2. 西昌学院动物科学学院，西昌 615013
, HAO Guiying2, ZHOU Yu1, TIAN Yan1, YANG Fusheng1, TANG Li1, YANG Guangyou1, XIE Yue1, HE Ran1, XU Jing1, GU Xiaobin1
2. School of Animal Science of Xichang University, Xichang 615013, China
痒螨病是由绵羊痒螨(Psoroptes ovis，P. ovis)寄生于多种家养动物和野生动物皮肤表面的常见外寄生虫病，患病动物以消瘦、瘙痒、结痂、脱毛和皮肤增厚等为主要症状，患病严重病例可终因消瘦而死亡[1]。该病具有高度传染性，可降低动物生产性能和增加饲养成本，严重损害动物福利，给家养动物养殖业带来严重的经济损失，同时威胁野生动物的生存[2]。
P. ovis在宿主体表完成其整个生活史过程，其在皮肤表面寄生时摩擦表皮层，并分泌抗原分子引发皮肤损伤[1]。研究发现，P. ovis人工感染病例和临床感染病例皮损区均呈现以大量嗜酸性粒细胞(eosinophil，EOS)聚集为主要特征的病理变化[3-4]，且皮损区聚集的EOS数量与痒螨病严重程度以及宿主易感性有关[3, 5]；而皮损区内聚集的大量EOS及其聚集后引发的炎性效应可为P. ovis提供食物利于其生长和繁殖[6]，随P. ovis数量增多，病灶不断扩大，最终造成病程持续性发展。上述研究表明，皮肤中聚集的EOS在P. ovis感染致病中具有重要作用。另外，P. ovis虫体提取蛋白可引起注射部位皮肤大量的EOS聚集[7]，同时还可在体外促进EOS的迁移[8]。由此可见，P. ovis中含有可引起皮肤EOS聚集的抗原成分，但哪些P. ovis抗原分子可促进皮肤EOS聚集，尚未见相关研究报道。
精氨酸激酶(arginine kinase，AK)被验证是一种过敏原，广泛存在于家蚕、虾、屋尘螨等物种[9]。组学分析揭示，P. ovis整个生命周期阶段中均有AK基因的表达，且表达量较高[10]，本课题组前期发现P. ovis的不同发育阶段均有AK基因的表达，同时发现P. ovis的AK(PsoAK)可作为痒螨病的血清学诊断抗原，除此外尚未见其他研究报道。氨基酸同源性分析发现，PsoAK与屋尘螨的AK具有82.48%的相似性[11]，而屋尘螨AK被证实可导致小鼠肺过敏性炎症并引起肺组织中大量的EOS聚集[12]，故推测PsoAK也有类似引起EOS聚集的作用。P. ovis终生寄生于宿主皮肤表面且不穿透表皮的角质层，因此表皮中的主要构成细胞——角质形成细胞是P. ovis与宿主接触的重要靶细胞[1]，且这类细胞具有表达和分泌细胞因子与趋化因子的功能，促进白细胞迁移至皮肤[13]；而人永生化角质形成细胞系(HaCaT)常作为研究角质形成细胞的体外模型[14]。因此，本研究拟通过HaCaT和痒螨致敏兔分别为体外模型和体内模型探究PsoAK是否促进EOS聚集，为进一步了解痒螨病的发病机制奠定理论基础。
1 材料与方法 1.1 所用细胞及动物HaCaT细胞购自浙江美森细胞科技有限公司，在含有1%青霉素-链霉素和10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，并置于5% CO2、37 ℃恒温二氧化碳培养箱中进行培养。
痒螨病患兔来源于四川省成都市具有痒螨病流行史的某兔场，取兔外耳道内结痂经实验室镜检到P. ovis虫体，此类兔即确定为痒螨病患兔。动物试验方案经四川农业大学动物实验伦理委员会(许可证号SYXK(川)2019-187)批准。
含pET32a-PsoAK重组质粒的BL21(DE3)感受态细胞由四川农业大学动物寄生虫病中心提供。
1.2 主要材料BL21(DE3)感受态细胞购自北京金沙生物科技有限公司，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、SDS-PAGE试剂盒、氨苄青霉素(Amp)和青霉素-链霉素购自北京索莱宝生物科技有限公司，LB培养基购自青岛海博生物技术有限公司，HiTrap Streptavidin HP纯化柱和DMEM高糖培养基购自美国Cytiva公司，透析袋购自美国Millipore公司，Endotoxin Removal Beads试剂盒购自常州天地人和生物有限公司，CCK-8试剂盒购自大连美仑生物技术有限公司，胎牛血清购自Newzerum公司，细胞总RNA提取试剂盒、动物组织总RNA提取试剂盒、RT EasyTMⅡ反转录试剂盒和Real Time PCR EasyTM-SYBR Green Ⅰ均购于成都福际生物技术有限公司。
1.3 rPsoAK的表达、纯化与内毒素去除按照课题组Gu等[11]建立的方法表达和纯化rPsoAK。取-80 ℃保种的含pET32a-PsoAK重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)复苏后扩大培养，加入终浓度为0.5 mmol·L-1 IPTG于16 ℃诱导7 h，收集菌液离心，沉淀中加入适量0.05 mmol·L-1 Tris-HCl重悬，经超声破碎仪处理后离心收集上清，经HiTrap Streptavidin HP纯化柱纯化蛋白，经超滤管超滤浓缩后用10% SDS-PAGE凝胶检测，最后经Endotoxin Removal Beads试剂盒去除内毒素获得rPsoAK蛋白，备用。
1.4 CCK-8法检测rPsoAK对HaCaT细胞活性的影响使用CCK-8试剂盒检测rPsoAK对HaCaT细胞活性的影响。以5×103·mL-1 HaCaT细胞的密度接种于96孔细胞培养板，放置于37 ℃、5%CO2的条件下培养至细胞融合80%以上，每孔加入终浓度为0.1、1、10 μg·mL-1 rPsoAK蛋白刺激24 h(每组设置3个生物学重复)，同时设置培养基作为对照组。刺激后各孔加入10 μL CCK-8试剂，避光孵育1 h，使用酶标仪测量每孔在450 nm处的光密度值(OD450 nm)。
1.5 HaCaT细胞总RNA的提取和实时荧光定量PCR (qPCR)分析以5×103·mL-1 HaCaT细胞的密度接种于24孔细胞培养板，在37℃、5% CO2培养至细胞融合80%以上，每孔加入“1.4”中筛选出的最佳浓度的rPsoAK蛋白刺激24 h，收集细胞。设置培养基空白对照组和pET32a空载蛋白(与刺激蛋白同浓度)为对照组。使用细胞总RNA提取试剂盒提取收集细胞的总RNA，并用RT EasyTM Ⅱ反转录合成cDNA。根据GenBank中的相应基因序列，利于用Primer Premier 5.0设计YWHAZ、TSLP、IL-25、IL-33、IL-4、IL-5、IL-13、CCL5、CCL11的引物(表 1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中，YWHAZ为内参基因[15]，并通过qPCR检测上述基因mRNA的相对转录水平。反应体系(20 μL)：EasyTM-SYBR Green Ⅰ 10 μL，cDNA 2 μL，DNA-free ddH2O 6.4 μL，上下游引物各0.8 μL。扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，40个循环；95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 1 s得到熔解曲线。
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表 1 用于HaCaT细胞实时定量PCR的引物信息 Table 1 Primer sequence used for quantitative real-time PCR in HaCaT |
参考Shen等[16]的方法建立痒螨致敏兔模型。自然感染痒螨病较为严重的患兔(n=3)皮下注射0.1 mL·kg-1伊维菌素，治疗后1个月兔治愈，此类兔即为致敏兔。试验前1 d用剃毛器剃去致敏兔背部的毛，每只致敏兔用标记笔在剃毛后的部位标记3个注射部位(点之间间隔>3 cm)，每个注射点分别注射100 μL PBS、pET-32a载体蛋白(1 mg·mL-1)或rPsoAK(1 mg·mL-1)。注射后12 h安乐死处死致敏兔，用直径为8 mm的环形皮肤采样器以注射点为中心采集皮肤样本(去除皮下脂肪)，将样品一分为二，一部分样品保存于4%多聚甲醛固定液中，用于后续的嗜酸性粒细胞计数，另一部分样品保存于液氮中用于后续qPCR检测。
1.7 兔皮肤中嗜酸性粒细胞的计数将“1.6”多聚甲醛中保存的兔皮肤样品经石蜡包埋后中，切成6 mm的切片，经脱蜡、脱水处理后，参照Song等[17]的方法进行嗜酸性粒细胞特殊染色(变色酸2R染色)和计数，切片封片后，用奥林巴斯数字病理扫描仪VS120-S6-W(奥林巴斯，德国)扫描切片，使用Image-Pro Plus软件对每张切片的至少7个视野中计数嗜酸性粒细胞。
1.8 兔皮肤总RNA提取和qPCR分析使用动物组织总RNA提取试剂盒提取“1.6”液氮中保存的兔皮肤样品的总RNA，并经RT EasyTM Ⅱ反转录试剂盒合成cDNA。根据GenBank中兔的相应基因序列，利用Primer Premier 5.0设计β-actin、TSLP、IL-25、IL-33、IL-4、IL-5、IL-13、CCL5、CCL11、IL-4 Receptor(IL-4R)的引物(表 2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中，β-actin为内参基因，并通过qPCR检测上述基因mRNA的相对转录水平。反应体系与扩增条件参照“1.5”。
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表 2 用于兔皮肤的实时定量PCR的引物信息 Table 2 Primer sequence used for quantitative real-time PCR of rabbit skin |
本试验涉及的qPCR试验均每组设置3个生物学重复，采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。数据表示为“平均数±标准误(x±sx)”，并使用GraphPad prism 8通过单因素方差分析(One-way ANOVA)进行检验显著性。P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著，无标注表示两两比较不显著。
2 结果 2.1 rPsoAK对HaCaT细胞活性的影响CCK-8结果显示，随着rPsoAK浓度的升高，HaCaT细胞活性下降。与培养基空白对照组(control)相比，0.1 μg·mL-1 rPsoAK组的细胞活性无显著差异(P＞0.05)，而1、10 μg·mL-1 rPsoAK组的细胞活性极显著下降(P＜0.01，P＜0.001)(图 1)，可见高浓度rPsoAK对HaCaT细胞有毒性作用。因此，试验选取无细胞毒性的0.1 μg·mL-1 rPsoAK用于后续试验。
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与对照组相比，**. P＜0.01，***. P＜0.001 Compared with control, **. P < 0.01, ***. P < 0.001 图 1 rPsoAK对HaCaT细胞活性的影响 Fig. 1 Effects of rPsoAK on the cell viability of HaCaT |
以HaCaT细胞作为体外模型探究rPsoAK对EOS聚集相关因子mRNA水平的影响。qPCR结果显示，与培养基空白对照组(control)和pET32a载体对照组(vector)相比，0.1 μg·mL-1 rPsoAK可极显著上调上皮细胞衍生因子中IL-33 mRNA水平(P＜0.01)，而对TSLP和IL-25 mRNA水平无影响(P＞0.05)；0.1 μg·mL-1 rPsoAK可极显著上调Th2型细胞因子中IL-13 mRNA水平(P＜0.01)，而对Th2型细胞因子中的IL-4、IL-5 mRNA水平无影响(P＞0.05)；0.1 μg·mL-1 rPsoAK可极显著上调嗜酸性粒细胞趋化因子CCL5和CCL11 mRNA水平(P＜0.01)(图 2)。
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*.P < 0.05, **. P < 0.01 图 2 rPsoAK对HaCaT中与嗜酸性粒细胞聚集相关因子mRNA表达的影响 Fig. 2 Effects of rPsoAK on the mRNA relative expressions of eosinophil-related genes |
以痒螨病致敏兔为在体模型探究rPsoAK是否能诱导皮肤组织中EOS的聚集。qPCR结果显示，与PBS对照组和载体蛋白对照组(vector)相比，rPsoAK可以极显著促进兔皮肤内IL-4R和CCL5转录水平的增加(P＜0.01，P＜0.001，图 3)，对上皮细胞衍生因子TSLP、IL-25、IL-33和Th2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-13以及趋化因子CCL11的转录水平无显著影响(P＞0.05，图 3)；变色酸2R染色结果显示，与对照组相比，rPsoAK可引起兔皮肤真皮层中大量的EOS聚集，且聚集的EOS数量呈极显著增加(P＜0.01，图 4)。
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**. P < 0.01, ***.P < 0.001 图 3 rPsoAK对痒螨致敏兔皮肤中与嗜酸性粒细胞相关因子mRNA表达的影响 Fig. 3 Effects of rPsoAK on the mRNA relative expressions of eosinophil-related genes in P.ovis-sensitization rabbit skin |
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黑色箭头：嗜酸性粒细胞。扫描文章首页OSID可查看彩图。**.P＜0.01 Black arrow: eosinophils. The color picture can be found by scanning the OSID code on the front page of the article. **.P < 0.01 图 4 兔皮肤的病理组织学(变色酸2R染色，200×，400×) Fig. 4 Pathological histology of rabbit skin (Chromotrope 2R staining, 200×, 400×) |
痒螨病作为家养动物和野生动物的皮肤表面外寄生虫病，其病理学组织学变化以皮损区聚集大量的EOS为主要特征，但目前可引起皮损区EOS聚集的痒螨抗原成分仍不清楚。研究发现，过敏原可引起肺、皮肤等组织中大量EOS的异常聚集[18]，而组学分析发现P. ovis虫体中存在多种尘螨的过敏原同系物[10]，其中，AK基因已被证实在P. ovis的幼螨、若螨、成螨各阶段均有转录，且PsoAK基因的氨基酸序列与屋尘螨AK有高达82.48%的相似性[11]，因此本研究通过HaCaT细胞的离体模型和痒螨病致敏兔的在体模型来探究PsoAK在皮肤中EOS聚集的作用。本研究结果发现，PsoAK可诱导兔皮肤中EOS的大量聚集。
3.1 rPsoAK对组织中EOS聚集相关因子的影响嗜酸性粒细胞(EOS)在健康状态下不会出现于胃肠道黏膜之外的其他组织，但疾病状态下可选择性地异常聚集在身体的任何组织[19]。EOS起源于骨髓中嗜酸性粒细胞系祖细胞，并在骨髓中增殖、分化并发育为成熟EOS，这些成熟EOS从骨髓释放至外周血，经跨血管内皮从血管迁移至组织[20]。上述EOS从骨髓生成到迁移至组织的过程受到一系列因子的调控，其中，IL-5可调控EOS增殖、分化、迁移、激活和存活一系列过程[20]，但在本次离体试验和在体动物试验中均未检测到IL-5表达水平的显著增加(P＞0.05，图 2和3)，表明IL-5可能并不参与PsoAK所诱导的皮肤EOS聚集过程，而这种类似的结果在痒螨易感动物——比利时蓝牛感染P. ovis的皮肤中也得到证实，发现感染P. ovis的牛皮肤内聚集大量EOS，而皮肤中IL-5 mRNA无显著变化[5]。综上，作者推测IL-5并不直接参与P. ovis感染引起的局部皮肤EOS聚集。
EOS从骨髓产生到进入组织的过程涉及细胞黏附和趋化性共同作用。其中, IL-4和IL-13作为Th2型免疫反应的代表性细胞因子可以促进内皮细胞黏附因子的增加，从而使外周血中循环的EOS黏附到血管内皮，从而完成EOS跨血管内皮过程[21]。在本次离体HaCaT和在体动物试验上均未检测到IL-4的显著变化(P＞0.05)(图 2和3)，表明IL-4可能对PsoAK引起的皮肤EOS聚集中并不发挥重要作用；IL-13虽在离体HaCaT细胞中有极显著增加(P＜0.01)(图 2)，但在体动物试验中没有显著变化(P＞0.05)(图 3)，具体原因还有待进一步证实。研究发现，IL-4R参与寄生虫感染引起的EOS聚集过程[22]，而IL-13可与IL-4R结合促进EOS聚集。此次在体试验发现，PsoAK可引起皮肤内IL-4R mRNA转录水平极显著增加(P＜0.01)(图 3)，而角质形成细胞中增加表达的IL-13可能与IL-4R结合促进皮肤中EOS的聚集[23-24]。
除了Th2型细胞因子，EOS聚集到局部组织的过程还受上皮细胞衍生因子的影响，如胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、IL-25和IL-33的调控[25-26]。多数情况下这类因子通过促进细胞因子的释放间接促进EOS的聚集，比如IL-33可以刺激IL-13分泌从而促进小鼠食管EOS的聚集[27]。此外，它们也可以直接激活EOS并通过放大Th2免疫反应进一步促进EOS聚集。本次离体试验发现，rPsoAK可引起HaCaT细胞中IL-33 mRNA的显著增加(P＜0.01)，增加的IL-33不仅可以促进EOS的组织聚集，且还可直接靶向激活EOS，并调节其生物学、存活、活化和黏附[28-29]。EOS进入组织的趋化过程主要由EOS上的CCR3受体的配体介导，包括CCL5和CCL11，可强烈引导EOS至病变部位[21]。本次HaCaT离体试验和动物试验均发现，EOS趋化因子CCL5 mRNA极显著上调(P＜0.01)，而CCL11在在体动物中无显著变化(P＞0.05)，推测CCL5可能在PsoAK引起的皮肤EOS聚集中起重要作用，并非CCL11。
3.2 皮肤中聚集的EOS在P. ovis感染致病中的可能作用研究发现，痒螨病皮损区大量聚集EOS的区域呈现大量的P. ovis虫体聚集[30]，且从患痒螨病的绵羊结痂中分离获得的P. ovis肠道中发现EOS，表明EOS可能作为P. ovis的食物来源[1]，因此，rPsoAK引起的皮肤中大量聚集的EOS可能为P. ovis提供充足的食物来源，从而利于其在宿主体表的种群繁殖，繁殖的大量虫体引起更大范围的病变，从而利于痒螨病病程的发展。此外，这些皮肤中聚集的EOS被激活后脱颗粒，释放碱性蛋白(MBP)、阳离子蛋白(ECP)、细胞因子等炎性效应因子[3]，从而加重和维持皮肤局部炎症[31]，进一步营造利于P. ovis繁殖和生存的皮肤微环境；加之痒螨病皮损区的皮肤屏障被破坏，皮肤渗透性增加[32]，导致炎性部位的炎性液体和红细胞渗出增多，而这些物质可作为P. ovis的食物来源引起螨虫数量指数式增加[33-34]，随着P. ovis数量增多，小病灶变大，逐渐连成一片，并继续向周围健康部位扩散，最终造成病程持续性发展。
PsoAK引发的皮损区EOS聚集可为P. ovis提供大量食物来源[1, 34]，从而利于P. ovis的存活和繁殖，而类似的EOS利于寄生虫存活的现象在旋毛虫中亦得到证实，发现EOS可通过促进Th2细胞聚集和阻止巨噬细胞和中性粒细胞中iNOS的诱导来支持旋毛虫的生长和存活[35]，但也有得到相反结论的研究，发现EOS可黏附在捻转血矛线虫幼虫上经释放颗粒发挥杀虫作用[36]；由此可见，EOS对寄生虫的存活和杀灭具有“双重”作用。综上，PsoAK可促进皮肤中EOS的聚集，加重皮肤局部炎症，但皮肤中聚集的EOS以及EOS激活释放的颗粒蛋白等物质是利于P. ovis繁殖或P. ovis清除，从而导致的是痒螨病病程的恶化或好转仍需要进一步的研究。
4 结论rPsoAK能够促进HaCaT细胞中IL-13、IL-33、CCL5、CCL11和兔皮肤内IL-4R和CCL5 mRNA水平的显著增加，并诱导兔皮肤嗜酸性粒细胞的聚集，表明PsoAK是引发痒螨病皮损区嗜酸性粒细胞聚集的抗原成分，其参与了绵羊痒螨感染的致病过程。
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(编辑 白永平)