2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193
, WANG Qiao2, ZHANG Jin2, Astrid Lissette Barreto Sánchez2, ZHENG Maiqing2, LI Qinghe2, CUI Huanxian2, AN Bingxing2, ZHAO Guiping2, WEN Jie2, LI Hegang1
2. Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
鸡肉是餐桌上优质蛋白的重要来源[1]，在中国，鸡肉作为第二大肉类产品，其需求量也在不断增加。大规模的集中养殖背景下，热应激是目前严重影响家禽业的环境应激因素之一，给家禽业造成了重大经济损失。由于家禽缺少汗腺，而代谢活动旺盛，在高温环境下生长速度、生产效率和免疫功能等均会受到很大影响[2-4]。已有研究表明，热应激易引起仔鸡热应激综合征，影响下丘脑采食中枢，从而导致仔鸡体温升高，采食量下降，影响肉仔鸡的生长性能[4-5]。热应激能够刺激机体热休克蛋白(HSP)的产生和释放[6-8]，从而缓解活性氧(ROS)对机体细胞产生的有害反应[9]，而机体内SOD等物质的增加，也可以减轻缺乏HSP表达的细胞反应[10]。在热应激的影响下，部分细胞的数量也会出现变化，血液中的淋巴细胞和单核细胞数量降低，而异嗜性粒细胞的数量增加，从而使H/L比值增加[11-13]。目前，热应激对家禽业的影响已得到了广泛的研究，但不同鸡种之间耐热性的差异机制尚不清晰。
本研究主要以本地鸡种北京油鸡(BY)和商业鸡种广明白鸡(GM)为试验对象，通过脾脏转录组分析，鉴定两品种受到热应激后的差异表达基因和信号通路。利用RNA-Seq和表型数据进行WGCNA分析，深入挖掘与热应激相关性状(H/L、SOD、T-AOC)显著关联的Hub基因，为提升高产鸡种抗热应激能力的育种实践提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验动物及样品采集试验中选用的BY种蛋来自国家级北京油鸡保种场，GM种蛋来自佛山新广农牧有限公司，种蛋均在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平基地孵化。选用22日龄的80只BY和60只GM作为试验对象，在相同温湿度(24 ℃，相对湿度60%) 和饮食条件下饲养。25日龄时，随机选取50只BY和30只GM作为热应激组(HT)，将环控仓温度在30 min内提升至33 ℃；将剩余的30只BY和GM作为对照组(CTL)继续在24 ℃下饲养，记录每组的死亡数量，计算死亡率。饲养至29日龄时，HT组和CTL组中的BY和GM各随机选取15只，采集血液和脾脏组织进行后续研究。
1.2 表型测定后续使用H/L比值、SOD和T-AOC作为表型进行分析。为测量H/L比值，使用BY和GM的外周血制备血液涂片，干燥后用Wright-Giemsa染料进行染色，在100×的光学显微镜下记录100个白细胞中异嗜性粒细胞(H)、淋巴细胞(L)和单核细胞(M)的数量，将得到的异嗜性粒细胞与淋巴细胞比值作为表型数据。
每组随机选取8个个体的血清样本测定两种抗氧化能力指标，即SOD和T-AOC，使用鸡酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒进行测定(武汉华美生物有限公司)。
1.3 总RNA的提取、转录组文库的建立以及测序提取上述32个个体的脾脏组织RNA。使用QIAGEN RNeasy Kit试剂盒分离总RNA，用TIANGEN DNase KIT试剂盒去除基因组DNA。使用KaiaoK5500 Ⓡ分光光度计(北京凯奥科技发展有限公司)测定RNA纯度，使用Bioanalyzer 2100系统的RNA Nano 6000检测试剂盒(Agilent公司，美国)测定RNA完整性和浓度。总RNA样品检测合格后，向纯化得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer使其片断化，再以片断后的mRNA为模板，用六碱基随机引物合成cDNA第一链，并加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNA Polymerase I合成cDNA第二链，经过QIAQuick PCR试剂盒纯化并加入EB缓冲液洗脱。洗脱纯化后的双链cDNA进行末端修复、加碱基A、加测序接头处理，然后经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段并进行PCR扩增，从而完成整个文库制备工作。文库构建完成后，先使用Qubit3.0进行初步定量，稀释文库至1 ng ·μL-1，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用Bio-RAD CFX 96荧光定量PCR仪和Bio-RAD KIT iQ SYBR GRN进行Q-PCR，对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度＞10 mol ·L-1)以保证文库质量。质量合格的文库用Illumina平台进行测序，测序策略为PE150。
1.4 差异表达基因筛选在RNA-seq分析中，通过定位到基因组区域或外显子区的测序序列(Reads)的计数来估计基因的表达水平。采用DESeq2进行基因差异表达分析，根据差异倍数(Fold change值)和Q值(P-adjust值，矫正之后的P-value值)进行显著差异表达基因筛选，本试验中选用丨log2 Fold change丨≥1和Q＜0.05的标准进行筛选。
1.5 差异表达基因的KEGG富集分析利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)对差异表达基因和Hub基因进行信号通路富集分析，通过P＜0.05筛选出与抗应激显著相关的信号通路，并据此筛选候选基因进行后续验证[14]。
1.6 加权基因共表达网络分析(WGCNA)WGCNA是一种分析多个样本基因表达模式的方法。通过R 4.0.4中的WGCNA包中的hclust函数将样本聚类，剔除离群样本。随后使用pickSoftThreshold函数计算最优软阈值[15-16]，将无标度拓扑拟合指数(R2)大于0.85作为最优软阈值筛选标准。采用adjacency函数构建拓扑重叠矩阵，并使用hclust函数对基因进行聚类。将基因划分为不同模块后，计算其特征值(module eigengene, ME)分析模块和样本组间的相关性。选择与不同组间相关性高的模块作为目标模块。随后计算目标模块内的Moudle membership(MM)和Gene significance(GS)，以丨MM丨＞0.8和丨GS丨＞0.5为标准筛选到的基因为枢纽基因(Hub gene)。
2 结果 2.1 热应激对BY和GM生理指标的影响研究前期为了比较BY和GM两品种对热应激的耐受力，在热应激5 d后对死亡率、H/L、SOD和T-AOC进行测定，结果显示，对比两品种HT组数据，GM的各项表型数据(死亡率、H/L、SOD和T-AOC)均高于BY。GM中热应激组死亡率为10%，高于对照组死亡率(6.7%)，而BY两组中均未出现死亡(表 1)；热应激后，两品种H/L值均出现显著升高，GM中H/L变化较BY更显著(图 1A)；施加热应激后两品种抗氧化应激因子浓度均出现不同程度升高，但只有GM的T-AOC升高达到极显著水平(P＜0.01)。另外，热应激条件下，GM的T-AOC水平显著高于BY(图 1B、C)。
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表 1 热应激组和对照组BY和GM的死亡率 Table 1 Mortality of BY and GM in heat stress and control groups |
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A. 两品种热应激组和对照组中异嗜性粒细胞和淋巴细胞(H/L)比值；B. 两品种热应激组和对照组中超氧化物歧化酶(SOD)浓度；C. 两品种热应激组和对照组中总抗氧化能力(T-AOC)浓度。*. P＜0.05，**. P＜0.01，下同 A.Heterophil to lymphocyte ratios (H/L) in the heat stress and control groups of both breeds; B. Superoxide dismutase (SOD) concentrations in the heat stress and control groups of both breeds; C. Total antioxidant capacity (T-AOC) concentrations in the heat stress and control groups of both breeds. *. P < 0.05, **. P < 0.01, the same as below 图 1 两品种对照组和热应激组生理指标变化 Fig. 1 Changes in physiological indicators in the control and heat stress groups of two chicken breeds |
每组随机选取8只鸡进行脾脏转录组测序和差异表达基因分析。热应激组相比对照组转录组数据表明，在BY中共有313个基因的表达出现显著变化，其中169个基因呈上调表达，144个基因呈下调表达，包括CTRB2、ASIC2等基因；GM中共有235个基因的表达出现显著变化，其中152个基因呈上调表达，83个基因呈下调表达，包括ASIC2、SPIRE2等基因(图 2A), 每个品种的前10个DEGs在表 2中列出。BY和GM的差异表达基因比较分析显示，多数基因在BY或GM其中一个品种中差异表达，仅有15个基因在BY和GM中均显著差异表达(图 2B)。
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图 2 两品种热应激组相比于对照组差异表达基因的火山图(A)和韦恩图(B) Fig. 2 Volcano(A) and Venn(B) plots of DEGs in heat stress group compared to the control group of two chicken breeds |
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表 2 两品种热应激组相对对照组的Top10差异表达基因 Table 2 Top10 DEGs in heat stress group compared to the control group of two chicken breeds |
对BY和GM筛选出的显著差异表达基因分别进行KEGG分析。结果显示，热应激条件下，BY的差异表达基因共显著富集到8条信号通路，其中包括Cholesterol metabolism、Histidine metabolism、beta-Alanine metabolism等与代谢相关的信号通路；而GM的差异表达基因共显著富集到13条信号通路，包括Toll-like receptor signaling pathway、Cytokine-cytokine receptor interaction等与免疫相关的信号通路(表 3)，其中IL12A、IL22、FOS等基因均富集到多条免疫通路中。
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表 3 两品种热应激组相比对照组差异表达基因KEGG富集分析 Table 3 KEGG enrichment analysis of DEGs in the heat stress group compared to the control group of two chicken breeds |
对上述转录组数据进行分析质控后，共得到21 092个基因用于后续分析。根据表型数据，BY和GM各剔除一个表型缺失个体，分别对15个样品进行聚类，无离群样本。以R2＞0.85为标准确定BY的最优软阈值为6(图 3A)，GM的最优软阈值为10(图 3B)。根据ME进行模块聚类，合并相似度大于0.8的模块，最终在BY中共构建了21个模块(图 3C)，在GM中构建了20个模块(图 3D)。
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A. 确定BY的最优软阈值；B.确定GM的最优软阈值；C. BY的基因动态剪切聚类树，第一行是首次聚类的结果，第二行是模块合并后的结果，每个颜色代表一个模块；D. GM的基因动态剪切聚类树 A. Determination of soft threshold in BY; B. Determination of soft threshold in GM; C. Gene dynamic cut clustering tree of BY, the first row is the result of the first clustering, and the second row is the result of the merging of the modules, each color represents a module; D. Gene dynamic cut clustering tree of GM 图 3 加权基因共表达网络分析 Fig. 3 Weighted gene co-expression network analysis |
通过对模块的ME与表型矩阵进行相关性分析，分别得到模块与H/L比值、SOD和T-AOC三个表型性状之间的相关系数及P值(图 4A、B)，选择与目标性状相关性最强且P＜0.05的模块为目标模块。在BY中筛选出与H/L相关性较强的“darkred”和“salmon”模块(图 4A)，在GM中筛选出与H/L比值相关的“green”、“magenta”和“turquoise”模块，以及与T-AOC相关的“grey”模块(图 4B)。在相关性较高的模块中，通过丨MM丨＞0.8和丨GS丨＞0.5进一步筛选Hub基因，在BY中共筛选出37个与H/L比值强相关的基因，在GM中筛选出231个与H/L比值强相关的基因，以及1个与T-AOC相关性较强的基因。
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A. BY模块与性状关联分析；B. GM模块与性状关联分析。红色代表正相关，蓝色代表负相关，颜色越深相关性越强 A. Module-trait associations of BY; B. Module-trait associations of GM. Red represents positive correlation, blue represents negative correlation, the darker the color, the stronger the correlation 图 4 模块性状关联图 Fig. 4 Module-trait relationship diagram |
将筛选出的与H/L强相关的Hub基因进行KEGG富集分析，进一步确定候选基因。在BY中显著富集到Neuroactive ligand-receptor interaction等5条信号通路(表 4)，TRHR、AOC1、PRPS2、KHK等基因富集到Histidine metabolism等与代谢相关的通路。在GM中显著富集到Endocytosis等13条通路(表 4)，MAPK8、EPS15、NRK、TGFBR1等基因富集到MAPK signaling pathway等与免疫相关的信号通路。对比BY和GM筛选出的Hub基因，发现均存在TRIM29基因，该基因所编码的蛋白属于TRIM蛋白家族, 与多种疾病相关，在Ⅰ类MHC介导的抗原处理和呈递以及先天免疫系统中均发挥重要作用。
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表 4 Hub基因KEGG富集分析 Table 4 KEGG enrichment analysis of Hub genes |
家禽养殖集约化和规模的不断增加，通风不足、饲养密度大等养殖条件可能使家禽遭受热应激。热应激是造成家禽业环境应激的主要因素之一，导致家禽生产效率降低、肠道微生物菌群变化等反应，给家禽生产带来巨大损失[1, 17]。同时，热应激还会降低免疫系统对病原体感染的抵抗能力，造成疾病严重程度增加，甚至造成大量死亡[3, 18-20]。
前期研究已经表明，GM较BY对于热应激更加敏感[21]。为了筛选影响两品种耐热能力差异的关键基因，本研究采集了两品种热应激前后的脾脏组织进行转录组分析。结果显示，BY的差异表达基因显著富集到8条通路，主要包括胆固醇代谢、组氨酸代谢、β-丙氨酸代谢等与代谢相关的信号通路。上述信号通路在应激条件和脂肪氧化时被激活，具有抑制内皮细胞的增殖、迁移和小管的形成，减少血管渗漏等功能，可能与抗氧化应激有关[22-25]；GM的差异表达基因显著富集到13条通路，包括Toll样受体信号传导途径、细胞因子-细胞因子受体的相互作用等与免疫紧密相关的信号通路，其中IL12A、IL22、FOS等基因均与免疫和炎症反应紧密相关，FOS蛋白被认为是细胞增殖、分化和转化的调节器，FOS基因的表达也与凋亡细胞的死亡有关[26-27]。两个鸡种在热应激条件下参与不同的信号通路，意味着机体抗氧化应激过程中发挥作用的基因存在差异，对各自发挥重要作用的基因进行筛选和功能验证或许能够解释两品种间不同抗应激能力的原因。
异嗜性粒细胞与淋巴细胞的比率(H/L)与先天免疫反应强度呈正相关，主要反映了机体通过异嗜性粒细胞介导的损伤来应对感染的动态过程[28]。组织损伤或感染过程中，糖皮质激素刺激淋巴细胞从循环血液迁移到皮肤、脾脏和淋巴结等部位，同时诱导异嗜性粒细胞从骨髓流入血液。因此，H/L值作为一种简单、可靠的生理应激指标也用于生理生态学研究[29]。已有研究表明，低H/L值相较于高H/L值的鸡对外界刺激的抵抗能力更强[30]。在本研究中，H/L作为两品种热应激指标之一，用于后续WGCNA分析中Hub基因的鉴定。结果显示，在BY中共筛选出37个与H/L比值强相关的基因，在GM中筛选出231个与H/L比值强相关的基因。对筛选出的Hub基因进行通路富集，与转录组分析结果一致，BY中筛选出的基因主要富集在与代谢相关的通路中，其中TRHR基因能够编码一个促甲状腺激素释放激素(TRH)的G蛋白偶联受体，该基因的突变与促甲状腺素释放激素抵抗有关；GM中筛选出的基因主要富集在免疫相关的信号通路中，其中TGFBR1基因所编码的蛋白属于高度保守的细胞周期蛋白家族，已被证明与肿瘤抑制蛋白Rb相互作用，该基因的突变、扩增和过度表达改变了细胞周期的进展，经常在人类癌症中被观察到。两品种差异基因富集的不同信号通路或与其耐热能力不同有关。BY和GM筛选出的Hub基因中均包括了TRIM29基因，该基因能够抑制先天免疫的激活，诱导干扰素基因刺激因子的K48连接泛素化，参与致癌和分化[31-32]，在两品种中该基因功能除与免疫相关外，可能还与抗热应激显著相关。
对比以往的研究，本试验选择了中国地方鸡种和商业鸡种为研究对象，在进行脾脏转录组分析的基础上，结合WGCNA分析，筛选并比较了两个品种与H/L等表型显著相关的候选基因，为进一步解析不同鸡种抗应激能力的差异机制奠定了基础。
4 结论本研究发现，北京油鸡抗热应激能力显著强于广明白鸡。通过两鸡种热应激组和对照组脾脏的转录组分析发现，BY的差异表达基因主要富集在代谢相关的通路，如胆固醇代谢、组氨酸代谢通路；而GM的差异表达基因主要富集在免疫相关的通路中，如细胞因子-细胞因子受体的相互作用、Toll样受体信号通路，也据此筛选出了可能与鸡的耐热能力有关的基因。又通过WGCNA分析，筛选出在BY和GM中共同存在的Hub基因TRIM29作为后续对鸡耐热性研究的重要候选基因。本研究为提升高产鸡种抗热应激能力的育种实践提供了理论基础。
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(编辑 郭云雁)