牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus, BRSV)属于肺病毒科(Pneumoviridae)正肺病毒属(Orthopneumovirus)，是引起牛呼吸道疾病综合征(bovine respiratory disease complex, BRDC)的重要病原[1]。牛是BRSV的天然宿主，但也有关于感染绵羊、马和猪等动物的报道[2]。牛在感染BRSV后主要表现为发烧、咳嗽、流鼻涕和呼吸困难等呼吸道症状，还能引起牛的繁殖障碍和免疫抑制[3-4]。自1967年首次发现以来，BRSV已在世界范围内广泛流行[5-6]，欧洲许多国家将BRSV与牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhoea virus，BVDV)和牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)列为危害养牛业发展的3大重要病原体[7]。在GenBank中，自中国分离的BRSV毒株主要有6条，其中，DQ毒株(GenBank登录号：MT861050)是2018年在我国黑龙江省首次发现的基因Ⅲ亚群毒株，该毒株在黑龙江省的部分肉牛场造成了急性呼吸道疾病[8]。剩余的5条基因组(GenBank登录号：OP137030~OP137034)是由本实验室最近上传的，5条基因组均属于Ⅲ亚群，分别来自于四川、内蒙古、宁夏、甘肃和山西5个省份。
BRSV是一种有囊膜不分节段的单股负链RNA病毒。基因组长度为13 416~15 151 bp，编码11种蛋白，包括小疏水蛋白(SH)、融合蛋白(F)、附着糖蛋白(G)、核衣壳蛋白(N)、病毒RNA依赖聚合酶蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、转录抗终止因子(M2-1)、RNA调节蛋白(M2-2)和2种非结构蛋白(NS1和NS2)。其中，F蛋白和G蛋白是BRSV主要的表面糖蛋白，F蛋白能够促使病毒穿入宿主细胞，使受感染细胞与邻近细胞之间发生膜融合形成合胞体，还能够刺激机体产生中和抗体[8-11]。G蛋白为Ⅱ型糖基化的跨膜糖蛋白，是BRSV变异最大的蛋白，负责与宿主细胞表面的受体结合，参与病毒与宿主细胞的吸附过程，G蛋白是重要的保护性抗原，其刺激机体产生的抗体能够阻断病毒与细胞的结合，在宿主抵抗感染的过程中发挥重要作用[12]。曾有研究采用N和F蛋白的核苷酸序列进行BRSV亚群的分类[13]，但随后证实G基因核苷酸的进化率更高，更有利于BRSV的亚群的分类[14-15]。根据G基因核苷酸序列的遗传进化分析，可将其分为Ⅰ~Ⅹ10个亚群，不同亚群之间的抗原性存在差异[6, 16]，并且不同亚群的毒株之间具有明显的地域分布特征[17]：Ⅰ亚群毒株主要分布于英国和瑞士[18]；Ⅱ亚群毒株分布于比利时、法国、丹麦、瑞典、日本[19]；Ⅲ亚群毒株分布于美国、中国、意大利和土耳其等国家[5, 8]；Ⅳ亚群毒株分布于德国、比利时、丹麦等欧洲国家和美国[14]；Ⅴ和Ⅵ亚群毒株分布于法国和比利时[14]；Ⅶ和Ⅷ亚群毒株分布于意大利和克罗地亚地区[6]；Ⅸ亚群毒株分布于巴西[20]；第Ⅹ亚群毒株分布于日本[21]。
2009年，国内学者在患有BRDC牛的鼻液中分离到BRSV，证实了该病毒在中国的存在[22]，随后的研究表明BRSV在我国具有较高的血清阳性率和广泛的地域分布[23-25]。对辽宁、山东、黑龙江、宁夏和内蒙古等地区患有BRDC牛群中的病原学调查显示，BRSV的阳性率为6.95%~61.2%, 不同地区的检出率存在差异[26-28]。牦牛是我国青藏高原地区特有的经济动物，是当地人民不可或缺的生产和生活物资[29]。近年来，牦牛的集约化养殖发展迅速，BRDC在牦牛中的发病率也逐步上升，关于牦牛中BRDC的病原流行病学资料较少；目前已在患有BRDC的牦牛中鉴定出IBRV、BVDV、牛冠状病毒(bovine coronavirus，BCoV)和牛副流感3型病毒(bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3)等病毒[30-32]，但是还没有关于BRSV在牦牛中感染与流行情况的报道。因此，本研究的目的是调查BRSV是否在牦牛中存在及其在患有呼吸道疾病牦牛中的分子流行情况，为牦牛BRDC的防控提供参考。
1 材料与方法 1.1 样本采集2021年3月―2022年7月，在四川省甘孜藏族自治州(甘孜州)和阿坝藏族羌族自治州(阿坝州)的10个牦牛场中采集了122份患有呼吸道疾病牦牛的深部鼻腔棉拭子，91份样本采集自甘孜州的7个场，31份样本采集自阿坝州的3个场。病牛为6月龄以内的牦牛，主要表现为发烧、流鼻涕、咳嗽和呼吸困难等症状。所有的样本均在无菌采集后低温保存运输，置于15 mL EP管中，-80 ℃冰箱保存。
1.2 主要试剂TrizolTMReagent、Prime scriptTM反转录试剂盒、Premix Ex Taq(Probe qPCR)等购于宝生物工程(大连)股份有限公司；pClone007载体、DH5α感受态细胞等购于擎科生物科技有限公司；Gel Extraction Kit和质粒提取试剂盒均购自OMEGA BIO-TEK公司；POCKITTM智能型核酸分析仪等由金瑞鸿捷(厦门)生物科技有限公司提供。
1.3 核酸提取和cDNA的合成在样本中加入5 mL含有双抗的PBS溶液涡旋混匀，8 000 g离心10 min取上清备用；将处理好的上清液经0.22 μm的滤器过滤后，用Trizol法提取样本上清液中的总RNA，反转录为cDNA作为模板。
1.4 BRSV病毒的检测BRSV的检测采用本实验室建立的RT-iiPCR方法[33]，该方法经过特异性和重复性验证，检测下限为3.45 copes·μL-1，引物和探针序列见表 1，反应总体系为50 μL：Premix Ex Taq预混酶24 μL，10 μmol·μL-1的探针0.15 μL，10 μmol·μL-1的上、下游引物各3 μL，模板1 μL，使用DEPC H2O补足50 μL。
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表 1 扩增BRSV的全基因引物 Table 1 Primers used for PCR amplification of the BRSV genome |
根据GenBank中BRSV全部的G和F基因，分别设计了1对引物用于扩增完整的G和F基因(表 1)。所有扩增产物经过纯化后克隆到pClone007载体中，再转入DH5α感受态细胞，增菌后送往上海生工生物科技有限公司成都分公司测序。
1.6 基因组的扩增根据GenBank中BRSV的基因组序列，设计了10对引物(表 1)用于BRSV全基因组的扩增。所有的PCR产物经纯化后连接到pClone007载体中再转入DH5α感受态细胞中，测序后采用Seqman进行序列拼接，并使用ORF finder寻找开放阅读框http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html。
1.7 序列分析及分型采用DNAStar的MegAline程序进行序列的相似性分析。利用MEGA 7.0.26软件进行多重序列比对，并采用邻近法构建系统发育树，重复引导值设定为1 000，利用RDP 4.39程序进行基因重组分析。
2 结果 2.1 BRSV的检测在122份鼻拭子样本中BRSV的平均阳性率为64.75%(79/122)，其中，甘孜州牦牛样本的阳性率为73.63%(67/91)，阿坝州牦牛样本的阳性率为38.71%(12/31)；场阳性率为100%(10/10)。
2.2 G基因的分子特征在10个BRSV阳性场的临床样本中扩增出了10条完整的牦牛源BRSV G基因(GenBank登录号：OP609672~OP609681)，10条完整的G基因全长792 bp, 共编码264个氨基酸。本研究的10条G基因之间的核苷酸相似性为98.4%~99.5%，氨基酸相似性为99.2%~99.6%；与GenBank中Ⅲ亚群的毒株相比核苷酸相似性为87.1%~99.5%，氨基酸相似性为80.2%~99.6%。与10条G基因相似性最高的毒株为BO/SX1-G/21/CH(GenBank登录号：OP137024)，该毒株是由本实验室最近在山西患有BRDC的肉牛鼻拭子样本中扩增而来。与GenBank中其他的Ⅲ亚群的参考毒株相比，将本研究的10条牦牛源BRSV G基因与本实验室最近上传的18条肉牛源BRSV G基因(GenBank登录号：OP137017~OP137034)有5个相同的氨基酸位点突变(H100Y、S105R、L180S、P198L、N251D)；与中国的DQ毒株(GenBank登录号：MT861050和MN316655)相比，牦牛源的10条G蛋白还与18条肉牛源的G蛋白共享有18个连续的核苷酸插入(位于USII/S1毒株的nt 5 465―5 483)，导致了G蛋白羧基末端6个氨基酸的连续插入。此外，10条牦牛源BRSV的G蛋白和18条肉牛源BRSV的G蛋白与中国的DQ毒株(GenBank登录号：MT861050和MN316655)的G蛋白相比共有30个共同的氨基酸突变(I24L、T41M、F90S、K93R、H100Y、R104Q、S105R、P125S、T126A、E128D、L130Q、P140L、T142A、P147S、I165L、L168S、L169P、Y170H、E177K、L180S、K187Q、L198P、L202P、I215T、L229P、R232K、I237T、P245S、P246L、N251D)(图 1)。进一步分析显示，不同地域来源的牦牛源G蛋白序列没有独特的氨基酸突变。
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红框. 代表与DQ毒株G蛋白对比，本研究牦牛源BRSV的G蛋白与本实验室最近上传的肉牛源的G蛋白序列共同的氨基酸突变；黑框. 代表对比DQ毒株G蛋白，本研究牦牛源BRSV的G蛋白与本实验室最近上传肉牛源的G蛋白共同的氨基酸插入；蓝框. 代表本研究牦牛源毒株的G蛋白 The red boxes represent the amino acid mutations in the G protein sequences of the BRSV strain from yaks in this study and the G protein of the beef cattle origin BRSV strain recently uploaded in our laboratory compared to the G protein of the DQ strain; The black boxes represent the amino acid insertions in the G protein of the BRSV from yaks in this study and the G protein of the beef cattle origin BRSV recently uploaded in our laboratory compared to the G protein of the DQ strain; The blue boxes represent the G proteins of the strains from yak in this study 图 1 本研究牦牛源BRSV毒株与其他中国毒株之间G蛋白氨基酸序列的多重序列比对结果 Fig. 1 The results of multiple sequence alignment of G protein amino acid sequences between the strains of BRSV of yak origin and other Chinese strains in this study |
基于GenBank中所有完整G基因的核苷酸序列采用邻近法构建系统发育树发现：本研究的10条牦牛源BRSV的G基因和本实验室最近上传的18条肉牛源的G基因共同与美国的Ⅲ亚群毒株USII/S1(GenBank登录号：KU159366)和BRSV\KS7\2021(GenBank登录号：OM328114)聚为一个大分支，证实本研究毒株为BRSV的基因Ⅲ亚群毒株(图 2)，而与同为基因Ⅲ亚群的中国DQ毒株(GenBank登录号：MT861050和MN316655)处于不同的两个分支。
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采用MEGA 7.0软件对序列进行对比分析，采用邻近法构建系统发育树(1 000个重复)。▲代表本研究中BRSV毒株的10株G基因序列，■代表本实验室最近上传的毒株的G基因序列，◆代表中国的DQ毒株的G基因序列 Sequences were compared and clustered by MEGA 7.0 software, The phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining method (1 000 replicates). ▲ represents 10 G gene sequences of BRSV strains from this study, ■ represents the G gene sequences of previously amplified strains in our laboratory, ◆ represents G gene sequences of DQ strain in China 图 2 基于完整的G基因核苷酸序列构建的系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic tree based on the nucleotide sequences of complete G gene |
在9个BRSV阳性场的临床样本中扩增出了9条完整的BRSV牦牛源的F基因(GenBank登录号：OP609673和OP609682~OP609689)，9条完整F基因的全长1 710 bp，共编码570 aa。本研究9条完整F基因之间的核苷酸相似性为99.3%~99.7%，氨基酸相似性为99.7%~100%；与GenBank中所有完整的F基因相比核苷酸相似性为85%~99.5%，氨基酸相似性为88.3%~99.8%。与9条F基因相似性最高毒株的登录号为OP137000~OP137004，这些毒株是本实验室近期在国内多个省份患有BRDC的肉牛鼻拭子样本中扩增而来。与GenBank数据库中所有完整的F蛋白相比，9条牦牛源的F基因和本实验室最近上传的25条肉牛源的F基因(GenBank登录号：OP136997~OP137016和OP137030~OP137034)发生了相同的起始密码子突变(ATG-ACG)导致编码区15个核苷酸的连续缺失(位于USII/S1毒株的nt 5 557―5 572)，引起F蛋白氨基末端连续5个氨基酸的缺失(位于USII/S1毒株F蛋白的1―5 aa)(图 3)。此外，本研究的9条牦牛源的F蛋白和25条肉牛源的F蛋白与中国的DQ毒株(GenBank登录号：MT861050和MN316656)相比共有5处相同的氨基酸位点突变(K85R、T111L、T118A、N385D和V462L)。进一步分析显示，不同地域来源的牦牛源F蛋白序列没有独特的氨基酸突变。
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橙色框. 代表对比GenBank中所有完整的F蛋白，本研究牦牛源BRSV的F蛋白与本实验室前期上传的肉牛源的F蛋白在氨基端的氨基酸缺失；蓝框. 代表本研究牦牛源毒株的F蛋白 The orange boxes represent the amino acid deletion at the amino terminus of the F protein of the yak origin BRSV and the F protein of the beef cattle origin BRSV recently uploaded in our laboratory in this study compared to all complete F proteins in GenBank; the blue boxes represent the F protein of the strain from yak in this study 图 3 本研究牦牛源BRSV的F蛋白与GenBank中所有完整的F蛋白之间氨基酸序列的多重序列比对结果 Fig. 3 The multiple sequence alignment results between the amino acid sequence of the F protein of BRSV of yak origin and all complete F proteins in GenBank |
基于GenBank中所有完整F基因的核苷酸序列采用邻近法构建系统发育树发现：本研究的9条牦牛源F基因和本实验室最近上传的25条肉牛源的F基因共同与美国的Ⅲ亚群毒株USII/S1(GenBank登录号：KU159366)和BRSV\KS721(GenBank登录号：OM328114)聚为一个大分支，证实牦牛源毒株为BRSV的基因Ⅲ亚群毒株(图 4)，与中国的DQ毒株(GenBank登录号：MT861050和MN316656)则处于不同的两个分支。
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采用MEGA 7.0软件对序列进行对比分析，采用邻近法构建系统发育树(1 000个重复)。▲代表本研究中BRSV毒株的9株F基因序列，■代表本实验室先前扩增的毒株，◆代表中国的DQ毒株(MT861050 and MN316656) Sequences were compared and clustered by MEGA 7.0 software, The phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining method (1 000 replicates). ▲ represents 9 F gene sequences of BRSV strains from this study, ■ represents the previously amplified strains in our laboratory, ◆ represents DQ (MT861050 and MN316656) strain in China 图 4 基于完整的F基因的核苷酸序列构建的系统发育树 Fig. 4 Phylogenetic tree based on the nucleotide sequences of the complete F gene |
成功扩增出了1条完整的牦牛源BRSV全基因组(GenBank登录号：OP609672)，命名为YAK/SWUN-1/21/CH，基因组全长为15 143 bp。与GenBank中全部18条BRSV基因组的核苷酸相似性为73.7%~99.1%，氨基酸相似性为85.2%~99.3%；与全部8个Ⅲ亚群的基因组核苷酸相似性为95.6%~99.1%，氨基酸相似性为96.5%~99.3%。与YAK/SWUN-1/21/CH相似性最高的毒株为本实验室近期上传的5条BRSV的基因组(GenBank登录号：OP137030~OP137034)，5条基因组是由本实验室在近期从5省份患有BRDC的肉牛鼻拭子样本中扩增而来的。与GenBank中所有的BRSV基因组相比，YAK/SWUN-1/21/CH有6个独特的氨基酸位点的突变：N蛋白(E108K、T169N和D175E)，SH蛋白(S5F)和L蛋白(F354Y和D683E)。
基于GenBank中所有BRSV基因组的核苷酸序列采用邻近法构建系统发育树发现：YAK/SWUN-1/21/CH与本实验室最近上传的5条肉牛源的基因组(GenBank登录号：OP137030~OP137034)共同与美国的Ⅲ亚群毒株USII/S1(GenBank登录号：KU159366)和BRSV\KS721(GenBank登录号：OM328114)聚为一个大分支，证实牦牛源毒株为BRSV的基因Ⅲ亚群毒株(图 5)，与中国的DQ毒株(GenBank登录号：MT861050)则处于不同的两个分支(图 5)。在YAK/SWUN-1/21/CH中未发现有重组事件。
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采用MEGA 7.0软件对序列进行对比分析，采用邻近法构建系统发育树(1 000个重复)。▲代表本研究中BRSV毒株的全基因组序列，■代表本实验室先前扩增的全基因组序列，◆代表中国DQ毒株的全基因组序列 Sequences were compared and clustered by MEGA 7.0 software, the phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining method (1 000 replicates). ▲ represents genome sequences of BRSV strains from this study, ■ represents the previously amplified strains in our laboratory, ◆ represents DQ strain in China 图 5 基于全基因组的核苷酸序列构建的系统发育树 Fig. 5 Phylogenetic tree based on the nucleotide sequences of the genome |
BRSV是BRDC的重要病原，给养牛业造成了巨大经济损失，目前已在世界范围内广泛流行[5-6, 8]。国内血清流行病学资料显示BRSV在我国具有广泛的地域分布[23-25]，但还未见关于牦牛感染BRSV的报道。本研究在川西北草原患BRDC的牦牛中检测到BRSV的阳性率为64.75%，这一结果高于内地牛群6.95%~61.2%的阳性率[26-28]；阳性样本分别来自于川西北草原甘孜州和阿坝州的10个不同牦牛场中，场阳性率高达100%，表明BRSV广泛流行于川西北草原的牦牛中，可能是引起川西北草原牦牛BRDC的重要病原。本研究通过对G、F和基因组的核苷酸序列进行遗传进化分析发现，本研究的所有毒株均与本实验室前期扩增的Ⅲ亚群肉牛源的BRSV毒株亲缘关系最近，表明甘孜州和阿坝州流行的BRSV均为Ⅲ亚群毒株。Ⅲ亚群毒株主要分布在美国、土耳其和意大利等国家[5-6]，该型毒株在美国曾引起了多次呼吸道疾病的暴发，给畜牧业带来了巨大的经济损失[5, 34]。2018年，我国东北地区首次报道了BRSV Ⅲ亚群毒株(DQ株)在肉牛中的存在[8]，随后国内多个省份报道了Ⅲ亚群毒株的流行[27-28]。免疫接种是防控BRSV的有效手段，不同亚群毒株之间的抗原性存在差异[6, 16]，而国内目前还没有商品化疫苗，本试验结果为牦牛BRSV疫苗的研制提供了参考。
G蛋白主要参与病毒与宿主细胞表面的受体的结合，其诱导机体产生的抗体能够阻断病毒与宿主细胞的结合[12]。G蛋白有3个结构域组成：胞质结构域(1―37 aa)、跨膜结构域(38―65 aa)和胞外结构域(66―257 aa)[35]；胞外结构域可分为中央疏水区域(CHR；158―189 aa)和2个黏蛋白样区域(MLR：66―157 aa和190―257 aa)，其中，CHR高度保守，CHR中的174―185 aa为免疫显性区，分布着BRSV重要的抗原表位[36]。相比GenBank中所有的Ⅲ亚群毒株(包括国内上传的DQ毒株)，本试验获得的10条牦牛源G基因和本实验室最近上传的18条肉牛源G基因在胞外结构域有5处相同的氨基酸突变(H100Y、S105R、L180S、P198L、N251D)，其中，180位的氨基酸突变(L180S)位于CHR的免疫显性区内(174―185 aa)，是决定BRSV抗原亚型的重要表位[37-38]。根据G蛋白4个氨基酸的线性表位(180 aa、183 aa、184 aa和205 aa)，可以将BRSV分为4个抗原亚型：A、AB、B和未定型，其中，Leu180和Thr205为A亚型；Leu180和Ala205为AB亚型，Pro180(Ser183和Pro184)和Ala205为B亚型[37-38]。国内BRSV Ⅲ亚群流行毒株180位氨基酸位点的突变，使得这些毒株的抗原亚型不能确定[37-38]。因此，有必要进一步研究180位氨基酸突变对G蛋白抗原性的影响，为国内的BRSV疫苗研发提供参考。此外，与中国早期上传的DQ毒株(GenBank登录号：MT861050)相比，10条牦牛源的G蛋白和18条肉牛源的G蛋白共有30个共同的氨基酸突变，这些突变广泛分布在G蛋白的3个结构域中，这些氨基酸的突变是否对G蛋白的免疫原性造成影响需要进一步研究。
F蛋白参与病毒与细胞膜的融合过程，能够使受感染细胞与邻近细胞发生膜融合形成合胞体，此外还能够刺激机体产生中和抗体[9-11]。F蛋白具有三个疏水肽，包括氨基末端信号肽区(1―26 aa)、蛋白裂解位点(131―136 aa)和疏水跨膜锚定序列(522―549 aa)[4]。与GenBank中所有完整的F基因相比(包括国内上传的DQ毒株)，本试验获得的9条牦牛源F基因与本实验室最近上传的25条肉牛源的F基因在起始密码子处发生突变(ATG-ACG)，导致F蛋白氨基末端发生5个氨基酸的连续缺失，该缺失位点位于F蛋白氨基末端的信号肽区域，表明当前国内当前流行的BRSVⅢ亚群毒株的F基因有独特的进化趋势。目前，F蛋白氨基末端信号肽区的详细功能的尚不清楚，但关于副黏病毒科新城疫病毒的相关研究表明，当F蛋白的起始密码子突变时将对病毒的毒力产生影响[39]，有必要进一步研究F蛋白起始密码子的突变对BRSV毒力的影响。
本研究成功扩增到一条牦牛源Ⅲ亚群的BRSV全基因组序列，并命名为YAK/SWUN-1/21/CH，分析发现YAK/SWUN-1/21/CH与本实验室最近上传的肉牛源BRSV基因组(GenBank登录号：OP137030~137034)相似性较高，在系统发育树上亲缘关系也最近，这表明YAK/SWUN-1/21/CH可能是由国内肉牛源的BRSV传播而来。与GenBank中所有的毒株相比(包括6个中国肉牛源毒株)，YAK/SWUN-1/21/CH在N蛋白、SH蛋白和L蛋白表现出独特的氨基酸突变，这些蛋白在病毒的转录、复制、对宿主免疫逃避和抑制干扰素产生等方面发挥了重要的作用[40-41]。这些突变可能是由于BRSV在感染牦牛过程中为适应高原环境和新宿主而产生的[42]，但还需要更多的牦牛源BRSV基因组序列来进一步验证。
4 结论本研究首次证实了BRSV在牦牛中的存在和流行，感染的主要为Ⅲ亚群毒株，丰富了牦牛呼吸道疾病的病原谱，并成功获得了一株牦牛源Ⅲ亚群的BRSV全基因组。本试验结果为牦牛呼吸道疾病的防控提供了参考，并有助于更好地了解BRSV的流行和遗传进化。
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(编辑 白永平)