2. 北京麋鹿生态实验中心，北京 100076;
3. 北京市科学技术研究院创新发展战略研究所，北京 100083
, ZHONG Zhenyu2, BAI Jiade2, SHAN Yunfang2, CHENG Zhibin2, ZHANG Qingxun2, MENG Yuping3, DONG Yulan1, GUO Qingyun2
2. Beijing Milu Ecological Research Center, Beijing 100076, China;
3. Institute of Innovation Development Strategy, Beijing Academy of Science and Technology, Beijing 100083, China
革兰阳性厌氧菌产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens, C. perfringens)是人类和动物中最重要的病原体之一，在自然界中广泛分布[1]。这种细菌通过分泌毒素和酶产生毒性，进而引起不同形式的组织损伤，并且可以在各种脊椎动物中引起广泛的疾病。目前，产气荚膜梭菌由于其主要毒素(α-毒素、β-毒素、ε-毒素和ι-毒素、肠毒素和NetB)产生的不同，被分成A~G 7种类型[2]。一般来说，α毒素存在于所有菌株中，而A型主要产生α毒素。此外，B型和C型产气荚膜梭菌产生β毒素，D型产气荚膜梭菌产生ε毒素，E型产气荚膜梭菌产生ι毒素[3]。尽管产气荚膜梭菌通常作为肠道微生物群的一部分存在于肠道中，但在病理情况下，这种细菌可以异常增殖，随后释放毒素[4]。这些毒素或作用于局部，或被吸收到体循环中，对宿主造成严重影响。
在鹿的养殖生产过程中，产气荚膜梭菌病因其发病急、死亡率高的特点而被关注。据统计，养殖场鹿70%~80%的死亡是由产气荚膜梭菌引发的[5]，危害鹿生存的同时，也给鹿场带来了经济损失。产气荚膜梭菌感染后，细菌在鹿的肠道中扩散，导致急性毒血症，临床上的特征是腹泻、抽搐、瘫痪和突然死亡[6]，该病也被称为鹿肠毒血症。C型产气荚膜梭菌被确定为引起鹿出血性肠炎的主要菌株[7]。C型产气荚膜梭菌携带α毒素和β毒素，通过降解鹿体内大分子的蛋白质来保证产气荚膜梭菌的存活，以此来调控感染过程，并快速有效地从鹿体内获取营养[8]。α毒素本质为卵磷脂酶C，具有细胞毒性和溶血活性，能够促进血小板凝聚，增加血管渗透性。同时，α毒素具有鞘磷脂酶(sphingomyelinase)和磷脂酶C(phospholipase C, PLC)活性，能够水解鞘磷脂和磷脂酰胆碱[9]，从而水解细胞膜的主要成分——膜磷脂，破坏红细胞膜结构的完整性，导致细胞裂解[10]。研究表明，β毒素是C型产气荚膜梭菌感染的主要毒力因子[8]，分为β1和β2毒素。β1和β2毒素的致死性和细胞毒性均较强，尤其对胰蛋白酶和其他蛋白酶极为敏感。β2毒素与家畜的梭菌性胃肠道疾病密切相关，如牛、马、猪等[11-12]。为了对抗产气荚膜梭菌感染后的肠道急性损伤，鹿肠道首先快速地调动大量相关基因，响应产气荚膜梭菌感染以及肠道的状态恢复。因此，研究鹿肠道基因的表达调控方式是了解鹿肠毒血症的重要途径之一。
转录组广义上是指在特定条件下，生物体或细胞所有的RNA转录本总和，代表了表型与DNA编码信息之间的重要联系。转录组学是功能基因组学研究的重要组成部分，其研究对象是在整体水平的基因功能和基因结构，目的是揭示基因表达、转录调控规则以及特定生物学过程的分子机理[13]。由于基因表达与调控是一个高度动态的过程，这一过程能够帮助机体适应环境[14]。为了量化和描述生物体的全套转录本，高通量RNA测序提供了一种新的方法。在转录组范围内比较产气荚膜梭菌感染前后的鹿肠道差异基因，为解开产气荚膜梭菌和鹿肠毒血症之间的联系提供新的途径。然而，目前，对鹿感染产气荚膜梭菌引起肠毒血症的调控基因研究仍然不够充分。因此，本研究采用空肠结扎环模型来评估产气荚膜杆菌引起的炎症、肠道屏障破坏以及对毒力基因表达的变化，通过转录组分析系统探究产气荚膜梭菌感染鹿肠毒血症的致病途径，对保证鹿的健康生长和繁殖十分重要。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 C型产气荚膜梭菌菌株的分离培养 猪C型产气荚膜梭菌强毒株由中国兽医药品监察所赠予，在超净工作台内将菌株接种于液体硫乙醇酸盐(fluid thioglycollate, FTG)培养基(索莱宝公司)中，然后置于37 ℃的厌氧柜。
1.1.2 动物 动物试验是在中国农业大学实验动物福利和动物实验伦理审查委员会的批准下进行的。试验使用了1只2月龄的雄性黇鹿，由北京麋鹿生态实验中心提供。这只黇鹿没有感染过C型产气荚膜梭菌，而且鹿群中以往没有诊断出肠毒血症的病例。为了确定由C型产气荚膜梭菌引起的出血性肠炎，在试验的前1 d将试验用黇鹿单独饲养，并禁食禁水24 h。
1.2 方法1.2.1 C型产气荚膜梭菌毒素鉴定 将C型产气荚膜梭菌在胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂(TSC)平板上培养24 h，然后挑取单个菌落放入液体硫乙醇酸盐培养基(FTG)培养基中厌氧培养24 h。通过DNA试剂盒提取C型产气荚膜梭菌全DNA，设计引物进行PCR扩增。PCR体系为25 μL，包括8.5 μL蒸馏水，正反向引物各1 μL，12.5 μL mix和2 μL菌液。PCR循环参数：95 ℃预变性3 min，95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，35个循环，72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
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表 1 PCR引物 Table 1 PCR primers |
1.2.2 空肠结扎环模型的构建 用盐酸赛拉嗪注射液(华牧动物保健品有限公司)对黇鹿进行麻醉，随后经腹中线进行解剖，暴露小肠。对空肠进行结扎，两个结扎处中间的肠段为结扎环，每个结扎环约3 cm，并在两段结扎环之间留下一段等长肠道，重复3次。用生理盐水冲洗肠道，然后将1 mL FTG或C型产气荚膜梭菌培养物(对数生长期)等量注射到每个结扎环中。注射后，将腹壁切口与肌肉和皮肤分别缝合，以减少体温的损失，同时要保证在整个试验过程中对动物进行深度麻醉。接种7 h后，重新打开腹腔，按照接种的顺序取出小肠。最后，缝合腹壁切口，继续饲养动物。
1.2.3 样品采集 用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗肠道组织，肠道立即保存在-80 ℃。然后，将每个结扎环置于10%的福尔马林中进行组织学检查。
1.2.4 HE染色 组织在10%福尔马林溶液中固定24 h后取出，进行组织病理学分析。然后将肠道组织样本固定于石蜡中，并切成5 μm的片状。用苏木精和伊红染色试剂盒(北京兰博泰斯生物科技有限公司)对切片进行染色，并使用Aperio CS2扫描仪(徕卡显微系统(上海)贸易有限公司，德国)进行显微成像。
1.2.5 测序数据整理与分析 转录组测序由北京百迈克生物科技有限公司完成。样品经过RNA纯化后，基于边合成边测序(sequencing by synthesis，SBS)技术，使用Illumina NovaSeq高通量测序平台对cDNA文库进行测序，去除其中的接头序列及低质量Reads，获得高质量的Clean Data。将Clean Data进行序列组装，获得该物种的Unigene库。在百迈克云平台上以FDR＜0.05，Fold Change≥2作为筛选标准，确定感染产气荚膜梭菌的鹿肠道和正常肠道之间的差异表达基因，以log2(Fold change)为横坐标，以lg(False discovery rate)为纵坐标绘制差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)火山图。
1.2.6 差异表达基因功能分析 将筛选出来的DEGs，进行GO和KEGG富集分析，筛选P＜0.05的基因和信号通路，满足此条件为显著富集，接下来利用GO功能富集分析来明确DEGs和基因产物的功能属性，用KEGG系统分析筛选到的DEGs所参与主要的生物代谢途径及其功能。
1.2.7 qPCR验证结果 从“1.2.6”中筛选出的差异基因中选取9个基因进行实时荧光定量PCR(qPCR)分析。用Trizonl试剂提取(Thermo, USA)分离总RNA以去除DNA污染。用NanoDrop One(Thermo，美国)测量RNA的浓度和质量。之后，总RNA与HiScript QRTsupermix for qPCR(+gDNA wiper)(诺唯赞，中国)混合，合成cDNA。将cDNA稀释10倍后，在ABI SimpliAmp PCR仪器(Applied Biosystems, 美国)上进行聚合酶链反应。引物由生工生物技术(上海)有限公司合成(表 2)。qPCR是用SYBR green master mix(诺唯赞，中国)进行的。以2－ΔΔCt代表基因的相对表达水平，Gapdh为内参对照基因。
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表 2 qPCR引物 Table 2 qPCR primers |
1.2.8 多基因蛋白互作网络 将产气荚膜梭菌诱导的肠毒血症的转录组分析得到的705个差异表达基因，规定置信区间高于0.700的蛋白，并且隐藏网络中断开连接的节点，通过STRING网站(http://string-db.org)中生成多基因蛋白互作网络图。
1.3 统计学分析在本试验中，所有的试验结果均使用SPSS 20.0进行分析，并以“平均值±标准误差(SEM)”的形式呈现。数字由GraphPad Prism 8.1和R Studio(4.0.3版)生成。两组试验值的差异用T检验评估，统计学意义如下：*.P＜0.05; **.P＜0.01; ***.P＜0.001。
2 结果 2.1 产气荚膜梭菌中的毒素表达检测PCR扩增结果的凝胶电泳鉴定结果表明，本试验所用的C型产气荚膜梭菌强毒株主要为α毒素和β毒素(图 1)。
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M. DNA相对分子质量标准；α. α毒素；β. β毒素 M. DNA marker; α. α toxin; β. β toxin 图 1 PCR电泳结果 Fig. 1 PCR electrophoresis results |
产气荚膜梭菌注入空肠结扎环7 h后，打开腹腔取出小肠，观察到接种产气荚膜梭菌的结扎环出现肉眼可见的肠道膨胀和黏膜出血，而对照组则没有损伤和出血。组织学上，产气荚膜梭菌感染的肠道组织表现出明显的肠毒血症特征，具体病理变化为绒毛缩短，多处绒毛顶端上皮细胞脱落和坏死，并伴有明显的毛细血管扩张，然而对照组没有观察到坏死或出血(图 2)。这些结果表明，经过接种产气荚膜梭菌的肠道在宏观上和组织学上均显示出明显的肠毒血症病理变化。
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A. 对照组；B. C. perfringens感染组 A. Control group; B. C. perfringens infected group 图 2 肠道HE染色(400×) Fig. 2 HE staining of the intestine (400×) |
经过对正常黇鹿肠道(对照组)和感染产气荚膜梭菌黇鹿肠道(感染组)，共得到34.68 Gb的Clean Data。对原始数据进行测序质量控制后，各样品Clean Data均达到5.78 Gb，Q30碱基百分比不低于93.75%，CG含量均在50%左右，表明测得数据可利用率高，能够用于后续的转录组分析。各样品的测序数据评估结果见表 3。
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表 3 样品测序数据评估统计表 Table 3 Sample sequencing data evaluation statistics |
通过对比鹿的正常肠道和感染产气荚膜梭菌的肠道的基因表达情况，发现共存在705个差异表达基因，其中, 在感染组肠道中有276个上调的差异基因，有429个下调的差异基因，以及14 460个无显著差异的基因(图 3A)。双向聚类热图(图 3B)结果显示，经过中心化和标准化的基因表达量中相近的基因被聚集在一起，形成了2个不同的功能相关类群，说明两个试验组内的基因表达谱差异性较低，并且说明试验结果准确、可靠。
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图 3 差异表达基因火山图(A)、热图(B) Fig. 3 Volcano map (A) and heatmap (B) of differentially expressed genes |
2.5.1 GO富集分析 GO数据库是一个结构化的标准生物学注释系统，建立了基因及其产物功能的标准词汇体系。GO富集分析包括3个部分，分别是生物过程、细胞成分和分子功能。各选择3部分中差异基因数量排名前10的基因功能绘制图 4A。从图中可以发现，在生物过程中差异表达基因主要富集在代谢过程、生物调节、对刺激的反应和免疫系统过程等；在细胞成分中差异基因主要富集在细胞膜和细胞器部分等；在分子功能中主要富集在核酸结合转录因子活性、分子功能调节器和抗氧化剂活性等。
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图 4 差异表达基因GO富集分析(A)、KEGG富集分析(B) Fig. 4 GO enrichment analysis (A) and KEGG enrichment analysis (B) of differentially expressed genes |
2.5.2 KEGG富集分析 KEGG数据库是关于Pathway的主要公共数据库。在生物体内，不同的基因产物相互协调来行使生物学功能，对差异表达基因的Pathway注释分析有助于进一步解读基因的功能。选择差异表达基因中富集显著性排名前20的通路功能绘制图 4B。从气泡图中可以发现，差异表达基因富集的通路主要是造血细胞谱系、肠道免疫网络的IgA生产、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、细胞因子-细胞因子受体的相互作用、Toll样受体信号通路、过氧化物酶体和T细胞受体信号传导途径等。
2.6 qPCR验证结果为了验证转录组结果的准确性，随机对筛选出来的DEGs进行了mRNA水平分析。由图 5发现，RNA-Seq表达可以通过使用RNA的荧光定量PCR来验证，说明RNA-Seq结果可信度高。具体来说，紧密连接蛋白编码基因Claudin1、Claudin3和Claudin4减少，IL-1β、IL-6、IL-8、IL-22和TLR6增加。该结果与RNA-Seq中表达结果一致，表明分析结果准确可信。
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与对照组相比，*.P＜0.05，**.P＜0.01，***.P＜0.001 Compared with the control group, *.P < 0.05, **.P < 0.01, ***.P < 0.001 图 5 差异基因的qPCR验证 Fig. 5 qPCR validation of differential genes |
通过转录组测序分析得到的705个差异表达基因，运用String数据库(https://string-db.org/)绘制多基因蛋白互作网络(图 6)。根据互作得分过滤掉可信度低的互作关系后，与其他蛋白有较多互作关系的蛋白如TLR6、CLDN1、CD3E、IL1A和CCL20等。其中，TLR6涉及KEGG分析中功能注释中的Toll样受体信号通路和GO分析中功能注释前10个显著富集通路中的免疫系统过程和生物调节；CLDN1与GO富集分析的细胞成分中的膜相关；IL1A和CCL20富集于KEGG分析中的造血细胞谱系和GO分析中的免疫系统过程以及对刺激的反应相关。有趣的是，这些基因之间存在相互作用。蛋白互作网络结果再次验证了转录组结果并且提出了多个基因可能在鹿感染产气荚膜梭菌过程中发挥重要作用。
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图 6 多基因蛋白互作分析 Fig. 6 Multigene protein interaction analysis |
大量临床实践表明，产气荚膜梭菌能够引起多种脊椎动物的肠道感染，并且在肠道中产生毒素，继而进入到血液循环中，引起特殊的毒性症状，被称为肠毒血症[15-17]。在鹿群中，C型产气荚膜梭菌对动物的健康和生存有很大的威胁，患病动物往往在短时间内迅速发病，以腹泻为特征，常常会出现休克乃至死亡。组织病理学发现肠道感染C型产气荚膜梭菌后，由于大量毒素分泌导致肠道上皮及周围组织形态异常，绒毛层脱落，伴有肠道炎性细胞分泌增加[7]，这些都对肠道完整性在不同程度上造成破坏。因此，研究产气荚膜梭菌的致病机理和分子机制以及鹿对C型产气荚膜梭菌感染的防御机制非常重要。本试验通过在鹿体内建立空肠结扎环模型，模拟产气荚膜梭菌感染肠道的过程，对正常肠道和感染C型产气荚膜梭菌后的肠道进行转录组学分析，筛选差异表达基因，并对差异表达基因进行功能富集分析，寻找产气荚膜梭菌感染鹿肠道过程中的关键分子途径，全面地揭示产气荚膜梭菌感染后肠道基因的动态变化。
本研究结果证实C型产气荚膜梭菌导致鹿出现肠毒血症症状，并且其携带的毒素主要是α和β毒素。相比存在于所有产气荚膜梭菌的α毒素，β毒素主要由C型产气荚膜梭菌产生，并且被证实与动物的肠毒血症发病机制密切相关[18]。产气荚膜梭菌产生毒素后刺激肠道黏膜分泌大量黏液，产生多种炎性因子，加速肠绒毛坏死脱落，导致小肠绒毛面积减少，黏膜吸收能力降低，造成腹泻[19]。与此同时，机体通过免疫炎症反应维持的内环境稳态被破坏，导致肠道微生物群紊乱，肠道固有层通透性发生变化，黏膜免疫系统异常[20]。在本研究中，对鹿肠道进行HE染色，观察到肠道组织被不同程度的损坏，绒毛坏死脱落，伴有明显的出血和组织坏死的现象。
C型产气荚膜梭菌的β毒素(CPB)是α-溶血素家族的β-成孔毒素(pore-forming toxin, PFT)[21]，通过破坏细胞质膜完整性发挥作用，被认为是具有肠道坏死性的毒素。CPB在细胞膜上形成的功能性孔，允许K+的流出和Ca2+、Na+和Cl-的流入，引起细胞肿胀[22]。研究表明，产气荚膜梭菌能够通过破坏肠道紧密连接蛋白，改变肠上皮细胞通透性，破坏肠上皮屏障[23]。在本研究中，GO分析中紧密连接蛋白通路被富集，产气荚膜梭菌感染肠道后，Claudin 1、Claudin 3、Claudin 4降低，蛋白互作分析中CLDN1与其他蛋白有较多的互作关系，这表明产气荚膜梭菌诱导的肠毒血症能够部分破坏肠道紧密连接蛋白并增加肠道通透性。类似的，本研究也发现了C型产气荚膜梭菌感染后，基因富集在细胞成分中的细胞膜，以及造血细胞谱系通路的富集，这可能提示毒素在穿透细胞膜后，诱导造血细胞紊乱，进而引起出血。
在动物的肠毒血症中，宿主-病原体相互作用是复杂的，并且涉及宿主免疫系统的不同组成部分[24]。如前所述，产气荚膜梭菌的发病是由于细菌穿透上皮表面的黏膜屏障开始的，之后与上皮细胞结合和附着。据报道，细菌与肠道上皮细胞结合的机制首先是高度保守的受体与配体(细菌相关分子)的识别结合，其中，Toll样受体(TLRs)的特征最为明显[25]。在本试验中转录组结果显示TLR6显著增加，蛋白互作网络结果也显示TLR6与其他蛋白有较多的互作关系。TLR6一般不单独存在，与TLR2形成异源二聚体，以识别外源性病原体[26]。TLR6信号的失调涉及一系列的疾病，如溃疡性结肠炎和轻度疟疾[27]。由于肠道TLR2识别产气荚膜梭菌在内的革兰阳性菌中的肽聚糖[28]，在本研究中发现TLR6与紧密连接蛋白存在互作，因此，作者推测在鹿产气荚膜梭菌感染引起的肠毒血症中TLR6识别产气荚膜梭菌并启动紧密连接蛋白下调，增加肠道通透性，损伤肠道屏障。
TLRs除了在识别细菌方面的作用外，还能够在先天免疫系统中识别微生物成分，诱发免疫反应的下游信号传导级联。配体与TLR结合后，适配器分子如MyD88将被招募以传递下游信号反应。接下来，MyD88又会激活NF-κB，后者进入细胞核，激活下游的免疫相关细胞因子[29]。NF-κB反过来触发促炎反应，主要表现为细胞因子水平升高，如IL-10和TNF-α，并且增加活性氧(ROS)含量[30]，这些与免疫反应和氧化应激有关。有文献表明，沙门氏菌感染后诱导肠道中多种细胞的先天免疫，包括自然杀伤(NK)和自然杀伤T(NKT) 细胞。由参与先天免疫的细胞产生的细胞因子，主要是白细胞介素，激活T细胞和B细胞相关的适应性免疫。黏膜上皮通过分泌炎性细胞因子和趋化因子对肠道病原体作出反应，如IL-1β、IL-6、IL-8以及IL-22，促进炎症发展和细菌感染[31]。本研究的GO和KEGG富集分析以及多基因蛋白互作网络中均发现了免疫炎症和氧化应激相关多个基因和多条通路显著富集，如在生物过程中免疫系统过程、在分子功能中抗氧化剂活性以及肠道免疫网络的IgA生产、过氧化物酶体和T细胞受体信号传导途径等；同时，多基因蛋白互作网络中还发现白介素家族基因的显著富集，如IL1A和IL15等，以及免疫系统相关基因，如T细胞的高度特异性标记物CD3E等。因此，C型产气荚膜梭菌感染可能通过激活Toll样受体进而诱发肠道的炎症反应和氧化应激，但具体的作用机制还需要进一步验证。
4 结论本研究首次通过RNA-Seq技术揭示了鹿肠道感染C型产气荚膜梭菌的分子机制。对差异基因进行GO和KEGG富集分析表明，产气荚膜梭菌感染肠道主要通过破坏细胞膜，促进细胞因子的分泌，产生细胞毒性，并且破坏造血细胞，引起肠道损伤和出血。同时通过Toll样受体破坏肠道紧密连接蛋白表达，诱导下游基因促进免疫炎症反应和氧化应激。这些信号通路均参与了鹿肠毒血症的发展，并加剧了产气荚膜梭菌诱导的肠道损伤。本研究结果将为产气荚膜梭菌病的致病机理研究提供理论基础，同时为寻找该病的治疗靶点提供新的思路。
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(编辑 白永平)