2. 西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，银川 750021
2. Key Laboratory of Ministry of Education for Conservation and Utilization of Special Biological Resources in the Western China, Yinchuan 750021, China
结核病(tuberculosis, Tb)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)感染引起的人畜共患传染病。据2021年世界卫生组织报道，结核病是仅次于新冠肺炎的第二大传染病，在全球主要致死疾病中位居第十三[1]。而且，由于多重耐药菌株以及Mtb与人类免疫缺陷病毒共感染的出现，使结核病的防控形势日益严峻[2]。因此，深入揭示结核分枝杆菌与巨噬细胞的互作机制具有极其重要的科学意义。
结核分枝杆菌作为一种胞内感染菌，巨噬细胞是其主要的宿主细胞和靶细胞[3]。一方面，巨噬细胞会通过自噬和凋亡清除入侵的Mtb，另一方面，Mtb会通过多种机制抑制细胞自噬和凋亡，促进细胞坏死，从而达到免疫逃逸的目的[4]，二者相互作用的机制复杂，至今尚不完全明晰。此外，Mtb感染还能够引起宿主细胞代谢异常。研究表明，Mtb感染会诱导细胞内脂质蓄积，促进细胞内脂滴形成[5]。Mtb不仅能够直接利用脂滴中的脂质为其生长繁殖供能，还能够合成自身独特细胞壁结构，保障Mtb的生存[6]，脂肪酸代谢与细胞自噬并非相互独立，Saito等[7]研究发现，NCoR1能够通过促进细胞β-氧化，进而抑制细胞自噬。另有研究表明，宿主细胞代谢改变还会激活相关信号通路，影响内质网的脂肪酸合成和胆固醇代谢功能，诱导内质网应激，促进自噬的发生[8-9]。因此，发掘代谢通路中的关键因子，并探索其在脂肪酸代谢和细胞自噬中的调控作用，受到了普遍关注。研究发现，脂肪分化相关蛋白2(perilipin 2，PLIN2)作为PAT家族成员之一，广泛存在于不同物种中，能够通过阻遏脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase, ATGL)和激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase, HSL)与脂滴表面接触，从而在维持胞内脂肪酸代谢稳态以及脂滴的形成和降解方面发挥关键作用[10]。并且，PLIN2在多种感染性疾病中具有不可或缺的作用[11-13]，如铜绿假单胞菌感染小鼠后，敲减PLIN2能够抑制细胞内脂滴的过量积累，缓解感染导致的肺部损伤[14]；丙型肝炎病毒感染HEK293T细胞后，敲减PLIN2能够增强局部脂肪酶活性，抑制丙型肝炎病毒的增殖[15]。如前所述，Mtb感染能够引起宿主细胞脂代谢异常，PLIN2作为重要的维持胞内脂肪酸代谢稳态蛋白，其是否参与Mtb感染过程中对巨噬细胞自噬的调控，以及其分子机制如何，尚未见相关报道。
本研究在BCG感染条件下，通过小干扰RNA敲减小鼠巨噬细胞内PLIN2的表达，以期揭示PLIN2对BCG感染的巨噬细胞自噬的调控作用及机制。该研究将有助于进一步丰富对Mtb与巨噬细胞相互作用的理解。
1 材料与方法 1.1 主要材料小鼠巨噬细胞RAW264.7(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)；牛结核分枝杆菌疫苗株(上海生物制品研究所)；高糖培养基(DMEM)和OPTI-MEM(Gibco公司)；特级胎牛血清与磷酸盐缓冲溶液(BI公司)；Lipo-fectamineTM RNAiMAX与BODIPY-488 nm(Invitrogen公司)；小干扰RNA(上海生工生物)；全蛋白提取试剂盒(南京凯基)；抗酸染色试剂盒(北京索莱宝)；蛋白定量试剂盒与6×Protein Marker(Thermo Fisher)；Cyto-ID细胞自噬检测试剂盒(ENZO)；Fluo-4 AM (钙离子荧光探针, 5 mmol·L-1)(大连美仑)；电泳缓冲液(上海百赛生物)；细胞爬片、六孔板与十二孔板(NEST)；含DAPI防淬灭荧光封片剂(中杉金桥)；PLIN2单克隆抗体(T56811)、ATG7单克隆抗体(T55658)(Abmart)；HRP偶联的羊抗兔IgG抗体(Proteintech)；eIF2α单克隆抗体(5324S)(Cell Signaling Technology)；p-eIF2α单克隆抗体(AP0692)和ATG12单克隆抗体(A19610)(Abcolony)。
1.2 BCG传代培养接种BCG于含5% OADC增菌剂的Middlebrook 7H9液体培养基中，在37 ℃培养箱中静置培养，待BCG OD600 nm=1.5后进行传代。
1.3 小鼠巨噬细胞RAW264.7培养及BCG感染待培养皿中细胞密度至80%~90%，进行细胞传代。具体步骤如下：弃去培养皿中培养液后，使用胰酶消化细胞1 min，于800 r·min-1离心5 min，随后吸弃上清，重悬并吸取适量细胞悬液于10 cm培养皿中，于细胞培养箱中培养。待贴壁完全后按试验设计加入BCG悬液，感染一段时间后，利用光学显微镜观察巨噬细胞形态变化，若圆形巨噬细胞分化出伪足，即可判断为感染成功。
1.4 小干扰RNA的构建于NCBI基因数据库中查找鼠源PLIN2(NM_001403711.1)蛋白编码区序列，随后设计合成小干扰RNA，具体序列见表 1。
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表 1 小干扰RNA序列 Table 1 The sequence of small interfere RNA |
将对数期的RAW264.7细胞接种于六孔细胞培养板中，每孔接入1×106个细胞，待细胞贴壁后按RNAiMAX试剂说明书进行操作，每孔加入7~10 μL转染试剂以及20 μmol·L-1小干扰RNA 3~5 μL，转染24 h后，观察荧光强度以确定转染效率。
1.6 试验分组设计分别设置阴性对照组(negative control)(使用siRNA-NC转染)、BCG感染组(使用siRNA-NC转染)、PLIN2敲减组(si-PLIN2组)(使用siRNA-PLIN2转染)和PLIN2敲减结合BCG感染组(BCG+si-PLIN2组)(使用siRNA-PLIN2转染)。相应小干扰RNA转染处理24 h，BCG组和siRNA+BCG组加入BCG(MOI=10)感染12 h。
1.7 流式细胞术检测细胞内Ca2+浓度细胞计数后于六孔板每孔中接入1×106个巨噬细胞RAW264.7，随后按照试验分组相应处理，处理结束后，使用胰酶消化细胞1 min，于800 r·min-1离心5 min，随后吸弃上清，加入500 μL混有Fluo-4 AM染料的PBS并混匀，于细胞培养箱中孵育20 min，孵育结束后，用PBS重悬，再次孵育20 min，最后通过流式细胞仪检测细胞内Ca2+浓度。
1.8 免疫荧光检测预置10 mm盖玻片于十二孔细胞培养板中，每孔接入5×104个细胞，待细胞贴壁后按试验设计处理细胞。(1)脂滴染色：处理结束后吸弃培养液，加入4%多聚甲醛固定20 min，随后使用1 ∶250 PBS稀释的BODIPY-488染料染色15 min，最后用封片剂封片；(2)蛋白染色：固定后加入0.5%Triton X-100室温通透30 min，随后用3%BSA室温封闭1 h，于37 ℃孵育一抗2 h(LC3及PLIN2抗体按1 ∶200比例稀释于3%BSA中)，37 ℃避光孵育二抗1 h，最后用封片剂封片，于激光共聚焦显微镜下观察。
1.9 Western blot检测六孔板中加入2 ml细胞培养液，随后每孔接种1×106个RAW264.7细胞，按试验设计处理后，使用南京凯基全蛋白提取试剂盒提取全蛋白，具体按说明书进行操作。定量完成后，进行SDS-PAGE凝胶电泳，随后使用PVDF膜进行湿转操作，过夜孵育特异性一抗PLIN2、ATG7、LC3(以1 ∶1 000稀释)；eIF2α、p-eIF2α、CHOP(以1 ∶2 000稀释)。最后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的相应二抗于室温孵育1 h后，通过化学发光显色仪检测。
1.10 抗酸染色预置10 mm盖玻片于十二孔细胞培养板中，每孔接入5×104个细胞，待细胞贴壁后按试验设计处理细胞。处理完成后，利用光学显微镜(物镜倍数40×)观察细胞形态，随后加入4%多聚甲醛，常温静置固定20 min。固定结束后，将十二孔板底部玻片勾出，细胞面朝下放置载玻片，利用抗酸染色试剂盒对玻片进行染色，步骤简略如下：首先，在玻片上滴加染液A，放入37 ℃培养箱中热染30 min。取出后用蒸馏水冲洗至没有红色，用染料B脱色(约1 min)，待干燥后用油镜观察。
1.11 数据处理所有试验数据均经过3次独立试验的验证，试验数据采用Graphpad Prism 8.0软件中T-test或One-Way ANOVA进行统计学分析，并经过Bonferroni校正，数据均使用“均数±标准差(x±s)”表示。图中标注*代表差异显著(P＜0.05)，**代表差异极显著(P＜0.01)，***代表差异极显著(P＜0.001)。
2 结果 2.1 PLIN2敲减细胞模型的建立为研究BCG感染对巨噬细胞内PLIN2表达的影响，本研究首先利用不同浓度的BCG悬液感染巨噬细胞12 h，感染结束后，利用抗酸染色法通过显微镜观察感染情况(图 1A)。显微观察结果显示，感染后的巨噬细胞分化出伪足，同时抗酸染色结果表明，在巨噬细胞(蓝色球状)内出现大量BCG(粉色杆状)，以上结果表明，感染已成功建立。随后为了解BCG感染后，对巨噬细胞内PLIN2表达的影响，本研究进一步采用Western blot检测了BCG不同感染复数感染时间条件下PLIN2在胞内的蛋白表达。结果表明，与空白对照组相比，PLIN2的表达在BCG感染复数为10、感染时间为12 h时极显著上调(P＜0.001)。
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A. 油镜下观察BCG感染效率(630×)；B~E. Western blot检测PLIN2敲减效率。*.P＜0.05，***.P＜0.001. ns，P＞0.05 A. Observation of BCG infection efficiency under oil microscope(630×); B-E. Western blot detection of PLIN2 knockdown efficiency.*.P < 0.05, ***.P < 0.001. ns, P > 0.05 图 1 BCG感染细胞模型建立及效率验证 Fig. 1 BCG-infected cell model establishment and efficiency validation |
为进一步验证PLIN2在BCG感染巨噬细胞过程中对细胞自噬和脂肪酸代谢的调控作用，本研究设计并合成PLIN2小干扰RNA，并通过Western blot及免疫荧光试验验证小干扰RNA的干扰效率(图 2A)。Western blot结果表明，PLIN2小干扰RNA处理后，BCG感染前后细胞内PLIN2的表达均显著下降(P＜0.01)。同时免疫荧光结果显示，PLIN2小干扰RNA处理后，细胞内蛋白阳性斑点(绿色斑点)显著减少。结合Western blot检测和免疫荧光观察结果，所合成的小干扰RNA能够有效抑制PLIN2蛋白表达，成功建立了敲减PLIN2结合BCG感染巨噬细胞的模型(图 2)。
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A. Western blot检测PLIN2敲减效率；B. 免疫荧光观察敲减后PLIN2蛋白表达水平(400×)。*.P＜0.05, ** P.＜0.01 A. Western blot detection of PLIN2 knockdown efficiency; B. Immunofluorescence observation of PLIN2 protein expression level after knockdown (400×).*.P < 0.05, **. P < 0.01 图 2 PLIN2小干扰RNA干扰效率验证 Fig. 2 Validation of interference efficiency of small interfering RNA targeting PLIN2 |
为探究BCG感染后PLIN2在巨噬细胞脂肪酸代谢中的作用，采用免疫荧光、甘油三酯试剂盒和总胆固醇试剂盒检测了胞内中性脂质含量变化。结果表明(图 3A)，BCG感染巨噬细胞后，胞内脂质含量显著增加，而敲减PLIN2能够显著降低胞内脂质含量；BCG感染极显著上调巨噬细胞内甘油三酯和总胆固醇水平(P＜0.01)(图 3B、C)，而敲减PLIN2后极显著降低细胞内甘油三酯和总胆固醇的含量(P＜0.001)。表明BCG感染条件下，PLIN2能够调控巨噬细胞脂肪酸代谢，促进巨噬细胞内中性脂质的蓄积。
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A. 免疫荧光观察BODIPY染色后脂滴变化(400×)；B、C.试剂盒检测甘油三酯及总胆固醇含量变化。**. P＜0.01，***. P＜0.001 A. Immunofluorescence observation of lipid droplet changes after BODIPY staining (400×); B, C. Changes of triglyceride content and total cholesterol (detected by kit). **. P < 0.01, ***. P < 0.001 图 3 敲减PLIN2对BCG感染的巨噬细胞内脂质含量的影响 Fig. 3 Effect of knockdown of PLIN2 on lipid content in BCG-infected macrophages |
为进一步研究PLIN2对BCG感染巨噬细胞自噬的调控作用。采用流式细胞术检测了各处理组自噬率的变化，采用免疫荧光分析了自噬相关蛋白ATG7的表达。结果表明，与空白对照组相比，BCG感染极显著增加了细胞自噬率(P＜0.001)，而敲减PLIN2能够极显著降低细胞自噬率(P＜0.001)(图 4A)；同时，敲减PLIN2能显著降低BCG感染的巨噬细胞内ATG7的水平(图 4B)。
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A. 流式细胞仪检测细胞自噬率变化；B.免疫荧光观察自噬相关蛋白ATG7蛋白表达水平(400×)。**. P＜0.01，***. P＜0.001 A. Flow cytometry detection of cellular autophagy rate changes; B. Immunofluorescence observation of autophagy-associated protein ATG7 protein expression level (400×). **. P < 0.01, ***. P < 0.001 图 4 敲减PLIN2对细胞自噬相关蛋白及自噬率的影响 Fig. 4 The effect of PLIN2 knockdown on regulation of autophagy-related proteins and autophagy rate |
利用激光共聚焦显微镜检测了不同处理组中自噬体(mRFP-GFP-LC3)和自噬溶酶体(mRFP-LC3)的聚集情况。结果表明，BCG感染巨噬细胞后，细胞内自噬体和自噬溶酶体数量极显著增加(P＜0.01)，而敲减PLIN2能够极显著降低巨噬细胞中自噬体和自噬溶酶体数量(P＜0.01)(图 5)。
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A. 激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞自噬流(630×)；B. 自噬体与自噬溶酶体的柱状分析图。**. P＜0.01 A. Laser confocal microscopy observation of macrophage autophagic flow (630×); B. Bar graph analysis of autophagosomes and autophagic lysosomes. **. P < 0.01 图 5 敲减PLIN2对BCG感染巨噬细胞后自噬流的影响 Fig. 5 Effect of knockdown PLIN2 on autophagic flow after BCG infected macrophage |
通过Western blot检测参与自噬体延伸的ATG5、ATG12以及参与自噬溶酶体形成的LC3的蛋白表达。结果表明，BCG感染后，巨噬细胞中ATG5(P＜0.01)、ATG12(P＜0.01)和LC3(P＜0.001)的表达均极显著上调，而敲减PLIN2能够使ATG5(P＜0.05)和ATG12(P＜0.05)表达显著下调，LC3(P＜0.001)的蛋白表达极显著下调(图 6)。因此，BCG感染条件下，敲减PLIN2能够抑制巨噬细胞自噬的发生。
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A. Western blot检测自噬相关蛋白表达；B~D. LC3、ATG5和ATG12的Western blot检测结果灰度值分析。*. P＜0.05，**.P＜0.01，***. P＜0.001 A. Western blot detection of autophagy-related protein expression; B-D. Grayscale analysis of Western blot detection results of LC3, ATG5 and ATG12.*. P < 0.05, **. P < 0.01, ***. P < 0.001 图 6 敲减PLIN2对自噬相关蛋白表达的影响 Fig. 6 Effect of knockdown PLIN2 on regulating autophagy related factors |
为进一步探讨PLIN2对巨噬细胞内质网应激的调控作用，通过Western blot检测内质网应激相关蛋白eIF2α、p-eIF2α、CHOP和ATF4的表达变化。结果表明，BCG感染极显著上调CHOP(P＜0.01)和ATF4(P＜0.001)的表达水平以及eIF2α的磷酸化水平(P＜0.01)，而敲减PLIN2后显著下调CHOP的表达(P＜0.05)，极显著下调ATF4的表达(P＜0.001)及eIF2α的磷酸化水平(P＜0.01)(图 7)。
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A. Western blot检测内质网应激相关蛋白表达；B~D. p-eIF2α/eIF2α、CHOP和ATF4的Western blot检测结果灰度值分析。*. P＜0.05，**.P＜0.01，***. P＜0.001 A. Western blot detection of endoplasmic reticulum stress-related protein expression; B-D. Grayscale analysis of Western blot detection results of p-eIF2α/eIF2α, CHOP and ATF4.*. P < 0.05, **. P < 0.01, ***. P < 0.001 图 7 敲减PLIN2对内质网应激相关蛋白表达的影响 Fig. 7 Effect of knockdown PLIN2 on regulating endoplasmic reticulum stress related factors |
通过流式细胞术检测不同处理组细胞内Ca2+浓度的变化，结果表明，与空白对照组相比，BCG感染巨噬细胞后敲减PLIN2能够极显著降低细胞内Ca2+浓度(P＜0.001)。表明在BCG感染条件下，敲减PLIN2能够抑制内质网应激的激活(图 8)。
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A. 流式细胞仪检测细胞内Ca2+浓度；B. Ca2+浓度统计分析结果。***. P＜0.001 A. Flow cytometry detection of intracellular Ca2+ concentration; B. Statistical analysis of the Ca2+ concentration. ***. P < 0.001 图 8 敲减PLIN2对胞内Ca2+浓度的影响 Fig. 8 The effect of PLIN2 knockdown on regulation on intracellular Ca2+ concentration |
为探讨脂肪酸代谢与内质网应激之间的关系，利用OPTI-MEM无血清培养基剥夺细胞生长所需脂肪酸，并外源添加中性脂质，采用Western blot检测内质网应激相关蛋白的表达。结果表明，BCG感染条件下，内质网应激蛋白表达随中性脂质浓度的增加而增加，并在1.25 μmol·L-1时表达量最高(P＜0.001)。提示脂肪酸代谢与内质网应激关系密切，胞内脂肪酸代谢的改变参与了内质网应激的激活(图 9)。
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A. Western blot检测内质网应激相关蛋白表达；B、C. CHOP和ATF4的Western blot检测结果灰度值分析。*. P＜0.05，**. P＜0.01，***. P＜0.001 A. Western blot detection of endoplasmic reticulum stress-related protein expression; B, C. Grayscale analysis of Western blot detection results of CHOP and ATF4.*. P < 0.05, **. P < 0.01, ***. P < 0.001 图 9 外源添加甘油三酯对胞内内质网应激相关蛋白表达影响 Fig. 9 Effect of exogenous addition of triglycerides on intracellular endoplasmic reticulum stress-related protein expression |
最后，本研究探究了敲减PLIN2对BCG诱导巨噬细胞自噬的调控作用是否由内质网应激介导，采用内质网应激激动剂Tunicamycin激活内质网应激，并通过Western blot检测内质网应激及自噬相关蛋白的表达。结果表明，Tunicamycin浓度为2 μg·mL-1时，内质网应激相关蛋白ATF4、CHOP的蛋白表达极显著增加(P＜0.001)(图 10A)。同时，利用Tunicamycin持续激活细胞内质网应激通路后，敲减PLIN2无法对内质网应激造成影响，同时无法调控自噬相关蛋白ATG5和ATG12的表达变化，表明内质网应激介导了细胞自噬的发生。
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A. Western blot检测内质网应激相关蛋白表达；B. Western blot检测自噬相关蛋白表达。*. P＜0.05，**.P＜0.01，***. P＜0.001，ns. P＞0.05 A. Western blot detection of endoplasmic reticulum stress-related protein expression; B. Western blot detection of autophagy-related protein expression. *. P < 0.05, **. P < 0.01, ***. P < 0.001, ns. P > 0.05 图 10 PLIN2通过内质网应激信号通路调控BCG诱导的巨噬细胞自噬 Fig. 10 PLIN2 regulates BCG-induced macrophage autophagy through endoplasmic reticulum stress signaling pathway |
巨噬细胞作为Mtb的靶细胞，其被感染后的免疫反应决定了结核病的病程发展。一方面，巨噬细胞识别Mtb后启动免疫应答[16]，通过细胞自噬清除入侵的病原菌[17]。另一方面，Mtb感染还会促进细胞代谢改变，诱导细胞内脂质蓄积[18]。巨噬细胞内的免疫和代谢功能相互协调，其中，脂肪酸代谢与细胞自噬之间关系紧密，细胞自噬不仅能够将衰老损伤的细胞器分解为各种前体物质供生命活动重复利用，还能够在细胞脂肪酸代谢异常时，维持胞内脂代谢稳态。此外，众多研究表明，脂质分子本身和脂肪酸代谢中的关键因子会对自噬进程产生影响，如欧天童[19]研究发现，在巨噬细胞中外源加入富含ω-3长链多不饱和脂肪酸的鱼油，会诱导细胞脂肪酸代谢异常，激活细胞自噬，以维持胞内脂肪酸代谢稳态。同时，李晓燕[20]研究发现，TIPE1通过介导脂质的转位和形成蛋白-脂质复合体等方式调控mTORC2自噬信号通路，进而缓解肝细胞脂肪变性。本研究发现，BCG感染巨噬细胞后，会促进巨噬细胞自噬和脂质蓄积并伴随着PLIN2的表达上调。
PLIN2作为脂肪酸代谢的关键因子，分布于脂滴表面，通过调控细胞脂质合成和降解影响胞内脂滴含量，进而维持细胞脂肪酸代谢稳态[21]。众多研究表明，PLIN2在铜绿假单胞菌和丙型肝炎病毒等多种感染性疾病中通过调控脂肪酸代谢参与疾病的发生发展。本研究表明，BCG感染巨噬细胞后，敲减PLIN2能够抑制细胞内甘油三酯及总胆固醇等中性脂质合成，降低细胞内脂质蓄积，并抑制细胞自噬的发生(图 11)。
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图 11 PLIN2调控BCG诱导的巨噬细胞自噬的可能机制 Fig. 11 Possible mechanism of macrophages autophagy regulated by PLIN2 in macrophages infected with BCG |
据报道，脂质代谢异常引起的细胞自噬与内质网应激通路的激活有重要联系。内质网作为脂肪酸合成的重要单元，当脂肪酸代谢异常时，会首先感知并作出反应[22]，如Krebs等[23]发现，脂肪酸代谢异常会引起内质网应激的发生并伴随着内质网Ca2+逸散。内质网应激由内质网膜上IRE1、PERK和ATF6 3个跨膜传感器蛋白介导，当内质网应激发生时，3个传感蛋白会率先激活，并通过各自的下游信号通路调控细胞的生物学进程[24]。近期的研究发现，钙网蛋白作为内质网分子伴侣，当内质网应激时，钙网蛋白高表达并与自噬相关蛋白LC3结合偶联内质网应激与细胞自噬[25]。另有研究表明，内质网应激信号通路中ATF4和CHOP还能够诱导多个自噬相关蛋白的表达[26]。本研究发现在BCG感染过程中外源添加中性脂质，内质网膜上的传感器蛋白PERK及其下游信号通路eIF2α、ATF4和CHOP会级联激活，且表达水平与外源脂质的添加量呈正相关。同时，敲减PLIN2会抑制内质网应激中PERK通路相关蛋白的表达，而当利用内质网应激激动剂Tunicamycin持续激活内质网应激通路后，敲减PLIN2无法抑制内质网应激通路，亦无法调控细胞自噬的发生。本试验从脂肪酸代谢角度解释Mtb诱导巨噬细胞自噬的作用机制，研究结果将为Mtb致病机制的解读提供新的视角与理论依据(图 11)。
4 结论BCG感染巨噬细胞上调了PLIN2的表达，而PLIN2通过上调细胞内脂肪酸含量，进而级联激活PERK-eIF2α-ATF4-CHOP内质网应激信号通路，诱导细胞自噬发生。
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(编辑 白永平)