2. 武汉市农业科学院畜牧兽医研究所, 武汉 430070;
3. 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所, 农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室, 畜禽病原微生物学湖北省重点实验室, 武汉 430064
, YU Panyuan1, CHEN Hongyu1, TAN Yiqing1, CHEN Xiabing2, ZHANG Tengfei3, GAO Ting3, ZHOU Rui1
, LI Lu1
2. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science, Wuhan Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430070, China;
3. Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Prevention and Control Agents for Animal Bacteriosis (Ministry of Agriculture and Rural Affairs), Hubei Provincial Key Laboratory of Animal Pathogenic Microbiology, Wuhan 430064, China
当前细菌耐药性问题严重，给畜牧业的健康发展和食品安全都造成了严重危害[1]。我国于2020年全面禁止在动物饲料中使用抗生素，由此可能导致动物感染疾病的风险在一段时期内升高，同时治疗性的抗生素使用可能增加，加大了药物残留和耐药菌产生的风险[2]。因此，抗生素替代品的应用与新产品的开发尤为重要[3]。酸化剂是一种环保型添加剂，添加到畜禽饲料中不会残留有害物质，已在国内外广泛应用于家禽、仔猪、牛、羊等动物的饲料中[4-5]。二甲酸钾(potassium diformate, KDF)是目前应用到畜禽饲料的酸化剂之一。KDF是一种白色晶体化合物，由甲酸和甲酸钾通过氢键连接而合成，其熔点较高、吸湿性较强、易溶于水，在酸性环境中比较稳定，在中性或者碱性的环境下容易被分解成甲酸和甲酸盐[6]。KDF是欧盟批准的第一种作为抗生素替代品的绿色饲料添加剂，我国在2005年批准其作为抗生素替代品应用于动物饲料中[7]。KDF主要通过缓释甲酸在胃肠道中起到酸化和杀菌的作用，但是没有甲酸的刺激性和腐蚀性，并且85%的KDF可通过胃进入肠道发挥作用。
KDF在提高动物生长性能方面的应用已有较多的报道[8]。例如，饲料中添加KDF可以提高鸡的生长性能[9]，降低鸡空肠的pH及降低感染坏死性肠炎后的死亡率[10]。猪饲料中添加KDF可以改善肠道菌群结构，提高其生产性能并降低肉中脂肪的含量[11-12]，降低肠系膜淋巴结中沙门菌分离率[13]。饲料中添加KDF可以增加虹鳟幼鱼的日增重和饲料转化率，增强其消化能力[14]。Elala和Ragaa[15]研究表明，KDF可以提高罗非鱼的采食量、体增重、生长率、饲料转化率和蛋白质效率比，并且降低嗜水气单胞菌感染后的死亡率。王凯英等[16]研究表明，水貂饲料中添加适当比例的酸化剂促进小肠绒毛发育、并且改善营养物质消化率。由此，KDF在体内可以显著改善动物的生长性能，然而关于KDF对传染病预防作用的直接证据的研究还比较少，使用KDF对肠道微生物群落的影响也未知。
沙门菌是重要的肠道病原菌[17]，鼠伤寒沙门菌能在小鼠上复制出典型的肠道感染模型。因此，本研究的目的是通过体外抑菌试验以及小鼠感染沙门菌的体内模型，评价KDF对致病菌的预防效果，并检测和分析KDF对动物肠道菌群的影响，为临床上KDF的使用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 菌株与二甲酸钾本研究所用菌株鼠伤寒沙门菌ATCC14028、鼠伤寒沙门菌CVCC542、沙门菌CVCC212197、猪链球菌1360、猪链球菌SC19、巴氏杆菌HB03、大肠杆菌72、大肠杆菌ATCC25922、大肠杆菌PCN033、支气管败血波氏杆菌1607059、胸膜肺炎放线杆菌4074、巴氏杆菌9261、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌ATCC29213、金黄色葡萄球菌1213M4A由本实验室保存。3~4周龄，体重为12~15 g C57/BL6雌鼠购自华中农业大学实验动物中心。小鼠饲料购自武汉春玉红实验动物饲料有限公司，常规饲料配方为每100千克(kg)饲料包括：玉米50 kg，麸皮9 kg，面粉9 kg，豆粕22 kg，鱼粉7 kg，骨粉2 kg，食盐0.5 kg，维生素0.1 kg，维量元素0.16 kg，锌0.004 kg，添加KDF的饲料为常规饲料基础上添加1% KDF。KDF颗粒购自福建旭牧联生物科技有限公司，纯度为95%(检测报告见附件1)。0.1% KDF溶液配制方法为准确称取1 g的KDF颗粒，溶于1 L单蒸水中，用0.22 μm的细菌滤器过滤防止细菌污染，将过滤好的KDF溶液放在常温保存。
1.2 试剂TSA、TSB培养基购自美国BD公司；LA、LB培养基购自青岛海博生物技术公司；MH肉汤购自北京索莱宝科技有限公司；小鼠盲肠基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；小鼠IL-6、IL-12和TNF-α ELISA试剂盒购自杭州联科生物技术有限公司。
1.3 仪器Centrifuge 5415R台式高速离心机购自德国Eppendorf公司；GR60DAGR型立式压力蒸汽灭菌锅购自ZEALWAY公司；HPS-250型生化培养箱、DL-CJ-1型超净工作台均购自北京东联哈尔仪器制造有限公司；自动制冰机购自日本Olymups公司；XM-GTL64型组织研磨仪购自上海净信实业发展有限公司；WD-9405 B型水平摇床购自北京市六一仪器厂；麦氏比浊仪购自美国BD公司。
1.4 KDF体外MIC的测定将15种常见病原菌在TSA平板上培养12 h，用接种环刮取培养基上的菌落于装有生理盐水的麦氏比浊管中，校准0.5%麦氏比浊，稀释菌液的含量为1×106 CFU·mL-1，备用。在无菌的96孔板第一孔加入200 μL提前配制的25 mg·mL-1 KDF溶液，第二孔至十孔分别加入100 μL的MH肉汤培养基，从第一孔吸取100 μL的液体加入第二孔，混匀后再吸取100 μL至第三孔，依次类推，第十孔吸取100 μL弃去。在第十一孔加入200 μL菌液，第十二孔加入200 μL MH肉汤培养基。将制备好的菌液取100 μL分别加到1至10孔，充分震荡混匀，将接种好的96孔板放置37 ℃培养箱中进行培养，24 h后观察菌液生长情况，并记录加入菌液和培养12 h后每个孔的pH和OD600nm，根据结果绘制拟合曲线。
1.5 添加二甲酸钾动物试验设计方案1.5.1 KDF(1%)饲喂对小鼠感染鼠伤寒沙门菌的预防作用 将36只3周龄雌性C57/BL6鼠随机分成3组，参考临床上KDF常用的添加浓度(1%)，第一组为KDF(1%)饲喂试验组(n=12)，第二组为饲喂常规饲料对照组(n=12)，第三组为饲喂常规饲料空白组(n=12)。试验组和对照组小鼠分别在饲喂两周后采用灌胃的方式，每只小鼠感染1.25×108 CFU鼠伤寒沙门菌ATCC14028，感染前禁水12 h，灌胃体积为0.2 mL，空白组灌胃等体积的生理盐水，感染后继续分组饲喂。从试验开始后每天记录小鼠的体重变化直到试验结束，并在感染后第6天从每组随机选取6只小鼠检测其血液、盲肠的载菌量，另外6只小鼠用于感染后血液细胞因子的检测和盲肠病理变化的分析。
1.5.2 KDF(0.1%)饮水对小鼠感染鼠伤寒沙门菌的预防作用 将36只3周龄雌性C57/BL6鼠随机分成3组，根据预试验摸索的KDF在饮水中的添加剂量(0.1%)，第一组为KDF(0.1%)饮水试验组(n=12)，第二组为常规饮水对照组(n=12)，第三组为常规饮水空白组(n=12)。试验组和对照组小鼠分别在饮水1周后采用灌胃的方式感染鼠伤寒沙门菌ATCC14028，感染剂量、方法和后续指标检测与“1.5.1”相同。
1.5.3 小鼠血液和盲肠载菌量的测定 在小鼠感染6 d后，从每组小鼠中随机选取6只取其抗凝血，同时取盲肠置于3倍体积的生理盐水中，并置于组织研磨仪内研磨成匀浆。分别取100 μL血液和盲肠匀浆液进行梯度稀释和活菌计数，每个稀释度3个重复。对平板上长出的单菌落进行鼠伤寒沙门菌的鉴定，目标基因为invA，检测引物，F：5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′，R：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′。
1.5.4 小鼠血清中细胞因子的测定和盲肠病理切片的制作 在小鼠感染6 d后，从每组小鼠中随机选取6只取其非抗凝血，4 ℃静置12 h后，1 000 r·min-1，离心10 min后取上层血清，用ELISA试剂盒检测血清中的IL-6、IL-12和TNF-α的含量。同时，从这6只小鼠中随机选取3只取其盲肠放入组织固定液中，固定24 h后制作石蜡切片，进行HE染色和病理变化分析。
1.6 小鼠肠道菌群的取样与测序分析将10只3周龄雌性C57/BL6雌鼠随机分成2组，第一组为KDF(1%)饲喂试验组(n=5)，第二组为正常饲料饲喂对照组(n=5)，在其他条件相同的情况下，将两组小鼠饲喂2周，然后将小鼠进行剖杀，取盲肠内容物，用天根生化科技有限公司的DNA提取试剂盒提取盲肠内容物的DNA后送至武汉康测科技有限公司进行16S rRNA测序。具体流程如下：使用引物338 F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806 R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 对16S rRNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增。将PCR扩增的回收产物进行荧光定量，根据荧光定量结果，按照每个样本的测序量需求，对各样本按相应比例进行混合并制备测序文库。采用Illumina Novaseq平台进行2×250 bp的双端测序，测序完成后按照QIIME2 dada2分析流程对序列质量进行去噪处理，去噪处理后的序列被称为ASV。基于Sliva 16S rRNA数据库，使用QIIME2中的Naïve bayes分类器对ASVs进行物种分类学分析。
1.7 数据的统计分析对于组织载菌量、炎性细胞因子含量等定量分析，均使用GraphPad Prism 8软件中未配对的双尾T检验进行统计分析，所有数据均以“平均值±SD”表示。P < 0.05表示具有显著差异。
1.8 伦理申明所有动物试验经华中农业大学实验动物监测委员会认可，严格按照“湖北省实验动物护理与使用指南”的建议进行。小鼠实验的伦理审查编号：HZAUMO-2022-0015。
2 结果 2.1 KDF在体外对常见病原菌的MIC检测了KDF对养殖场中分离鉴定的病原菌的抑制效果。菌株中包括革兰阳性菌5株，革兰阴性菌10株，其中，12株属于人兽共患病原菌，有7株属于多重耐药菌株。结果表明，KDF对鼠伤寒沙门菌CVCC212197、鼠伤寒沙门菌CVCC542、鼠伤寒沙门菌ATCC14028、猪链球菌1360、猪链球菌SC19、巴氏杆菌HB03、大肠杆菌72、大肠杆菌ATCC25922、大肠杆菌PCN033、支气管败血波氏杆菌1607059、胸膜肺炎放线杆菌4074的MIC均为3.125 mg·mL-1。KDF对巴氏杆菌9261、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌ATCC29213、金黄色葡萄球菌1213M4A的MIC为6.25 mg·mL-1。因此，KDF在体外具有直接的广谱抑菌效果。在肉汤稀释法测定KDF对病原菌的MIC试验中，同时对细菌培养基pH以及细菌的浑浊度(OD600 nm)进行了测定，本文图片仅展示KDF浓度与细菌培养基pH和OD600nm值的关系。结果如图 1所示：随着KDF浓度的降低，细菌培养基的pH在不断升高，细菌的OD600nm也在升高，图 1B和图 1D中的转折点处KDF的浓度为3.125 mg·mL-1，即MIC。当KDF的浓度高于3.125 mg·mL-1，即pH低于对应培养基的pH时，抑制细菌的生长。结果表明：KDF可以降低细菌培养基的pH，并且酸性环境是KDF抑制细菌生长的直接作用方式之一。
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A.KDF浓度和E.coil PCN033培养基pH的关系；B.KDF浓度和E.coil PCN033 OD600 nm的关系；C.KDF浓度和S.Typhimurium ATCC14028培养基pH的关系；D.KDF浓度和S.Typhimurium ATCC 14028 OD600 nm的关系；A和C的0 h为刚加入KDF后细菌培养基的pH，12 h为过夜生长后细菌培养基的pH，B和D中转折点KDF的浓度为3.125 mg·mL－1 A.Relationship between KDF concentration and pH of E.coil PCN033 medium; B. Relationship between KDF concentration and E.coil PCN033 OD600nm; C. Relationship between KDF concentration and pH of S. Typhimurium ATCC14028 medium; D.Relationship between KDF concentration and OD600nm of S. Typhimurium ATCC14028, 0 h in A and C is the pH of the bacterial medium just after KDF supplementation, 12 h is the pH of the bacterial medium after overnight culture, the turning point KDF concentration in B and D is 3.125 mg·mL-1 图 1 KDF浓度与细菌培养基pH或细菌OD600nm的关系 Fig. 1 The relationship between KDF concentration and bacterial culture medium pH or bacterial OD600 nm |
2.2.1 KDF(1%)饲喂对小鼠感染沙门菌后体重变化以及血液和盲肠载菌量的影响 KDF饲喂组与对照组小鼠体重在感染前不断升高，在感染后均下降(图 2A)，因此，KDF(1%)饲喂对小鼠在感染前和感染后的体重无显著影响。在感染6 d后将小鼠进行剖杀，取小鼠的血液(图 2B)和盲肠(图 2C)进行沙门菌计数。与对照组相比，KDF饲喂组小鼠在感染6 d后血液和盲肠中的载菌量显著降低(P < 0.05)。结果表明，饲喂KDF可以显著降低小鼠感染鼠伤寒沙门菌后血液和盲肠里的细菌载量。
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A.小鼠在感染沙门菌前后的体重变化；B.血液中的细菌载量；C.盲肠组织细菌载量；Blank为空白组，NC为对照组，KDF(1%)为KDF饲喂组；*. P < 0.05，下同 A. Changes of body weight of mice before and after infection with Salmonella; B. Bacterial load in blood; C. Bacterial load in cecum tissue. Blank, uninfected group, NC, infected group, KDF (1%), KDF feeding and infected group; *. P < 0.05, the same as below 图 2 KDF饲喂对小鼠体重变化以及血液和盲肠载菌量的影响 Fig. 2 Effects of feeding with KDF on changes of body weight and bacterial loads in blood and cecum in mice |
2.2.2 KDF(0.1%)饮水对小鼠感染沙门菌后体重变化以及血液和盲肠载菌量的影响 KDF饮水组与对照组小鼠体重在感染前不断升高，在感染后出现下降，但KDF饮水组比对照组小鼠体重下降得缓慢(图 3A)，因此，KDF(0.1%)饮水对小鼠感染前体重变化没有影响，但可以减慢小鼠感染后的体重下降速率。在感染6 d后将小鼠剖杀，取小鼠的血液(图 3B)和盲肠(图 3C)进行沙门菌计数。与对照组相比，KDF饮水组小鼠在感染6 d后血液和盲肠中的载菌量显著降低(P < 0.05)。结果表明，饮水添加KDF可以缓解小鼠感染沙门菌后体重的下降，显著降低小鼠感染沙门菌后血液和盲肠里的细菌载量。
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A.小鼠在感染沙门菌前后的体重变化；B.血液中的细菌载量；C.盲肠组织细菌载量；Blank为空白组(未感染)，NC为对照组(感染)，KDF(0.1%)为KDF饮水组(感染) A. Changes of body weight of mice before and after infection with Salmonella; B. Bacterial load in blood; C. Bacterial loads in cecum tissue. Blank, uninfected group, NC, infected group, KDF (1%), KDF feeding and infected group 图 3 饮水添加KDF对小鼠体重变化以及血液和盲肠载菌量的影响 Fig. 3 Effects of supplementation of KDF in drinking water on body weight change and bacterial loads in blood and cecum in mice |
2.3.1 KDF(1%)饲喂对小鼠感染沙门菌后血清中炎性细胞因子的影响 用ELISA试剂盒测定了小鼠感染沙门菌后血清中炎性细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α的含量(图 4)。与对照组相比，KDF饲喂组在感染6 d后IL-6、IL-12和TNF-α的水平显著降低(P < 0.05)。结果表明，饲喂含KDF的饲料可以显著降低小鼠感染沙门菌后血液中炎性细胞因子的水平。
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A.IL-6水平；B.IL-12水平；C.TNF-α水平。ns. P>0.05，**. P < 0.01，***. P < 0.001，****.P < 0.0001，下同 A. IL-6 level; B. IL-12 level; C. TNF-α level. ns.P>0.05, **. P < 0.01, ***. P < 0.001, ****.P < 0.0001, the same as below 图 4 KDF饲喂对小鼠感染沙门菌后血清炎性细胞因子水平的影响 Fig. 4 Effects of feeding with KDF on serum cytokines secretions in mice infected with Salmonella |
2.3.2 KDF(0.1%)饮水对小鼠感染沙门菌后血清中炎性细胞因子的影响 用ELISA试剂盒测定了小鼠血清中炎性细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α的水平(图 5)。与对照组相比，KDF饮水组在感染6 d后IL-6、IL-12和TNF-α的水平显著降低(P < 0.05)。结果表明，饮含KDF的水可以显著降低小鼠感染沙门菌后血液中炎性细胞因子的水平。
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A.IL-6水平；B.IL-12水平；C.TNF-α水平 A. IL-6 level; B. IL-12 level; C. TNF-α level 图 5 KDF饮水对小鼠感染沙门菌后血清细胞炎性因子水平的影响 Fig. 5 Effects of supplementation of KDF in drinking water on serum cytokines secretions in mice infected with Salmonella |
2.4.1 KDF(1%)饲喂对小鼠感染沙门菌后盲肠病理变化的影响 在感染6 d后剖杀小鼠，取盲肠制作病理切片并进行形态学分析，结果见图 6。空白组小鼠的盲肠未见异常；对照组小鼠的盲肠结构出现异常，细胞核溶解消失，有明显的炎性细胞浸润，组织黏膜下层疏松水肿，杯状细胞减少；KDF饲喂组小鼠盲肠结构基本正常，未见细胞明显坏死，仅有少量炎性细胞浸润。结果表明，与对照组相比，饲喂含KDF的饲料明显降低了小鼠感染沙门菌后盲肠的病理变化程度。
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A~C.空白组小鼠盲肠组织切片；D~F.对照组小鼠盲肠组织切片；G~I.饲喂组小鼠盲肠组织切片；A、B、C.未见异常；D.箭头表示炎症细胞浸润；E.箭头表示组织黏膜下层疏松水肿，炎性细胞浸润；F.箭头表示细胞核溶解消失，炎性细胞浸润；G.未见异常；H.箭头表示炎性细胞浸润；I.未见异常(标尺=100 μm) A-C. Histological sections of cecum of mice in blank group; D-F. Histological sections of the cecum of mice in the control group; G-I. Histological sections of cecum of mice in feeding group; A, B, C. No abnormality; D. The arrow indicates inflammatory cell infiltration; E. The arrows indicate the loose edema of the submucosa and the inflammatory cell infiltration; F. The arrows indicate the disappearance of nuclei and the inflammatory cell infiltration; G. No abnormality; H. The arrow indicates the inflammatory cell infiltration; I. No abnormality(bar=100 μm) 图 6 KDF饲喂对小鼠感染沙门菌后盲肠病理变化的影响(100×) Fig. 6 Effects of feeding with KDF on pathological changes of cecum after Salmonella infection in mice (100×) |
2.4.2 KDF(0.1%)饮水对小鼠感染沙门菌后盲肠病理变化的影响 在感染6 d后剖杀小鼠，取盲肠制作病理切片并进行形态学分析，结果见图 7。空白组小鼠的盲肠未见异常；对照组小鼠的盲肠结构出现异常，黏膜层腺体基本消失，有大量的炎症细胞浸润，杯状细胞大量减少；饮水组小鼠盲肠整体结构基本正常或轻度异常，仅可见少量炎症细胞浸润。结果表明，与对照组相比，饮水添加KDF明显降低了小鼠感染沙门菌后盲肠的病理变化程度。
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A~C.空白组小鼠盲肠组织切片；D~F.对照组小鼠盲肠组织切片；G~I.饲喂组小鼠盲肠组织切片；A、B、C.未见异常；D.黏膜层腺体基本消失，大量的炎症细胞浸润；E.黏膜层腺体基本消失，大量的炎性细胞浸润；F.未见异常；G.未见异常；H.未见异常；I.少量炎性细胞浸润(标尺=100 μm) A-C. Histological sections of cecum of mice in blank group; D-F. Histological sections of cecum of mice in control group; G-I. Histological sections of cecum of mice in feeding group; A, B, C. No abnormality; D. The mucosal glands basically disappeared, and a large number of inflammatory cells infiltrated; E. The mucosal glands basically disappeared, and a large number of inflammatory cells infiltrated; F. No abnormality; G. No abnormality; H. No abnormality; I. A small amount of inflammatory cells cell infiltration.(bar=100 μm) 图 7 KDF饮水对小鼠感染沙门菌后盲肠病理变化的影响(100×) Fig. 7 Effects of supplementation of KDF in drinking water on pathological changes of cecum after Salmonella infection in mice (100×) |
2.5.1 Alpha多样性分析和Beta多样性分析 通过对KDF饲喂组和对照组两组小鼠盲肠中物种的Alpha多样性分析和Beta多样性分析，可以得出各组物种丰富度和多样性的差异以及是否有差异物种的存在，如图 8所示。KDF组小鼠的Chao指数与对照组小鼠无显著性差异(P>0.05)，KDF组的Simpson指数显著低于对照组(P < 0.01)。其中KDF组的投影和对照组的投影重合部分较少，表明KDF组与空白组小鼠在物种组成上有差异物种存在。因此，饲喂含KDF的饲料对小鼠盲肠的物种丰富度没有影响，显著降低了小鼠盲肠中的物种多样性，并使其有差异物种存在。
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A.Alpha多样性分析；B.Beta多样性分析 A.Alpha diversity analysis; B.Beta diversity analysis 图 8 KDF对小鼠盲肠菌群Alpha多样性分析和Beta多样性分析 Fig. 8 Alpha diversity analysis and Beta diversity analysis |
2.5.2 物种组成分析 根据各个组的物种数目，制成了可以直观地展现不同组中物种组成相似性和重叠情况的Venn图，以及可以直观地反映不同组门、科和属水平上相对丰度前20的物种组成柱状图，如图 9所示。KDF组小鼠的盲肠物种丰富度下降，在门水平上，KDF组的拟杆菌门的相对丰度下降，变形菌门相对丰度显著升高(P < 0.001)。在科水平上，KDF组的多杆菌科的相对丰度显著下降(P < 0.05)。在属水平上，KDF组中的螺杆菌属、阿克曼菌属、布劳特菌属、梭菌属、乳酸杆菌属、真杆菌属等菌的相对丰度上升，瘤胃球菌的相对丰度下降。结果表明，饲喂含KDF的饲料可以降低小鼠盲肠中的物种丰富度，并且可以改变门水平、科水平和属水平部分物种的相对丰度。
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A.韦恩图；B.两组小鼠在门水平上的物种组成；C.两组小鼠在科水平上的物种组成；D.两组小鼠在属水平上的物种组成 A. Venn diagram; B. Species composition at the phylum level in the two groups of mice; C. Species composition at the family level in the two groups of mice; D. Species composition at the genus level in the two groups of mice 图 9 KDF饲喂对小鼠盲肠菌群的影响 Fig. 9 Effects of feeding with KDF on mouse cecum bacterial species |
目前细菌耐药性问题普遍，给我国和世界的养殖业及人类健康都造成了重大危害。瑞典在1986年首次禁止部分抗生素在动物饲料中的使用，欧盟也于2006年禁止在饲料中使用所有的抗生素促进剂[18]。在此背景下，我国针对畜牧养殖过程中的限抗与禁抗政策也逐步实施，给养殖业的发展带了较大挑战，因此，抗生素替代品的研究与应用尤为重要[19]。
酸化剂可按照组成方式分为有机酸化剂、无机酸化剂和复合酸化剂[20]。有机酸的经济价值较高，而且适口性也较好，不仅提升动物生长性能，还有辅助提高动物消化功能、促进动物肠道健康, 降低各种应激反应带来的损伤等作用[21]。二甲酸钾是临床上应用于饲料添加剂的有机酸之一。本研究采用微量肉汤稀释法，测量了二甲酸钾对猪场中常见病原菌的MIC，从结果可以看出，二甲酸钾在体外具有直接的抑菌效果。对细菌生长12 h后的OD600 nm和培养基的pH进行测定，发现随着二甲酸钾浓度的升高，细菌培养基的pH下降的更明显，同时抑制细菌的效果也更明显。因此，该结果证明了对环境的酸化是二甲酸钾在体外直接抑菌效果的原因之一。已有研究也表明二甲酸钾在体外对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌效果，如崔细鹏等[22]通过在体外研究发现，KDF对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果呈剂量依赖性，即KDF的浓度越高，抑制效果越明显。本研究用了15种临床常见的病原菌，包括5种革兰阳性菌，10种革兰阴性菌，其中还包括7种多重耐药菌，验证了KDF具有广泛的抑制细菌作用，同时革兰阳性菌的耐酸性略高于革兰阴性菌。因此，KDF可以通过降低细菌生长环境的pH，抑制不耐酸细菌的增殖。
在动物体内研究中，本研究以鼠伤寒沙门菌感染小鼠为感染模型，评价了KDF对肠道致病菌感染的预防效果，从体重变化、组织载菌量、炎性细胞因子和组织病理变化程度方面评价了预防感染的效果。结果表明，KDF对鼠伤寒沙门菌在体内的预防效果明显，显著降低了动物感染沙门菌后的血液和组织的载菌量、血清中炎性细胞因子水平，减轻了盲肠的病理变化程度。研究中发现，1%KDF饲喂和0.1%KDF饮水试验中NC组细胞因子检测数值存在差异，但3种细胞因子的水平趋势一致，IL-6含量最高，其次是IL-12，TNF-α含量最低，三者数量级一致，因此两次试验的数值差异可能是小鼠个体差异所致。此前，已有少数研究表明KDF可以提高动物对病原菌感染的抵抗力。例如，Suphoronski等[23]发现饲喂KDF可以降低罗非鱼在感染弗朗西斯菌后的死亡率以及白细胞的数量。∅verland等[12]发现，在肉鸡中，KDF通过减少空肠中产气荚膜梭菌数量降低坏死性肠炎的死亡率。另外，阚刘刚等[24]综述了饲用酸化剂在鸡坏死性肠炎生物性防控中的研究，本研究与这些研究结果的结论一致，进一步提供了KDF可有效预防肠道致病菌感染的直接证据。
在KDF添加方式方面，目前临床上主要在动物饲料中添加使用，在饮水中添加的应用还不普遍。本研究探索了KDF在饮水中添加对沙门菌感染的预防作用，结果发现饮水中添加0.1%KDF的抗感染效果优于饲料添加1%KDF的方式。这种现象与另一项研究的结论相似，郭志有等[25]研究表明，饮水和饲料中添加KDF均可提高肉鸡的生长性能，且饮水的方式效果更明显。此外，在饮水中添加KDF可以减少添加量，从而节约成本，利用饮水装置也可以减少添加KDF的工作难度，因此饮水添加KDF的方式在临床上值得推广。
为探究添加KDF对动物肠道菌群的影响，本研究采用16S rRNA基因高通量测序方法分析了KDF饲喂组和对照组小鼠的盲肠内容物微生物组成的组间差异。分析结果表明，KDF显著降低了小鼠盲肠中的物种丰富度和多样性。正常动物的肠道内拟杆菌门和厚壁菌门保持在一定的比例，厚壁菌门和拟杆菌门占小鼠盲肠中微生物三分之二以上，当拟杆菌门的相对丰度下降或厚壁菌门的相对丰度升高，有利于动物更有效地吸收热量[26]。在本研究中，小鼠盲肠中拟杆菌门的相对丰度有下降的趋势，可能有利于动物更有效地吸收热量从而减少热量的损失，可能有助于动物的生长。在属水平，KDF改变了一些有益菌的丰富度。瘤胃球菌可以降解膳食纤维并将其转为短链脂肪酸(SCFA)，影响动物的能量代谢，被认为是一种有益菌[27-28]。在饲喂KDF后，其相对丰度下降，但另一些益生菌的相对丰度升高，如阿克曼菌、布劳特菌、乳酸菌等。阿克曼菌被认为是一种很有前途的益生菌，在改善宿主代谢方面具有重要价值[29]。乳酸杆菌在维持微生态的平衡、免疫调节等方面起着重要作用，还可以产生短链脂肪酸、维生素等[30]。饲喂KDF后小鼠盲肠中阿克曼菌和乳酸菌的相对丰度升高，可能有利于动物的营养代谢和免疫力的维持。布劳特菌可以介导抗炎作用，在动物发生炎症时，可以起到抑制炎症的作用[31]，真杆菌被认为是新一代潜在的有益微生物，该属的一些成员可以产生丁酸盐，可以在抑制肠道炎症中起到关键作用[32]。KDF可能通过增加布劳特菌和真杆菌的丰度起到抗炎的作用。本研究在模式动物小鼠体内已经明确了饮水中添加KDF对肠道菌群的有益影响，未来将继续在家畜和家禽等养殖动物中去探究在饲料或饮水中添加KDF对肠道健康的影响。
4 结论KDF在体外具有广谱的抗菌效果，与其对培养环境pH的降低有直接关系。KDF饮水和饲喂添加显著降低了小鼠感染鼠伤寒沙门菌后盲肠、血液的细菌载量及血清中的炎性细胞因子水平，并显著减轻了盲肠的病变程度，这些结果为KDF在临床上预防肠道病原菌感染的应用提供了理论依据。同时，KDF改变了动物肠道微生物的菌群多样性和相对丰度，部分有益菌的相对丰度升高，可能在KDF促进动物生长代谢和提高病原抵抗力方面起积极作用。
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(编辑 范子娟)