2. 新疆草食动物新药研究与创制重点实验室，乌鲁木齐 830052
, WU Huimin1, XU Qiqi1, CHEN Wanzhao1, WANG Dong1, LI Hongbo1, XIA Panpan1, LIU Zepeng1, XIA Lining1,2
2. Xinjiang Key Laboratory of New Drug Research and Innovation for Herbivorous Animals, Urumqi 830052, China
鼠伤寒沙门菌(Salmonella Typhimurium)是一种人畜共患的肠道病原菌[1]，其宿主广泛，包括人、家畜、家禽和其它小动物等。感染畜禽后，会引起胃肠炎症或败血症[2]，对养殖业造成严重的经济损失[3]，严重威胁人类健康。鼠伤寒沙门菌经口进入宿主后，会在肠道内繁殖，并破坏肠上皮屏障，然后转移到脾和肝，从而引发黏膜炎症[4]。当鼠伤寒沙门菌感染小鼠时，浓度为107 CFU·mL-1就可造成10.0%的小鼠死亡，浓度为108 CFU·mL-1就可造成30.0%的小鼠死亡[5]。目前，因为抗生素的广泛使用，导致耐药菌的出现从而增加感染性疾病的治疗难度，给疾病的预防和治疗带来了新挑战[6]。而肠道菌群与人类健康密切相关[7]，抗生素的过度使用会破坏肠道菌群的结构及功能，并使肠道中原有耐药菌大量繁殖以及产生新的耐药菌[8]。抗生素进入肠道后会诱使肠道敏感菌株靶位发生突变，从而产生耐药性，还会促使耐药基因在相同种属或不同种属细菌之间进行水平转移，导致耐药基因在肠道中进行传播[9]。耐药菌株一旦进入宿主可能会定植于肠道，破坏肠道菌群稳态，对宿主健康造成潜在风险[10]。而小鼠具有与人类基因同源性较高、适应性强、繁殖率高和遗传性状稳定等优势[11]，故选择小鼠作为本试验的研究模型。
本试验通过将浓度为106 CFU·mL-1外源MDR鼠伤寒沙门菌对健康小鼠进行灌胃试验，通过高通量测序技术对小鼠粪便菌群进行分析，从动物肠道菌群变化的角度探究外源MDR鼠伤寒沙门菌对肠道菌群组成的影响，以期为阻断耐药菌株在肠道中耐药性传递的危害研究提供基础数据。
1 材料与方法 1.1 实验动物和灌胃菌株1.1.1 实验动物 SPF级昆明种小鼠25只，6周龄，16~20 g，购自新疆医科大学动物实验中心。动物试验于新疆动物疾病预防控制中心实验室(编号：VL2017014)开展，实行光照/黑夜各12 h昼夜循环，自由进食及饮水。开展的小鼠试验通过新疆农业大学实验动物福利伦理委员会批准(批准号：2020018)。
1.1.2 菌株 灌胃菌株为携带耐药基因的猪源MDR鼠伤寒沙门菌(P102)(登录号：JAPMMA000000000)，由新疆农业大学动物医学学院药理实验室保存，灌胃和采样试验在新疆动物疾病预防控制中心实验室(编号：VL2017014)进行。
1.2 灌胃方案25只小鼠标准饲料喂养1周后，随机分别为质控组(C，目的是确保整个试验过程中无外源沙门菌污染，且起对照组的作用)、灌胃1 d组(G1)、灌胃3 d组(G2)、灌胃5 d组(G3)、灌胃7 d组(G4)，每组各5只，每只小鼠编号单笼饲喂。
灌胃菌经复苏后，用pH=7.4的PBS缓冲液将灌胃菌株稀释成106 CFU·mL-1，对试验小鼠根据体重每10 g给与0.1 mL(100 μL·g-1)的菌液剂量按照表 1进行灌胃。
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表 1 动物分组和灌胃方案 Table 1 Animal grouping and gavage scheme |
各试验组分别于灌胃前第0天和灌胃结束后第1~14天采集小鼠的新鲜粪便3~5粒，质控组整个试验期间每天采集新鲜粪便3~5粒，上述样品编号后分别装于干燥灭菌EP管中，并储存在-80 ℃的冰箱。
1.4 沙门菌的分离与鉴定收集的粪便取1粒加1 mL灭菌的营养肉汤(Mueller-Hinton，MH)后进行研磨，将研磨后的粪便充分振荡混匀。将原液取10 μL到MM肉汤中，37 ℃培养48 h后，在SS琼脂平皿上37 ℃培养18~24 h，培养基上长出中间黑色、边缘无色、湿润光滑的菌落，初步鉴定为沙门菌。对初步鉴定的沙门菌进行invA的PCR鉴定[12]。该基因的PCR产物大小为284 bp，PCR扩增产物经凝胶电泳后进行胶回收，送至上海生工生物有限公司进行测序，测序结果用BLAST进行序列比对，同源性大于96.0%的菌株判定是沙门菌。将分离出的1株沙门菌和灌胃原始菌株送至苏州金唯智生物科技有限公司Illumina Hiseq 2500平台进行二代全基因组测序(Next-Generation Sequencing，NGS)。
1.5 小鼠肠道菌群多样性分析将采集的各组小鼠粪便样本做好标记后，随机从每组5只小鼠中挑选3只小鼠灌胃前第0天和灌胃结束后第1、7、14天的小鼠粪便样本(共60份)送往上海派森诺有限公司进行测序。提取小鼠粪便样本的总DNA后，以F: 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和R: 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT -3′为引物，扩增16S rRNA基因V3~V4区，PCR扩增及高通量测序工作由上海派森诺有限公司按照标准流程运用Illumina平台完成。
对利用DADA测序使用QIIME2分析流程进行序列去噪、注释物种分类和构建系统发育树，对所有样本的全部有效片段以97.0%的一致性将序列聚类成为操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)。使用QIIME2分析软件及ggplot2包比较不同样本组之间的Alpha多样性差异，并通过Kruskal-Wallis秩和检验和dunn’test作为事后检验，验证差异的显著性；采用weighted UniFrac距离算法计算样本差异距离，通过主坐标分析(principal coordinates analysis，PCoA)方法将样本距离矩阵经过投影后，在低维度空间展示出来；通过对去除singleton后的特征表进行统计，在门、属分类水平上展示各样本的组成分布；使用Python LEfSe包和ggtree包通过LEfSe(LDA Effect Size)分析对所有分类水平进行差异分析，寻找各组之间的标志物种；使用PICRUSt2(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)进行样本间代谢通路差异分析。
1.6 统计学分析在派森诺基因云平台数据整理，初步整理后的数据通过SPSS26.0软件和GraphPad Prism 8软件进行独立样本T检验、One-way ANOVA和Adonis进行差异显著性检验和作图，以P＜0.05差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 鼠伤寒沙门菌感染试验小鼠的临床症状C组小鼠灌服pH=7.4的PBS缓冲液后，临床表现未见异常，粪便正常。各试验组小鼠灌服MDR鼠伤寒沙门菌后，临床表现为被毛杂乱，体重增长缓慢，腹泻，粪便未成形。
2.2 沙门菌的分离和鉴定结果灌胃前，共采集各组小鼠粪便样本25份，均未分离出沙门菌。采集各组小鼠灌胃后第1~14天的粪便样本，共计350份，从中分离出110株沙门菌(经PCR鉴定及测序分析)，其中，质控组从试验开始到结束均未分离出沙门菌。试验组小鼠沙门菌总体分离率为39.3%；G2组沙门菌分离率最高，为42.9%；G1组和G4组沙门菌分离率最低，均为37.1%(表 2)。
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表 2 灌胃后各组小鼠沙门菌的分离率 Table 2 Isolation rate of Salmonella in each group after intragastric administration |
从分离出的沙门菌菌株中选1株菌Q38和灌胃菌株P102经二代测序后，得到基因组序列后在基因组流行病学中心网站(http://www.genomicepidemiology.org)的ResFinder数据库上进行对比。结果显示，灌胃后分离出的沙门菌Q38与灌胃菌株P102为同一株菌(ST34)，共携带17种耐药基因，77种毒力因子及4个质粒复制子(表 3、4)。
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表 3 菌株耐药基因及毒力因子信息预测 Table 3 Prediction of drug resistance genes and virulence factors |
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表 4 菌株质粒复制子预测结果 Table 4 Results of plasmid replicon prediction of strains |
肠道菌群Alpha多样性指标有7种，其中，菌群丰富度表征主要有Chao1和Observed_species指数，菌群多样性的表征有Shannon和Simpson指数。对送测样本结果分析发现各试验组灌胃后第1、7天样本的比较差异不大，且图多杂乱。因此本文主要讨论各试验组与质控组小鼠在灌胃后第14天肠道菌群的变化。表 5为各组小鼠灌胃后第14天样本的Alpha多样性指数分析结果，由此表可知，与C组相比，G2、G3和G4组的Chao1指数、Goods_coverage指数和Observed_species指数均显著升高(P＜0.05)；其中，Chao1、Faith_pd、Observed_species和Shannon指数在G4组中最高，表明其菌群丰富度、多样性和遗传多样性较高。
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表 5 各组样品的Alpha多样性指数分析 Table 5 Analysis of Alpha diversity index of each group |
图 1为各组小鼠灌胃后第14天样本的Beta多样性比较结果，如图所示，各组小鼠肠道菌群组成多样性存在一定差异，各组小鼠肠道的PCoA1贡献率为38.9%，PCoA2贡献率为22.5%，C组与G1组、G3组相比Beta多样性存在显著差异(P＜0.05)；各试验组之间相比较，G3组与G4组之间Beta多样性存在显著差异(P＜0.05)。
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图 1 PCoA图 Fig. 1 PCoA graph number analysis |
2.6.1 肠道菌群物种群落分析 图 2为各组小鼠灌胃后第14天样本Venn比较结果，不同试验组与C组小鼠灌胃后肠道菌群共有336个OTUs，C组独有2 055个OTUs，G1组独有1 497个OTUs，G2组独有3 465个OTUs，G3组独有3 011个OTUs，G4组独有4 475个OTUs。
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图 2 各组灌胃后Venn图 Fig. 2 Venn diagram of each group after gavage |
2.6.2 肠道菌群门、属水平相对丰度差异比较 对各组灌胃后第14天的小鼠肠道菌群进行门水平分析，由图 3A可知，优势菌门主要为厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)，变形菌门(Epsilonbacteraeota)仅在G1组和C组小鼠肠道菌群中作为优势菌群，其相对丰度均大于10.0%。从图 4中变形菌门的相对丰度差异可知，其在G2组、G3组和G4组小鼠肠道菌群组成中低于C组小鼠，且差异显著(P＜0.05)。
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A为各组小鼠肠道菌群门水平相对丰度比较图；B为各组小鼠肠道菌群属水平相对丰度比较图 A is the relative abundance chart of intestinal flora phyla in each group; B shows the relative abundance of intestinal microbiota at genus level of mice in each group 图 3 各组小鼠肠道菌群物种水平相对丰度比较图 Fig. 3 Comparison of the relative abundance of gut microbiota species in each group |
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*表示差异显著，P＜0.05；**表示差异极显著，P＜0.01 * indicates significant difference, P < 0.05; ** indicates significant difference, P < 0.01 图 4 各组小鼠灌胃后肠道菌群差异比较图 Fig. 4 Comparison of differences in gut microbiota of mice in each group after gavage |
图 3B是对各组灌胃后第14天的小鼠菌群进行属水平分析，其中优势菌属主要是Muribaculaceae属、乳杆菌属(Lactobacillus)、毛螺菌科NK4A136群(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、螺杆菌属(Helicobacteraceae)、拟杆菌属(Bacteroides)和拟普雷沃菌属(Alloprevotella)。由图 4可知，G2组、G3组和G4组小鼠肠道菌群组成中螺杆菌属的相对丰度低于C组小鼠，且差异极显著(P＜0.01)。G1组小鼠肠道菌群组成中拟杆菌属的相对丰度低于C组小鼠，且差异极显著(P＜0.01)；其余试验组小鼠肠道菌群组成中拟杆菌属的相对丰度与C组差异不显著(P＞0.05)。
2.7 各组小鼠肠道菌群的LEfSe分析设定线性判别分析(linear discriminant analysis，LDA)阈值为4，利用线性判别分析效应大小(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)分析对各试验组与C组灌胃后第14天的小鼠肠道菌群中所有分类水平进行差异分析，从图 5中可以看出，G1组和C组相比，梭菌纲(Clostridia)、梭状芽胞杆菌目(Clostridiales)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、毛螺菌科NK4A136群、拟杆菌属、拟杆菌科(Bacteroides)和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)在C组显著富集；G2组、G3组和G4组与C组相比，变形菌门、螺杆菌科、弯曲杆菌纲(Campylobacteria)、弯曲杆菌目(Campylobacterales)和螺杆菌(Helicobacter)等均在C组中显著富集且丰度最高。
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a. G1组与C组比较；b. G2组与C组比较；c. G3组与C组比较；d. G4组与C组比较 a is comparison between group G1 and group C; b is the comparison between group G2 and group C; c is the comparison between group G3 and group C; d is the comparison between group G4 and group C 图 5 各试验组灌胃后与C组灌胃后之间LEfSe分析图 Fig. 5 LEfSe analysis diagram between experimental groups after gavage and group C after gavage |
通过MetaCyc代谢通路丰度预测由图 6可知，各试验组与C组灌胃后第14天的小鼠肠道菌群中有10条代谢通路存在差异。其中，糖原降解Ⅱ通路PWY-5941在G1组中低于C组(P＜0.1)；G2组中有5条通路显著高于C组(P＜0.01)；G3组中硫醇生物合成通路PWY1G-0极显著高于C组(P＜0.001)；G4组中有4条通路显著高于C组(P＜0.05)。
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a为G1组与C组比较；b为G2组与C组比较；c为G3组与C组比较；d为G4组与C组比较。图中横轴logFC [log2 (Fold change)]的正值代表上调组组相对对照组组上调，负值为下调；纵坐标为不同的pathway/group标签；以不同颜色展示显著性程度 a is comparison between group G1 and group C; b is the comparison between group G2 and group C; c is the comparison between group G3 and group C; d is the comparison between group G4 and group C.The positive value of the horizontal axis logFC[log2 (Fold change)] represents the control group with the negative value; the ordinate is different pathway/group labels; the significance is displayed in different colors 图 6 各试验组灌胃后与C组灌胃后之间代谢通路差异分析图 Fig. 6 Differences in metabolic pathways between experimental groups after gavage and group C after gavage |
鼠伤寒沙门菌作为人畜发病和食物源性污染的重要病原菌，通过入侵肠上皮细胞时释放促炎因子引发炎症反应，同时产生抗炎因子调节细胞内信号通路，与宿主共同繁殖并最终全身扩散而造成严重感染[13]。每年的感染数量大约占全世界沙门菌感染量的17.0%[14]，其造成的危害日益受到养殖业和食品业的重视[15]。本试验把浓度为106 CFU·mL-1的MDR鼠伤寒沙门菌对试验小鼠灌服不同天数后，研究其对试验小鼠肠道菌群中细菌群体的结构及多样性变化的影响。本试验设立质控组(灌胃pH=7.4的灭菌PBS缓冲液)是证明试验过程中试验动物未被外源沙门菌污染，同时也可作为空白对照，与各试验组之间比较感染MDR鼠伤寒沙门菌后小鼠肠道菌群的差异。试验过程中采集试验组灌胃前和质控组灌胃前后小鼠粪便进行沙门菌的分离，确保试验中未受外源沙门菌的污染，各试验组灌胃后每天采集粪便是为了掌握不同灌胃天数沙门菌在小鼠肠道中的定植情况，也为后续试验及后期筛选送测样品提供依据。本试验从灌胃后采集的粪便样本中共分离出110株沙门菌，选取其中1株菌(Q38)与灌胃菌株经二代测序结果比对，发现分离菌株与灌胃菌株为同一株MDR鼠伤寒沙门菌。从临床表现上发现灌服MDR鼠伤寒沙门菌的各组小鼠均表现为轻微腹泻。
肠道正常菌群作为肠道微生物系统的核心部分，外源菌的侵入造成肠道菌群的失衡，改变肠道菌群的组成和数量[16-17]，陈雪等[18]发现给新生仔猪连续5 d口服母源粪菌液后，结果在一定程度上增加了仔猪肠道微生物的多样性，但并不能持久影响仔猪肠道微生物定植。同样许格等[16]将人微生物移植到无菌小鼠肠道后菌群结构会发生剧烈变化，但之后恢复正常。在本研究中，各试验组之间相比，在菌群丰富度和多样性上G1组与G2组、G3组无显著差异，与G4组具有显著差异。与C组相比，除G1组其余各试验组小鼠肠道菌群中的物种数、丰富度和多样性均明显升高，其中，G4组的值最高，说明外源菌持续感染小鼠肠道改变了肠道菌群的组成和数量，使小鼠肠道中微生物结构发生了变化。
在门水平优势物种上，厚壁菌门和拟杆菌门是肠道内的优势有益菌[19-20]，其厚壁菌门/拟杆菌门的比值(F/B值)可用作评估肠道病理状况的生物学指标，二者比例的紊乱可能会导致代谢综合征[21]。而各试验组小鼠肠道菌群中F/B值变化趋势不大，与C组相比无明显差异。变形菌门作为在人或动物消化道中的共生菌[22-23]，在本试验中G2组、G3组和G4组的相对丰度明显降低，而G1组与C组差异不显著，说明外源菌持续的侵入可能会威胁肠道共生菌。在属水平优势物种上，各组小鼠肠道菌群中Muribaculaceae属、乳杆菌属、毛螺菌属NK4A136群、螺杆菌属和拟杆菌属为优势菌属。Muribaculaceae属大量存在于肠道中，对机体的健康起重要的作用。而当肠道微生物平衡被破坏时，它又是条件致病菌[24]。螺杆菌属在胃肠道中普遍存在的，不会产生典型的临床症状，但会对部分免疫缺陷的动物产生致病性[25]。通过LEfSe分析，作者发现变形菌门和螺杆菌属同样在C组小鼠肠道菌群显著富集。本试验中，发现G1组与G2组、G3组、G4组之间具有显著差异，而G2组、G3组和G4组之间无显著差异。与C组相比，G2、G3和G4组小鼠肠道菌群中变形菌门和拟杆菌属的相对丰度较低，与罗志宇等[26]的报道具有一致性。
本研究发现各试验组与C组小鼠在10条代谢通路有明显差异。糖原在体内起调节血糖平衡的作用[27]，机体处于饥饿状态时，糖原会在相关酶的作用下降解；但当与糖原代谢相关的酶缺乏时，会导致糖原贮积症[28]。精氨酸为碱性氨基酸是人体内必需的一种氨基酸，早期给胚蛋提供精氨酸可促使蛋雏鸡生长，同时加速早期肠道微生物区系的演变及有益菌的定植[29]。给试验组小鼠灌服鼠伤寒沙门菌后，不同试验组小鼠肠道菌群会发生不同程度的紊乱，而代谢通路会相互作用来调节肠道菌群平衡。综上所述，试验组小鼠和C组小鼠肠道菌群代谢通路存在变化，而这是否与鼠伤寒沙门菌的侵入有关，具体机制尚不清楚，还需进一步研究。
4 结论外源MDR鼠伤寒沙门菌的长时间侵入会增加小鼠肠道菌群的多样性和丰富度。C组、G1组与G2组、G3组、G4组相比，在肠道菌群组成结构中变形菌门、螺杆菌属和拟杆菌属存在显著差异，暗示灌胃外源沙门菌时间的长短会显著影响小鼠肠道菌群的组成。变形菌门、螺杆菌科、弯曲杆菌纲、弯曲杆菌目和螺杆菌属可能是G2组、G3组、G4组与C组小鼠肠道菌群中具有显著差异的标志性物种。G2组、G3组和G4组小鼠肠道菌群在硫醇生物合成、NAD生物合成Ⅱ等代谢通路潜在功能上显著上调，可能与试验小鼠灌服MDR鼠伤寒沙门菌有关，但由于肠道菌群本身的复杂性，菌群的自我调节及相关机制有待进一步研究。
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(编辑 白永平)