鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum，MG)主要感染鸡，可引起鸡慢性呼吸道疾病(CRD)^[1]。MG可垂直传播和水平传播^[2]，易与传染性支气管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)等病原发生混合感染而产生致病协同效应，给养鸡业造成较大经济损失^[3-4]。因此，加强鸡场MG的日常监测并建立快速、有效的检测方法对MG的防控和净化具有重要意义。

ELISA方法操作简单，可批量检测，具有敏感性强、结果可量化等优点，在MG临床诊断中应用较广泛，一些研究使用完整或超声裂解后MG培养物作为全细胞抗原建立检测MG抗体的间接ELISA方法或斑点印记ELISA方法^[5-6]；任娟等^[7]借助针对MG的单抗和多抗建立了夹心ELISA方法，但只能针对抗原作出检测。目前，国内MG抗体检测依赖进口的商品化ELISA试剂盒，检测成本较高，在全球新冠肺炎疫情的大背景下到货时间不确定，难以大规模推广应用。HI试验特异性强、诊断准确，常用于复核快速血清凝集试验(rapid serum agglutination, RSA)或ELISA检测结果^[8]。为了提高间接ELISA检测的特异性，国内外学者开始利用MG表面膜蛋白作为包被抗原建立ELISA方法。PvpA蛋白被作为包被抗原建立了检测MG抗体的间接ELISA方法，特异性良好，但其稳定性有待改善^[9]；王莉莉^[10]建立了基于热休克蛋白家族P60蛋白的间接ELISA检测方法，但与商品化试剂盒的符合率不高(90%以下)。

MG的可变脂蛋白血凝素(VlhA)是MG的一种细胞黏附蛋白，与MG的发病机制和免疫应答密切相关^[11]，Mardassi等^[12]将MG VlhA蛋白家族的pMGA1.2蛋白(经比对即为本研究VlhA3.03蛋白)与其他抗原结合建立了区分MG、滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae，MS)和火鸡支原体感染的间接ELISA方法，但敏感性较低；陈玥彤等^[13]的试验结果表明，VlhA3.03可以作为MG抗体检测的候选靶标抗原，但未再有基于VlhA3.03蛋白抗体检测方法的报道。本研究以基因工程表达的重组VlhA3.03蛋白作为包被抗原，建立了检测MG抗体的rVlhA-ELISA方法，结合HI试验，为MG感染的临床监测提供一套有效的组合技术方案。

1 材料与方法 1.1 主要试剂

异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；GST融合蛋白纯化试盒购自南京金斯瑞生物科技有限公司；TMB双组分显色液和HRP标记兔抗鸡IgG购自美国Thermo Fisher Scientific公司；鸡毒支原体抗体检测试剂盒购自美国IDEXX公司(以下简称：IDEXX-MG)；牛血清白蛋白购自上海双洳生物有限公司；细菌基因组DNA试剂盒购自康为世纪生物有限公司。

1.2 生物材料

MG标准强毒株R_low株(保藏号：CVCC1651)购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心；MG临床分离株SH/2020-1为本实验室分离并保存；SPF鸡购自斯派福瑞禽业有限公司；H5、H7、H9亚型AIV阳性血清、新城疫病毒(NDV)阳性血清、传染性喉气管炎病毒(ILTV)购自青岛易邦生物工程有限公司；MS、副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum，A. paragallinarum)、IBV、MG、肠炎沙门菌(Salmonella Enteritidis，S. Enteritidis)、大肠杆菌(Escherichia coli，E. coli)、A型多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，P. multocida)阳性血清和SPF鸡阴性血清为本实验室制备并保存。120份MG抗体阳性的临床血清样品为从养殖场采集，经IDEXX-MG方法检测确定抗体滴度。

1.3 rVlhA重组蛋白的表达与鉴定

1.3.1 目的基因扩增 　　根据MG强毒株R_low的vlhA3.03基因序列(GenBank：AE015450.2)，TGA在支原体中编码色氨酸，在大肠杆菌中为终止密码子，故将TGA突变为TGG(图 1)，在目的片段两端分别添加酶切位点EcoRⅠ和XhoⅠ，使用软件Oligo7设计特异性引物(表 1)。提取MG Rlow株基因组DNA后对vlhA3.03进行分段扩增，再以1F/4R为引物进行Overlap PCR扩增获得完整vlhA3.03片段。PCR反应条件：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，52~57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。

1.3.2 重组蛋白诱导表达及条件优化 　　将vlhA3.03基因PCR扩增产物通过EcoRⅠ和Xho Ⅰ双酶切克隆入载体pGEX-6p-1，经PCR及双酶切鉴定为阳性的克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。将重组质粒转化到E. coli BL21感受态细胞，IPTG终浓度分别设置为0.3、0.5、0.7 mmol·L^-1，分别在25、30、37 ℃诱导5 h，通过SDS-PAGE检测重组蛋白VlhA3.03(rVlhA)表达情况。

1.3.3 重组蛋白的纯化和鉴定 　　以“1.3.2”中摸索的最佳条件，大量诱导表达rVlhA蛋白，使用GST融合蛋白纯化试剂盒进行纯化；以MG阳性血清为一抗，兔抗鸡IgG为二抗，进行Western blot(WB)试验鉴定重组蛋白。

1.4 检测MG抗体的间接ELISA方法的建立

1.4.1 抗原最适包被浓度及血清最适稀释度的确定 　　将rVlhA蛋白包被液从8 mg·L^-1倍比稀释至0.062 5 mg·L^-1；MG阳性血清进行1∶125~1∶4 000倍比稀释，阴性血清做同样处理。通过棋盘滴定法，选取阳性血清OD_{450 nm}值大于1.0，阴性血清OD_{450 nm}值小于0.2，且P/N值$ (\frac{{{\rm{标准阳性血清O}}{{\rm{D}}_{{\rm{450}}\mathrm{~nm}}}{\rm{值}}}}{{{\rm{标准阴性血清O}}{{\rm{D}}_{{\rm{450}}\mathrm{~nm}}}{\rm{值}}}})$较大的组合，确定为最适抗原包被浓度和血清稀释倍数。

1.4.2 间接ELISA工作条件的优化 　　分别用含1% BSA-PBST、5% BSA-PBST、5%脱脂奶-PBST和5%明胶-PBST作为封闭液，每孔300 μL，37 ℃分别封闭1、2、3、4 h，用于确定合适的封闭液种类和封闭时间；选择0.2% BSA-PBST、0.5% BSA-PBST、PBST和PBS(0.01 mol·L^-1、pH 7.4)，每孔100 μL，37 ℃反应30 min，用于确定一抗最适稀释液；使用一抗最适稀释液将酶标二抗进行1∶5 000~ 1∶20 000倍比稀释，按照每孔100 μL加入酶标板中，37 ℃反应30 min，以确定酶标二抗的最佳稀释倍数；底物显色时37 ℃避光分别反应5、10、15 min以确定最佳显色时间。

1.4.3 临界值的确定和终点滴度方程的建立与验证 　　借鉴Snyder等^[14-15]建立的单一血清稀释ELISA方法，收集MG阴阳性血清样品各25份，将阴性血清混合为阴性血清池，对血清进行1∶125~1∶256 000同步倍比稀释，每份血清设置两个重复，以每块酶标板阴性血清不同稀释倍数处OD_{450 nm}的平均值与3倍标准差之和(x+3s)构建PNT基线。统计阳性血清样品在不同稀释倍数下的OD_{450 nm}平均值，与PNT基线交点的最大稀释倍数定义为该血清样品的抗体终点滴度；计算阳性血清最适稀释度下的S/P值$ \left(\frac{\text { 待检血清样品 } \mathrm{OD}_{450 \mathrm{~nm}} \text { 值 }-\mathrm{MG} \text { 标准阴性血清 } \mathrm{OD}_{450 \mathrm{~nm}} \text { 值 }}{\mathrm{MG} \text { 标准阳性血清 } \mathrm{OD}_{450 \mathrm{~nm}} \text { 值 }-\mathrm{MG} \text { 标准阴性血清 } \mathrm{OD}_{450 \mathrm{~nm}} \text { 值 }}\right)$，建立关于血清抗体终点滴度与S/P值的回归方程，建立的ELISA方法命名为rVlhA-ELISA方法。此外，计算阴性血清最适稀释度下的x+3s值，换算为S/P值，确定阴、阳性临界值。使用rVlhA-ELISA方法和经典倍比稀释法分别测定20份阳性血清和20份阴性血清，比较两种方法测得血清抗体滴度，验证回归方程准确性。

1.4.4 特异性试验 　　利用rVlhA-ELISA方法分别对MS、NDV、IBV、AIV(H5、H7、H9)、ILTV、S. Enteritidis、E. coli、P. multocida和A. paragallinarum单因子阳性血清进行检测，设MG阳性血清、SPF鸡阴性血清作为对照，计算S/P值，分析特异性。

1.4.5 灵敏度试验 　　用rVlhA-ELISA方法和IDEXX-MG分别检测1∶125、1∶250、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000倍比稀释的参考阳性血清，比较两种方法的检测灵敏度。

1.4.6 重复性试验 　　使用同批次/不同批次酶标板检测5份阳性血清和阴性血清分别进行批内/批间重复性试验，每份血清样品都重复3次。读取每份样品OD_{450 nm}值并计算S/P值的平均值、标准差和变异系数。

1.4.7 保存期试验 　　将酶标板以3种方式处理保存：a)真空包装后4 ℃保存；b)真空包装并添加干燥剂4 ℃保存；c)用铝箔自封袋真空包装并添加干燥剂4 ℃保存。每隔一个月，使用相同的阴、阳性血清进行平行检测，确定最佳保存条件。

1.5 检测MG抗体的血凝抑制(HI)试验

选择MG分离株SH/2020-1，参照文献方法制备HI试验抗原和进行HA、HI试验^[16-18]。使用该方法检测收集的90份阳性血清和75份SPF鸡阴性血清，通过MedCalc绘制ROC曲线和交互式点状分布图并进行分析，确定HI试验结果的判定标准。

1.6 检测MG抗体的两种血清学方法的临床应用

采集两批鸡群不同日龄的血清和腭裂拭子样品，使用建立的rVlhA-ELISA、HI检测方法和IDEXX-MG持续监测鸡群血清抗体，比较不同血清学方法检测MG抗体的一致性；使用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法^[19]检测上述日龄对应的腭裂拭子样品，比较不同检测方法的阳性率。

2 结果 2.1 rVlhA重组蛋白的表达与纯化

2.1.1 vlhA3.03目的片段的扩增及重组质粒的酶切鉴定 　　利用4对vlhA3.03特异性引物，成功突变3个位点，经Overlap PCR扩增得到完整vlhA3.03产物(图 2A)。使用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ对重组质粒进行双酶切鉴定，分别出现载体(4 984 bp)和vlhA3.03全长(1 938 bp)相应大小条带(图 2B)。

2.1.2 重组蛋白的纯化和鉴定 　　经IPTG诱导，超声裂解后收集上清和沉淀，通过SDS-PAGE鉴定rVlhA蛋白的表达情况。rVlhA蛋白大小在96 ku左右，最终确定的最佳诱导表达条件是IPTG终浓度是0.3 mmol·L^-1，37 ℃诱导5 h，蛋白以上清形式表达。纯化rVlhA蛋白后以MG阳性血清作为一抗，HRP标记的兔抗鸡IgG抗体作为二抗，SDS-PAGE和Western blot鉴定后特异性条带大小符合预期(图 3)。

2.2 检测MG抗体的间接ELISA方法

2.2.1 抗原最适包被浓度及血清最适稀释度 　　根据棋盘滴定法结果，抗原最适包被浓度为0.5 mg·L^-1，血清最适稀释倍数为1∶500，P/N值为13.18。

2.2.2 间接ELISA最适工作条件 　　经优化，抗原最适封闭条件为5%脱脂奶-PBST，37 ℃封闭3 h；一抗最适稀释液为0.2% BSA-PBST；酶标二抗最适工作浓度确定为1∶10 000，底物显色时间为15 min(37 ℃避光反应)。

2.2.3 阴阳性临界值和终点滴度方程 　　将阴性血清池和30份阳性血清倍比稀释，构建PNT基线，确定各阳血清样品的抗体终点滴度，计算阳性血清1∶500稀释度下的S/P值，建立关于血清抗体滴度与1∶500血清稀释度处S/P值的回归方程lg(抗体滴度)=1.257×lg(1∶500处S/P值)+3.709(图 4)，R²=0.9 176。同时，求出1∶500处的阴性血清S/P值(0.32)作为阴、阳性临界值，代入回归方程算出临界滴度为1 200。rVlhA-ELISA方法和经典倍比稀释法测得的血清抗体滴度基本一致，回归方程较准确(表 2)。

2.2.4 特异性 　　设MG阳性、SPF阴性血清作为对照，计算待检血清的S/P值，MS、NDV、IBV、AIV (H5、H7、H9)、ILTV、S. Enteritidis、E. coli、P.multocida和A.paragallinarum阳性血清S/P值均在临界值0.32以下，具有良好的特异性。

2.2.5 灵敏度 　　rVlhA-ELISA方法最低可检测到1∶2 000稀释的阳性血清样本，IDEXX-MG最低可检测到1∶1 000(图 5)。

2.2.6 重复性 　　使用同一批次/不同批次包被的酶标板分别检测5份阳性血清样品和5份阴性血清样品，批内变异系数为0.4%~7.9%，批间变异系数为1%~9.6%，均小于10%，重复性较好。

2.2.7 保存期 　　选择铝箔自封袋真空包装并添加干燥剂4 ℃条件(方式c)保存酶标板，可以稳定保存6个月，其余方式保存有效期均不超过3个月(图 6)。

2.3 检测MG抗体的HI试验

使用建立的HI试验检测阳性血清样品和阴性血清样品，通过统计学软件MedCalc制备ROC曲线并绘制交互式点状分布图，ROC曲线线下面积(AUC)=0.999，结合交互式点状分布图，确定HI试验结果的判定标准：HI滴度在1∶80及以上判定为阳性；1∶40~1∶80判定为疑似；1∶40以下判定为阴性(图 7)。

2.4 临床应用

rVlhA-ELISA方法和IDEXX-MG检测的血清抗体滴度趋势一致，符合率为96.61%(图 8，表 3)。1日龄时rVlhA-ELISA方法与IDEXX-MG检测阳性率分别为76.67%和86.67%，HI试验复核阳性率为50%，但RT-qPCR结果为阴性。26日龄时，rVlhA-ELISA方法、IDEXX-MG及HI试验结果均为阴性，RT-qPCR阳性率为13.33%。48日龄时，rVlhA-ELISA方法检测结果为阴性，IDEXX-MG检出一份阳性样品，HI试验复核结果为阴性，RT-qPCR阳性率为6.67%。62日龄时，rVlhA-ELISA方法、IDEXX-MG阳性率分别为13.79%和17.24%，HI试验复核结果为13.79%，RT-qPCR阳性率升高(53.33%)。90日龄时，rVlhA-ELISA方法、IDEXX-MG检测阳性率均在96%以上，HI试验复核结果为89.29%，RT-qPCR阳性率进一步升高(63.33%)。97日龄时，3种血清学检测方法阳性率均达100%，RT-qPCR阳性率下降到30%。

rVlhA-ELISA方法与HI复核结果符合率为93.79%，联合判定结果与IDEXX-MG符合率为91.53%(表 3)。

3 讨论

近年来，规模化养殖场防控措施越来越严格，但MG感染问题依然普遍，且大部分为隐性感染，增加了MG垂直传播和与其他病原混合感染的风险。美国农业部国家家禽改良计划(US Department of Agriculture National Poultry lmprovement Plan, NPIP)要求鸡场采用ELISA对鸡群MG感染情况进行初筛，随后用HI试验或分子学方法进行复核^[20]。与野毒感染产生的高水平血清抗体相比，ELISA方法只能检测到低水平的疫苗株抗体^[21-22]；在对鸡群MG血清抗体的长期监测中，若出现抗体异常升高，则表明鸡群极大可能出现了MG感染。

本研究以原核表达的MG重组VlhA3.03蛋白作为包被抗原，建立了检测MG抗体滴度的rVlhA-ELISA方法，与呼吸道常见病原阳性血清不发生反应，具有良好的重复性；在4 ℃条件下，可至少保存6个月，这有助于该方法的标准化及大规模应用。单一血清稀释法ELISA可显著降低试剂成本和操作时间，减少血清连续稀释固有的误差，吸光度对数与抗体滴度对数存在较高的线性关系，已被证明并用于一些动物各种病毒性疾病的快速血清学分析^{[14-15, 23-27]}。利用本研究建立的回归方程计算待检血清1∶500稀释度下的S/P值即可得到相应的抗体滴度。

在rVlhA-ELISA和HI试验方法的临床应用中，由于鸡群母源抗体的存在，鸡群1日龄血清学方法检测阳性率均在50%以上，在前3周迅速下降，并维持到48~62日龄，随后逐渐升高，在90~97日龄到达高峰。rVlhA-ELISA与HI复核结果符合率达93.79%，联合判定结果与IDEXX-MG总符合率达91.53%，进一步表明将rVlhA-ELISA与HI试验组合作为临床筛查MG感染方案的可行性。根据腭裂拭子RT-qPCR检测结果可知，该鸡群最晚在26日龄发生MG感染，3周后血清抗体才开始检出阳性，这与疾病发生发展规律相符，客观上表明与病原检测相比，血清学检测存在一定滞后性；这提示在临床监测中若需要第一时间发现野毒感染，在条件允许的情况下可同时配合RT-qPCR方法进行检测。此外，由监测结果可知，尽管ELISA方法与HI试验得到的抗体消涨规律一致，但ELISA方法较HI试验更灵敏，这也与此前相关研究报道一致^[28-29]。

综上所述，本研究建立的rVlhA-ELISA和HI检测方法具有较好的临床应用价值，若未来我国也将MG纳入家禽改良计划，便可及时提供一套用于MG野毒感染的临床大规模、快速筛查的组合技术方案，对规模化鸡场MG感染的监测、防控具有重要意义。

4 结论

以原核表达的VlhA 3.03重组蛋白(rVlhA)作为包被抗原建立了一种检测MG抗体的间接ELISA方法，构建了关于血清抗体滴度与1∶500血清稀释度处S/P值的回归方程。选择国内MG分离株作为血凝抑制抗原建立HI试验方法。使用rVlhA-ELISA方法联合HI试验检测临床血清样品，与商品化试剂盒IDEXX-MG符合率为91.53%。该研究结果可为MG感染临床大规模、快速筛查提供有效的组合技术方案，为MG的监测和净化提供科学工具。