号”芯片(北京康普森农业科技有限公司，北京)进行SNP基因分型。

1.2.2 芯片数据质控 　　利用Plink(V1.90)软件^[24]对SNP基因型数据进行质控，只使用常染色体上检出率≥90%、最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)＞0.01，哈迪-温伯格平衡检验P值≥0.000 001的SNPs位点，用于后续分析。

1.2.3 群体遗传多样性分析 　　采用Plink(V1.90)软件对质控后的数据进行分析，分别计算丫杈猪群体的最小等位基因频率(MAF)、期望杂合度(He)、观察杂合度(Ho)、多态信息含量(PIC)和多态性标记比例(P_N)。

其中多态性标记比例(P_N)指的是呈现多态性的标记位点在全部位点中的比例，计算公式为：

$ P_N=\frac{M}{N} $

其中，M为表现多态的位点数，N为总的位点数。

观察杂合度(Ho)是群体中某一位点是杂合子的个体数占总体的比值，期望杂合度(He)则是群体中任一个体的任一位点杂合的概率，其计算公式分别为：

$ H o=\frac{1}{N} \sum\limits_{k-1}^N \frac{H_k}{n} $

$ H e=\frac{2 n}{2 n-1 N} \frac{1}{N}\left(1-\sum P_{k i}^2\right) $

其中，n为群体的总个体数，N为总的位点数，H_k为位点k的杂合个体数，P_ki为位点k等位基因i的频率。

多态信息含量(PIC)是衡量基因变异程度高低、反映遗传信息多少的指标，其计算公式为：

$ P I C=1-\sum\limits_{i=1}^n P_i^2-\sum\limits_{i=1}^{n-1} \sum\limits_{j=i+1}^n 2 P i^2 P j^2 $

其中, Pi和Pj分别为第i个和第j个等位基因频率，n为等位基因数。

利用SNeP(V1.1)软件^[25]计算丫杈猪保种群有效群体含量(Ne)：

$ N e=(1 / 4 c) \times\left(1 / r^2-1\right) $

其中，r²为SNP位点间的连锁程度，c为SNP位点间的摩尔根距离，单位为cM。

1.2.4 群体亲缘关系分析 　　采用GCTA(V1.94)软件计算个体间的亲缘关系系数，构建G矩阵，并使用R脚本构建热图。亲缘关系系数计算公式如下：

$ G=\frac{\boldsymbol{Z} \boldsymbol{Z}^{\prime}}{2 \sum p_i\left(1-p_i\right)} $

其中，p_i是第i个等位基因的频率。

1.2.5 遗传距离分析 　　建立状态同源距离矩阵，使用R脚本构建热图，分析个体间遗传距离。两个个体间的遗传距离计算公式为：

$ D=1-D_{S T} $

其中，D_ST指两个个体在基因组水平上体现同态的概率，计算公式如下：

$ D_{S T}=\frac{0.5 \times I B S 1+I B S 2}{N} $

其中，IBS1指的是两个基因座有一个观测值相同的数量，IBS2指基因座观测值都相同的数量，N为标记位点的总数，IBS1和IBS2由Plink(V1.90)软件计算获得。

1.2.6 群体遗传结构分析 　　利用Mega X(V10.0)软件^[26]进行聚类分析，使用邻接法(Neighbor-Joining, NJ)，基于IBS遗传距离，对丫杈猪样本中的公猪以分子亲缘关系≥0.1为标准进行聚类，分析丫杈猪群体的家系结构。

1.2.7 群体近交系数分析 　　首先采用Plink(V1.90)软件(检测参数：-homozyg-window-snp 50，-homozyg-window-threshold 0.05，-homozyg-window-het 1，-homozyg-window-missing 1，-homozyg-snp 30，-homozyg-kb 1000，-homozyg-density 1000，-homozyg-gap 1000)计算得到每个样本的连续性纯合片段(runs of homozygosity，ROH)长度，统计每头丫杈猪ROH分布、长度和数目，然后通过计算个体中ROH片段的总长度占常染色体基因组总长的比例得到基于ROH的近交系数，公式如下：

$ F_{R O H}=\sum\limits_{i=1}^N \frac{F_{R O H i}}{N} $

其中，F_ROHi是第i个个体的近交系数值，N是总个体数。

2 结果 2.1 群体基因组DNA的SNP分型及质控

SNP分型和质控结果见表 1，共检测到45 211个SNPs位点，通过质量控制的SNP数量为36 243个，在染色体上的分布情况如图 1所示，1号染色体的SNP数目最多，为4 362个，18号染色体的SNP数目最少，为866个。

2.2 群体遗传多样性分析

群体遗传多样性分析结果见表 2。丫杈猪有效群体含量(Ne)为8.8头，多态性信息含量0.254，多态性标记比例为0.875；有效等位基因数为1.529，最小等位基因频率为0.233；期望杂合度为0.329，观察杂合度为0.344，观察杂合度稍高于期望杂合度。

2.3 基于IBS距离矩阵和G矩阵的亲缘关系分析

状态同源(identical by state, IBS)指两个个体在同一基因座的观察值是相同的概率，IBS只考虑个体之间的遗传标记或等位基因的相似性，因此在不清楚群体系谱或没有祖代样本的情况下，仍能对群体的亲缘关系进行分析。基于IBS距离矩阵亲缘关系分析结果显示(图 2)，丫杈猪群体的IBS距离值在0.107 3~0.335 8之间，平均遗传距离为0.259 5±0.028 8，表明丫杈猪个体之间的平均遗传距离较远，且差异较大。利用SNP位点构建基因组关系G矩阵进一步分析结果显示(图 3)，大部分丫杈猪个体呈中等程度的亲缘关系，部分个体间的亲缘关系较近。

2.4 群体家系结构分析

丫杈猪保种群的12头种公猪按人工系谱记录分为8个家系，鉴于公猪对于整个保种群体的重要性，以公猪间分子亲缘关系大于等于0.1为标准进行聚类，采用Mega X(V10.0)软件绘制了12头种公猪的群体进化树，进化树图中用同一种颜色标注的样本被评估为同一个家系(图 4)。结果发现，12头种公猪仍被分为8个家系(表 3)，但原属于家系4的20200297被归入到家系5，原属于家系7的20200437被归入到家系8。

2.5 群体近交程度分析

基因组上纯合片段(ROH)分析结果显示，在166头丫杈猪中检测到3 226个ROH片段。1号染色体上的ROH数量最多，为363个，17号染色体上的ROH数量最少，为78个(图 5)。丫杈猪个体含有的ROH数量为5~81个，平均为(19.43±9.05)个，其中含有16~20个ROH的个体数量最多(图 6)。丫杈猪个体ROH的总长度为(17.67~876.45)Mb，平均ROH长度为(178.01±140.50)Mb，ROH总长度在0~100 Mb之间的个体最多，有68个，占40.96%(图 7)。通过对群体中每个个体的ROH进行统计，得到每个个体基于ROH的近交系数值，计算出该群体平均近交系数为0.069。

3 讨论

有效群体含量(Ne)是与实际群体具有相同的基因频率方差或相同近交系数增量(杂合度衰减率)的理想群体含量^[27]，通常是基于群体的连锁不平衡(LD)水平估算得来的^{[25, 28]}。若一个自然群体的有效群体含量过小，说明这个群体在进化过程中可能很少受到迁移、杂交等，进而使得群体的遗传变异较小^[29]。PIC是指某一标记在群体中出现多态性的频率，可以用来评估群体的遗传多样性。本研究发现，丫杈猪保种群的有效群体含量为8.8头，较近年来报道的里岔黑猪^[20]、蓝塘猪、大花白猪、两广小耳花猪^[19]高，但低于通城猪^[21]、凉山猪^[30]、梅山猪^[27]、巴马香猪^[31]、撒坝猪^[17]和同属湖川山地猪的青峪猪^[32]；群体平均PIC为0.254，具有中等偏低程度的多态性；多态性标记比例为0.875，高于一些其他地方猪种如盆周山地猪^[33]、通城猪^[21]、内江猪^[23]、撒坝猪^[17]、青峪猪^[32]、马身猪^[34]等，但低于粤东黑猪^[31]、梅山猪^[27]等地方猪种。丫杈猪保种群自建立起就存在独立血缘数偏少的问题，母猪群体规模也较小，保持在100~120头，加之经过多年闭锁繁育，其群体遗传多样性和有效群体含量偏低，这也是我国大多数畜禽保种场都存在的问题^[32]。今后可利用SNP芯片技术寻找丫杈猪新血缘引入，或是创建新血缘，以扩大有效群体含量，提高群体遗传多样性。

ROH是个体内纯合基因型的连续片段，它是由于亲代将同源单倍型完整地传递给子代产生的，其长度和频率可以反映群体历史^[35]，根据ROH片段可以对个体的近交系数进行有效评估^[36-37]。本研究中，丫杈猪个体基于ROH的近交系数主要在0.0~0.1范围内，群体平均近交系数为0.069，近交程度不严重。IBS遗传距离分析显示，丫杈猪群体的遗传距离在0.107 3~0.335 8之间，平均遗传距离为0.259 5±0.028 8，这与青峪猪相近，低于通城猪、马身猪和蓝塘猪，结合G矩阵分析结果，表明丫杈猪群体遗传距离适中，大部分丫杈猪个体呈中等程度的亲缘关系，但部分个体间的亲缘关系较近。因此，在今后保种过程中应制定科学的选配制度，注意控制群体近交增量。

期望杂合度(He)指的是群体中任一个体的任一位点杂合的概率，观察杂合度(Ho)指的是群体中某一位点是杂合子的个体数占总个体数的比例^[27]。当观察杂合度比期望杂合度低时，推测群体发生了选择或者近交；如果观察杂合度高于期望杂合度，则群体可能有少量外来血缘。本研究中，丫杈猪的观察杂合度稍高于期望杂合度，这与通城猪^[21]、青峪猪^[32]、马身猪^[34]、枣庄黑盖猪^[13]、杭猪^[22]和小梅山猪^[27]群体的研究结果相似，说明丫杈猪和这些地方猪群都出现了分化，或者含有少量外来血缘。

生产管理中耳牌丢失、记录错误等将导致传统系谱记录出现错误，地方猪组建保种群或引种时也可能存在种猪系谱不清楚的问题。采用全基因组SNP芯片技术构建种猪分子系谱更为准确，可以弥补传统系谱的缺陷，解决地方猪保种群血缘和家系划分的技术难题。本研究中，通过SNP芯片技术分析的丫杈猪保种群中种公猪的血缘数量与传统系谱一致，但有2头种公猪被划分到其它血缘，为保种场优化配种计划提供了科学依据。

4 结论

本研究使用SNP芯片分析了丫杈猪保种群的遗传多样性、个体间亲缘关系以及群体的家系结构和近交系数。结果表明, 丫杈猪保种群总体有效含量偏低，群体遗传多样性中等偏低，大部分个体呈中等程度的亲缘关系，近交程度不严重。后续可引入新血缘或创建新血缘，以扩大有效群体含量，提高群体遗传多样性，并加强选配，控制近交增量，以利于丫杈猪遗传资源保种和开发利用。