2. 反刍动物重大疫病农业农村部重点实验室(西部)，杨凌 712100
2. Key Laboratory of Major Ruminant Diseases of Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yangling 712100, China
小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的一种急性、高度传染性疾病。该病在小型反刍动物的发病率、死亡率高达90%以上，对养羊业造成严重的危害[1-2]。干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)是一类小型跨膜蛋白分子，是干扰素诱导跨膜蛋白家族(IFITMs)成员之一。大量研究表明，定位于内体膜上的IFITMs分子主要通过抑制病毒吸附，改变内体酸化效率，扰乱细胞内胆固醇平衡等机制抑制病毒在宿主细胞内的复制[3-9]。虽然IFITM3在抑制病毒复制中的作用已经被深入研究，但近年研究表明，IFITM3在病毒诱导Ⅰ型干扰素产生过程中发挥负调控作用并促进病毒复制[10]。此外，SARS-CoV-2刺突蛋白通过与内源性IFITMs相互作用，促进SARS-CoV-2对人肺细胞的感染水平[11]。
小反刍兽疫病毒作为有囊膜单股线性负链RNA病毒，IFITM3在PPRV感染中是否发挥作用尚不明确。本研究拟检测PPRV感染山羊子宫内膜上皮细胞(EECs)中IFITM3表达的变化，进一步构建IFITM3干扰RNA和过表达载体，探究IFITM3对PPRV复制水平的影响，对深入阐明PPRV致病机理及发掘防控新靶点具有重要的理论意义和应用价值。
1 材料与方法 1.1 病毒及细胞本试验中所用PPRV标准疫苗弱毒株N75-1株为本实验室保存；非洲绿猴肾细胞(Vero)由本实验室保存传代；山羊子宫内膜上皮细胞(EECs)由西北农林科技大学动物医学院靳亚平教授馈赠，并由本实验室传代保存。
1.2 主要试剂DMEM/F-12购自美国Hyclone公司；胎牛血清、青霉素/链霉素双抗溶液和Opti-MEM培养基为美国Gibco公司产品；胰蛋白酶为上海闪晶生物公司产品；RIPA蛋白裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂和5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲溶液均为北京索莱宝科技有限公司产品；QuickCutTM Xho Ⅰ限制酶、QuickCutTM Hind Ⅲ限制酶、T4DNA连接酶购自北京宝日医生物技术有限公司；pcDNATM3.1(+)和DH5α大肠杆菌由本实验室保存；Trizol试剂购自大连宝生物公司产品；PPRV-N鼠单抗由中国动物卫生与流行病学中心惠赠；IFITM3单克隆抗体购自武汉三鹰生物技术公司；β-actin抗体购自博奥森生物公司；HRP标记山羊抗兔IgG、HRP标记山羊抗鼠IgG抗体和反转录试剂均购自北京全式金生物技术公司；琼脂糖(Agarose)购自HydraGene公司；无内毒素质粒小提中量试剂盒购自TIANGEN生物有限公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；Turbofect转染试剂购自美国Thermo公司；ECL发光液试剂盒购自上海博迅实业有限公司。
1.3 病毒感染取生长状态良好的山羊EECs，用胰酶消化，在10%DME/F-12培养液中重悬细胞，进行细胞计数，调整细胞浓度至1×105·mL-1，于12孔板按1 mL·孔-1添加细胞悬液。培养24 h后，弃掉培养液用PBS清洗2次后，每孔加1 mL 2%的DME/F-12培养液，每孔感染PPRV(MOI=5)，于37 ℃孵育。
1.4 Western blot检测将收集样本用裂解液裂解后进行SDS-PAGE检测，然后将蛋白质电转至PVDF膜上，封闭液室温封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜5次，二抗孵育2 h, TBST洗膜5次，加入化学发光剂ECL，曝光获得相应条带，成像保存[12]。
1.5 TCID50检测将收集的细胞或上清冻融，经梯度稀释后(10-1、10-2……10-10)，分别加入96孔板中，每孔100 μL，每个梯度做8个重复。置细胞于37 ℃、5%CO2的培养箱中5~7 d，每天观察细胞病变情况，并用Reed-Muench法计算TCID50。
1.6 IFITM3小干扰RNA(siRNA)的构建及鉴定靶向IFITM3的siRNA(IFITM3siRNA)以及阴性对照siRNA(ContsiRNA)由生物工程(上海)有限公司直接合成。按照转染试剂Turbofect说明书，将siRNA溶液与5 μL siRNA+50 μL的Opti-MEM，混匀，室温放置5 min；将siRNA混合液加入Turbofect混合液中，混合，室温放置15 min；将混合液加入山羊EECs培养孔中并摇匀，同时转染NC-RNA作为对照组。于二氧化碳培养箱37 ℃培养24 h后，收取细胞蛋白样，通过Western blot检测蛋白表达水平。
1.7 IFITM3过表达载体的构建及鉴定根据NCBI上登录的山羊cDNA基因序列(KM236554.1)，利用Oligo软件设计含Hind Ⅲ、Xho Ⅰ酶切位点(表 1中下划线位置)的山羊IFITM3基因引物，并加上酶切位点，由生物工程(上海)有限公司合成，序列见表 1。
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表 1 IFITM3的引物序列 Table 1 Primer sequences of IFITM3 |
提取山羊EECs的mRNA，反转出IFITM3的cDNA，以cDNA为模板，进行RT-PCR扩增反应；将本实验室保存的含有pcDNA3.1(+)质粒的单克隆的DH5α菌液进行摇菌培养、平板培养挑取阳性菌置于LB液体培养基(Amp+)37 ℃摇床过夜扩增培养；参照TIANGEN生物公司的无内毒素质粒小提中量试剂盒提取质粒, 进行质粒浓度的测定, 做好标记，保存于-20 ℃；测质粒浓度和IFITM3的PCR产物浓度，用Hind Ⅲ和Xho Ⅰ内切酶37 ℃，酶切2 h左右，产物凝胶电泳检测并纯化回收；把酶切的IFITM3片段与pcDNA3.1(+)载体(IFITM3∶pcDNA3.1= 3∶1)置于16 ℃的水浴锅中连接过夜；将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定及酶切鉴定；将重组质粒pcDNA3.1-IFITM3转染至山羊EECs并培养24 h，用Western blot检测IFITM3蛋白表达水平。
1.8 敲降IFITM3表达对PPRV增殖水平的影响分别将靶向IFITM3的siRNA和对照siRNA转染至山羊EECs，培养24 h后，感染PPRV(MOI=5)，于感染后不同时间，收集细胞并提取细胞总蛋白，Western blot检测PPRV N蛋白表达水平。
1.9 过表达IFITM3对PPRV增殖水平的影响分别将pcDNA3.1-IFITM3和pcDNA3.1转染至山羊EECs，培养24 h后，感染PPRV(MOI=5)，于感染后不同时间，收集细胞并提取细胞总蛋白，Western blot检测PPRV N蛋白表达水平。
1.10 数据处理与统计每个试验重复3次，所有数据均采用t检验进行统计分析，数据用“x±s”表示，“*”表示差异显著(P < 0.05), “**”表示差异极显著(P < 0.01), “***”表示差异极显著(P < 0.001), “ns”表示差异不显著。
2 结果 2.1 PPRV感染山羊EECs中IFITM3表达变化将PPRV(MOI=5)感染山羊EECs后不同时间，通过Western blot检测细胞中IFITM3表达水平。结果表明：PPRV感染早期EECs中IFITM3表达水平呈先上升后下降趋势。相比于正常对照组(Mock组)，PPRV感染后1 h(hpi)，IFITM3的表达量极显著上调(P < 0.01)，至3~4 hpi，IFITM3的表达水平最大(P < 0.000 1)，随后逐渐降低并恢复至正常水平(图 1A、B)；PPRV N蛋白表达水平在感染早期呈持续缓慢增长，至24 hpi，PPRV N表达量显著增强(图 1A)。提示PPRV感染早期对宿主细胞中IFITM3表达水平具有显著调节作用。
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A. Western blot检测PPRV感染山羊EECs中IFITM3和PPRV N蛋白的表达；B. 灰度分析PPRV感染山羊EECs中IFITM3蛋白的表达。ns.差异不显著，**.P < 0.01，***.P < 0.001****.P < 0.000 1 A. Western blot was used to detect the expression of IFITM3 and PPRV N protein in the EECs of PPRV infected goats; B.Grayscale analysis of IFITM3 protein expression in EECs of PPRV infected goats. ns. No significant difference, **. P < 0.01, ***. P < 0.001 ****. P < 0.000 1 图 1 PPRV感染对山羊EECs中PPRV-N和IFITM3表达变化 Fig. 1 The effect of PPRV infection on the expression of PPRV-N and IFITM3 proteins in goat EECs |
基于PPRV感染早期对宿主细胞中IFITM3表达水平的调节作用，进一步检测了IFITM3敲降对PPRV感染早期复制水平的影响。分别将靶向IFITM3的siRNA(IFITM3 siRNA)以及对照siRNA(ContsiRNA)转染山羊EECs，于转染24 h后，将PPRV(MOI=5)感染不同处理组细胞后不同时间，通过Western blot以及TCID50法检测细胞中PPRV N蛋白和IFITM3的表达水平。同时设置未感染对照组。结果表明：转染IFITM3 siRNA未感染组细胞中IFITM3表达水平较转染ContsiRNA组中IFITM3蛋白表达量极显著下降(P < 0.01)，表明siRNA构建成功(图 2A)。在PPRV感染后0.5~6 h，敲降IFITM3组中PPRV复制水平均较对照siRNA转染组显著降低(图 2B~D、G、H)；在感染后12~24 h，敲降IFITM3组中PPRV复制水平较对照siRNA转染组差异不显著(图 2E~H)。
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A. 转染IFITM3 siRNA和Cont siRNA山羊EECs中IFITM3表达水平；B. 接毒0.5 h后IFITM3对病毒复制的影响；C.接毒1 h后IFITM3对病毒复制的影响；D.接毒6 h后IFITM3对病毒复制的影响；E. 接毒12 h后IFITM3对病毒复制的影响；F. 接毒24 h后IFITM3对病毒复制的影响；G、H.敲降IFITM3对PPRV感染后不同时间细胞中PPRV N蛋白Western blot检测灰度值分析(G)与细胞培养上清中病毒水平检测(H) A. Expression level of IFITM3 in goat EECs transfected with IFITM3 siRNA and Cont siRNA; B. Effect of IFITM3 on virus replication after 0.5 h of exposure; C. Effect of IFITM3 on virus replication after 1 hour of exposure; D. Effect of IFITM3 on virus replication after 6 hours of exposure; E. Effect of IFITM3 on virus replication after 12 hours of exposure; F. Effect of IFITM3 on virus replication after 24 hours of exposure; G, H. Western blot detection of PPRV N protein in cells at different time after PPRV infection by knockdown IFITM3 (G) and detection of virus level in cell culture supernatant (H) 图 2 敲降IFITM3对PPRV复制的影响 Fig. 2 The effect of knock down IFITM3 on PPRV replication levels |
为检测IFITM3过表达对PPRV复制的影响，分别将pcDNA3.1(+)-IFITM3和空白载体转染至山羊EECs，于转染24 h后，将PPRV(MOI=5)感染不同处理组细胞后不同时间，通过Western blot以及TCID50法检测细胞中PPRV N蛋白和IFITM3的表达水平。结果表明：与空载体对照组相比，IFITM3表达水平显著增强，表明IFITM3过表达载体在山羊EECs中表达成功(图 3A)。在PPRV感染后0.5~6 h，过表达IFITM3组中PPRV复制水平均较空载体对照组显著增强(图 3B~D、G、H)；在感染后12~24 h，过表达IFITM3组中PPRV复制水平较空载体对照组差异不显著(图 3E~H)。
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A. 转染pcDNA3.1(+)-IFITM3和空载体山羊EECs中IFITM3表达水平；B. 接毒0.5 h后IFITM3对病毒复制的影响；C. 接毒1 h后IFITM3对病毒复制的影响；D. 接毒6 h后IFITM3对病毒复制的影响；E. 接毒12 h后IFITM3对病毒复制的影响；F. 接毒24 h后IFITM3对病毒复制的影响；G、H.过表达IFITM3对PPRV感染后不同时间细胞中PPRV N蛋白Western blot检测灰度值分析(G)与细胞培养上清中病毒水平检测(H) A. The expression level of IFITM3 in the transfected pcDNA3.1 (+)-IFITM3 and the empty goat EECs; B. Effect of IFITM3 on virus replication after 0.5 h of exposure; C. Effect of IFITM3 on virus replication after 1 hour of exposure; D. Effect of IFITM3 on virus replication after 6 hours of exposure; E. Effect of IFITM3 on virus replication after 12 hours of exposure; F. Effect of IFITM3 on virus replication after 24 hours of exposure; G, H. Overexpression of IFITM3 to detect the gray value of PPRV N protein in cells at different time after PPRV infection by Western blot (G) and detection of virus level in cell culture supernatant (H) 图 3 过表达IFITM3对PPRV复制的影响 Fig. 3 The effect of over expression of IFITM3 on PPRV replication levels |
PPRV属于副黏病毒科，麻疹病毒属。基因组是负义的单链RNA，长度为16 548 bp[13-14]。PPRV基因组分别编码两种非结构蛋白(V、C)和六种结构蛋白，包括融合蛋白(F)和血凝素(H)蛋白，基质蛋白(M)，核蛋白(N)和与大(L)蛋白相关的形成聚合酶复合物的磷蛋白(P)[15]。病毒侵染细胞的第一步是病毒与宿主细胞结合并释放病毒粒子在细胞质内。PPRV通过H蛋白与宿主细胞的表面受体结合[16]。本实验室前期研究表明[17]，PPRV可以通过膜融进入宿主细胞，也可以通过膜穴样凹陷内吞等途径进入山羊EECs。目前，有关PPRV内化及在宿主细胞内体转运及其在病毒复制中的调节作用尚不明确。
干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)是一种可被病毒感染和干扰素(IFNs)诱导的限制性因子，它抑制许多病毒的进入和复制[10]。IFITM3主要定位于细胞晚期内体和溶酶体中，与内化的病毒颗粒融合并将病毒组分转运至溶酶体进行降解[18]。IFITM3早期被认为是宿主细胞天然抗病毒免疫分子。IFITM3可抑制多种包膜病毒，包括登革热病毒、西尼罗病毒、甲型流感病毒(IAV)、黄病毒、严重急性呼吸道综合征冠状病毒和水疱性口炎病毒(VSV)，这些病毒均通过内吞作用进入细胞[19-21]。研究表明，IFITM3抑制病毒增殖依赖于病毒内化的过程，其可以阻止IAV包膜蛋白介导的膜融合，限制IAV早期复制[5]。IFITM3还通过拮抗包膜糖蛋白来限制人类免疫缺陷病毒1 (HIV-1)的感染[22]。本研究通过构建IFITM3的小干扰RNA(siRNA)和过表达载体，探究IFITM3对PPRV复制的调控效应。结果表明，PPRV感染后1~12 h对山羊EECs中IFITM3表达水平具有显著调控作用。提示IFITM3对PPRV感染早期的病毒复制水平可能发挥一定的调控作用。基于siRNA干扰以及过表达IFITM3载体，成功构建了山羊EECs中IFITM3敲降以及过表达细胞，为后续研究奠定了试验基础。进一步研究表明，敲降IFITM3表达可以显著降低PPRV感染后0.5~6 h细胞中病毒复制水平，而过表达IFITM3则可以显著增加PPRV感染后0.5~6 h细胞中病毒复制水平，提示PPRV感染早期通过诱导宿主细胞中IFITM3表达，进而促进感染早期病毒复制水平。
PPRV感染宿主后造成机体免疫抑制是其致病的主要特征。本实验室及其他研究团队研究表明，PPRV可通过多种途径抑制感染宿主天然免疫水平，进而促进其感染与复制水平[23-27]。近年研究表明，IFITM3通过降解IRF3在PRRSV诱导Ⅰ型干扰素产生过程中发挥显著的负调控作用，进而达到促进病毒复制的作用[10]。此外，IFITM3在促进SARS-CoV-2入侵宿主细胞以及病毒传播等也发挥重要的作用[11, 28]。提示病毒利用IFITM3调控宿主细胞天然免疫反应并进而促进病毒增殖中发挥重要的作用。本研究中IFITM3对PPRV感染早期的促进病毒复制作用是否与IFITM3介导PPRV免疫抑制以及调控宿主细胞天然免疫反应发挥作用及机制有待进一步研究。
4 结论PPRV感染早期通过上调IFITM3表达水平，进而促进病毒在宿主细胞内的复制水平。
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(编辑 白永平)