品种资源是国家的战略性资源。要实现自主可控的种源,需要加强种质资源的利用和保护。合川黑猪属于湖川山地猪的一个类群,是我国优良地方猪种之一,品种形成历史悠久,具有能适应当地高温、高湿自然气候和粗放饲养环境、抗病力强等特征,此外,与湖川山地猪的其它类群相比,合川黑猪肌内脂肪含量较高[1],是优良的育种素材。从2006年开始,合川黑猪以划定保护区的形式进行保种,主要为农户自养,仅作为经济杂交的母本进行开发利用,受养殖意愿的影响巨大。因此,由于市场对生长速度和瘦肉率的追求、非洲猪瘟疫情持续存在等原因,合川黑猪群体规模大量减小,近亲繁殖现象愈发严重,遗传多样性遭到严重破坏,各种优质基因不断流失。2020年开始,合川黑猪主产区畜牧主管单位开始联合养殖公司着手组建合川黑猪保种场,至今已初步组建好保种群体,但是,该群体当前的遗传多样性现状和群体遗传结构尚不清楚,这不利于后期保种工作的科学开展。此外,长期的适应性进化会使得不同猪种表现出不同的典型特征,这在基因组上则表现为连锁不平衡程度、优势等位基因频率等结构特征的变化,即常称的选择信号[2]。因此,通过对基因组上的选择信号进行分析,有利于揭示造成猪适应性表型的潜在遗传机理,同时也有利于定位优良经济性状相关的重要候选基因,为猪的遗传改良奠定坚实基础[3]。
SNP(single nucleotide polymorphism)是第三代分子标记,相较于其他分子标记,其易于检测、数量多、分布广、遗传稳定性好,已大量用于群体进化分析、全基因组关联分析、群体遗传学分析等研究领域[4-5]。商业化SNP分型芯片为地方猪群体选择信号、遗传结构和遗传多样性的研究提供了很好的工具。袁娇等[6]基于SNP芯片评估了通城猪的保种效果,证实通城猪得到了有效保护。邓俊等[7]利用“京芯一号”芯片分析了撒坝猪的群体结构,发现需要采取保种措施以确保撒坝猪的遗传多样性。莫家远等[8]利用50K芯片分析了广西地方猪的群体结构和选择信号。吴林慧等[9]利用Porcine 80K SNP芯片分析了恩施黑猪群体的选择信号与遗传学参数,挖掘了恩施黑猪群体胴体长度(滴水损失)、精子形成、骨骼肌分化和总产仔数相关的候选基因。Liu等[10]利用50K SNP芯片对凉山猪保种群的遗传结构进行了分析。王晨等[11]利用llumina CAuPorince 50K SNP芯片分析了139头蓝塘猪的群体遗传结构。黄树文等[12]利用Geenseek 80K、Illumina 60K芯片分析了广东小耳花猪、梅花猪、大花白猪、粤东黑猪、蓝塘猪的遗传距离、遗传结构及遗传多样性。Diao等[13]利用SNP芯片分析了广东和广西来自10个品种226头地方猪的遗传多样性。Liu等[14]利用50K芯片分析了太湖流域猪种保种现状及体型和产仔数的候选基因。
Xu等[15]利用80K SNP芯片对姜曲海猪的种群结构、系统发育、遗传多样性及选择标记进行了分析。本试验以合川黑猪保种群为研究对象,利用猪50K SNP芯片对保种群的选择信号、近交系数、群体遗传多样性、亲缘关系及家系组成进行分析,旨在从分子水平对合川黑猪保种群体的群体结构、适应性进化相关优势基因及遗传多样性进行分析,从而为更好地保护合川黑猪这一优秀种质资源提供数据参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验用58头(公猪26头,母猪32头)健康成年合川黑猪种猪耳组织样品来自重庆市合川区德康生猪养殖有限公司。所有样品采集后立即置于75%乙醇中保存,低温运输至实验室后于-20 ℃长期保存。DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司,Trans 2000 plus Ⅱ Marker购自TaKaRa公司;其它试剂均为国产分析纯。主要仪器:核酸蛋白浓度测定仪(NanoDrop 2000,Thermo Scientific),雪花制冰机(IMS30,常熟市雪科电器有限公司),离心机(Sorvall Legend Micro 21,Thermo Scientific),电泳仪(BG-Power600,北京生物技术有限公司),核酸蛋白成像系统(Gel Doctm XR+,Bio-Rad)。
1.2 试验方法1.2.1 DNA提取和SNP基因分型 利用DNA提取试剂盒提取组织DNA,使用NonoDrop 2000测定DNA浓度,DNA样本完整性用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。质检合格后使用北京康普森农业科技有限公司的“中芯一号“芯片进行SNP基因分型。
1.2.2 基因型数据质量控制 基因型数据的质量控制通过Plink(V1.90)软件完成,按照以下质控标准筛选去除不合格的SNP位点和样本:只使用常染色体上的位点,SNP检出率≥90%,个体检出率≥ 90%,最小等位基因频率 < 0.01,哈迪温伯格P≥0.000 001。
1.2.3 合川黑猪保种群体的遗传多样性分析 从群体有效含量、多态信息含量、多态标记比例、期望杂合度、观测杂合度、有效等位基因数以及最小等位基因频率方面分析合川黑猪保种群体的遗传多样性。有效群体含量为与实际群体具有相同的基因频率方差或相同近交系数增量(杂合度衰减率)的理想群体含量[16],一般根据群体的连锁不平衡水平估算得来。多态性标记比例是指目标群体中表现为多态的位点占总位点的比例。群体的多态信息含量及多态标记比例的计算参照Wang等[17]的方法。期望杂合度指的是群体中任一个体的任一位点杂合的概率。观测杂合度指的是群体中某一位点是杂合子的个体数占群体总数的百分比[14]。若期望杂合度比观测杂合度高,说明群体发生了近交或者选择;若期望杂合度低于观测杂合度,则说明群体可能引入了外血。利用Plink(V1.90)软件计算合川黑猪保种群体的期望杂合度和观测杂合度,计算方法参照孙浩等[16]的研究。
1.2.4 合川黑猪保种群体近交系数分析 ROH是个体内纯合基因型的连续片段,个体中ROH的总长越长,近交系数就越高。本研究利用Plink(V1.90)软件计算每个合川黑猪样本的ROH,统计每个样本ROH的数目、长度和分布,计算每个个体中ROH片段总长度占常染色体基因组总长度的比值,即基于ROH的近交系数。ROH的运行参数如下:--homozyg-window-snp 50;--homozyg-window-threshold 0.05;--homozyg-window-het 1;--homozyg-window-missing 1;--homozyg-snp 30;--homozyg-kb 1000;--homozyg-density 1000;--homozyg-gap 1000。
1.2.5 合川黑猪保种群体亲缘关系及家系结构分析 利用Plink(V1.90)软件构建状态同源(identity by state,IBS)矩阵,Gamatrix(V2)软件构建基因组关系G矩阵,分析保种群体的亲缘关系;利用Mega X(V10.0)软件中的邻接法(Neighbor-Joining, NJ)进行群体聚类分析,分析合川黑猪保种群的群体结构,统计不同家系的公、母猪数量。
1.2.6 合川黑猪保种群体选择信号分析 利用Tajima’s D和iHS方法进行群体内的选择信号分析。Tajima’s D具体方法如下:采用无重叠窗口法,每个窗口40 kb,进行选择信号分析,Tajima’s D值排在前1%判定为选择位点。iHS具体方法如下:利用rehh软件进行选择信号分析,iHS极值排在前1%的判定为选择位点[8, 14]。随后,依据受选择位点对应的基因组位置信息,在Ensembl数据库中进行比对,获得合川黑猪受选择区域包含的基因。
2 结果 2.1 基因组DNA质量检测按照DNA提取试剂盒操作说明提取基因组DNA。利用Nanodorp 2000检测所有DNA样本的浓度和OD值后,通过1%琼脂糖凝胶电泳评估DNA的质量。结果表明,合川黑猪基因组DNA样本亮度均一,条带清晰,无拖带,基因组DNA样品质量良好,可用于后续的芯片检测(图 1)。
利用“中芯一号”基因芯片对合川黑猪基因组DNA样本进行基因分型,Plink(V1.90)软件对基因型数据进行质量控制,结果如表 1所示;质控合格的SNPs数量在各条染色体上的分布如图 2所示。其中,1号染色体上的SNPs数目最多,为4 429个,12号染色体上的SNPs数目最少,为1 001个(图 2)。
利用Plink(V1.90)软件分析合川黑猪保种群体的群体有效含量、多态信息含量、多态标记比例、期望杂合度、观测杂合度、有效等位基因数以及最小等位基因频率。结果如表 2所示。群体的平均观测杂合度稍高于期望杂合度,说明该保种群体出现了分化。SNPs位点的多态信息含量范围为0.017~0.375,具体分布见图 3。最小等位基因频率为0~0.1的占比最大,为57.26%,其余分布较为均匀(图 4)。
为了研究合川黑猪保种群的亲缘关系,首先利用Plink(V1.90)软件计算个体间的IBS遗传距离。结果显示,合川黑猪保种群个体的IBS距离值在0.086 8~0.296 0之间,平均IBS遗传距离为0.199 2± 0.042 9。26头种公猪之间的IBS遗传距离值在0.086 8~0.281 7之间,平均值为0.176 7±0.048 4。群体IBS遗传距离矩阵结果如图 5所示,大部分个体间的IBS遗传距离较远,呈现中等程度的亲缘关系;部分个体间的IBS遗传距离较近,呈现较近的亲缘关系,说明这些个体之间存在较大的近交风险。随后,利用Gamatrix(V2)软件构建基因组关系G矩阵来进一步分析个体间的亲缘关系。由图 6可知,基于G矩阵的亲缘关系结果与基于IBS遗传距离矩阵的结果一致。
利用Plink(V1.90)软件对质控后剩余的SNPs位点进行ROH个数和长度分析发现,在所检测的58头合川黑猪中共发现2 246个ROH片段,长度在1~10 Mb之间的ROH数量占比最多,为79.12%(图 7),其中,最短的ROH长度为1.32 Mb,含有51个SNPs位点,位于13号染色体上,最长的ROH长度为230.96 Mb,含有4 633个SNPs位点,位于1号染色体上。除1号染色体外,ROH在染色体上分布整体较均匀(图 8),其中,1号染色体上的ROH数量最多,有387个,18号染色体上的ROH数量最少,有31个。个体的ROH片段个数在12~56之间,平均个数为(38.72±11.48),其中,含40~50个ROH的个体数量占比最多,为48.28%,含10~20个ROH的个体数量占比最少,为8.62%(图 9);个体ROH总长度在36.38~1 190.33 Mb之间,平均ROH长度为(416.33±305.81) Mb,其中,ROH长度在0~200 Mb的个体数量占比最多,为36.21%(图 10)。基于ROH的近交系数分析结果表明,当前保种群个体近交系数范围为0.015 2~0.497 6之间,平均近交系数为0.175,近交系数分布比例见表 3,表明合川黑猪保种群内已经出现近交累积现象。
鉴于公猪对于整个保种群体的重要性,本研究首先以公猪相互间分子亲缘关系系数大于等于0.1为标准,利用Mega X(V10.0)软件中的邻接法(Neighbor-Joining, NJ)对公猪群体进行聚类分析。结果如图 11所示,现有公猪大致可以分为7个家系。随后,依据各母猪个体与不同家系公猪亲缘关系的远近程度,将母猪划分进了已构建的7个公猪家系中,结果发现,合川黑猪保种群除了拥有7个包含公猪的家系以外,还拥有1个不包含公猪血缘的家系(表 4)。此外,部分家系中的母猪存在交叉现象,同时被划入了多个不同的家系中,如母猪17同时被划分到了A、B、C、D、F、G家系中。
利用Tajima’s D方法分析合川黑猪群体的基因组选择信号,结果发现,合川黑猪基因组上存在192个选择信号区域(图 12A),13号染色体上分布最多,达到25个,17号染色体上无分布(图 13A)。基于iHS方法共发现303个显著选择信号区域(图 12B),1号染色体上分布最多,达到35个,18号染色体上最少,为3个(图 13B)。基于正向选择信号区域在基因组上的位置,在Ensembl数据库中进行比对,发现基于Tajima’s D方法检测到的选择区域共包含193个候选基因,其中在猪上已经注释的基因118个,未注释的基因75个。基于iHS方法检测到的选择区域共包括331个候选基因,在猪上已经注释的有200个,未注释的有131个。两种方法同时检测到的候选基因有5个(图 14),即TCTN1、HVCN1、TRAF3IP1、PER2、U6。其中HVCN1与精子活力[18]和低温耐受[19]相关,TRAF3IP1和PER2与机体免疫功能[20-21]相关。据此可以推断,合川黑猪在适应性进化过程中,繁殖和免疫性状相关基因受到了一定程度的选择。
当前,利用商业化SNP芯片从全基因组水平上评估群体的遗传多样性和保种效果已成为主流方法。本研究利用商业化的猪50K SNP芯片分析了重庆合川黑猪保种群体的近交系数、亲缘关系、遗传多样性、选择信号和家系结构,为合川黑猪的科学利用和保种提供了数据支撑。
群体有效含量、多态信息含量、多态标记比例、期望杂合度、观测杂合度、有效等位基因数以及最小等位基因频率是评价群体遗传多样性的主要参数。群体有效含量越小意味着该群体的遗传变异越小,越不利于后期的遗传进展。本研究发现,合川黑猪保种群的群体有效含量为4.2头,较目前报道的梅山猪(50~65头)[16]、恩施黑猪(28头)[14]、青裕猪(12头)[22]、凉山猪(15头)[10]、陆川猪(34.93头)[12]等中国地方猪低很多,且极显著低于长白(207.5头)、大白(214.4头)等商品猪的群体有效含量[22-23]。多态信息含量与群体中等位基因的数目和频率有关,用来表示群体中某一位点多态性的程度,以评估群体的遗传多样性[24]。2010年,白小青等[25]报道的合川黑猪保种群体的平均多态信息含量为0.885 9,而本研究发现合川黑猪保种群体的平均多态信息含量为0.156,下降非常明显,表明虽然划定了合川黑猪保护区,但近10年来的保种成果收效甚微,合川黑猪保种群的遗传多样性正在快速丢失,亟需强化保种措施。多态标记比例越高,群体能提供的遗传信息越丰富。本研究中,合川黑猪保种群的多态标记比例为0.534,与2010年白小青等[25]报道0.89相比,降低明显。但与当前已报道的其它中国地方猪种,如大花白猪(0.658)[9]、青裕猪(0.642 4)[22]相比差别不大。本研究发现,合川黑猪保种群的观察杂合度稍高于期望杂合度,说明该保种群体可能出现了分化或者引入了部分外来血缘,需进一步提纯。
当前,我国大多地方猪保种场采取的闭群繁育保种措施,人工选择、杂交方式等会极大的影响群体遗传多样性和遗传结构。因此,对于保种群体的可持续发展来讲,保种群体的遗传多样性、亲缘关系和遗传结构的理清很重要。本研究基于基因组关系G矩阵和IBS遗传距离矩阵的亲缘关系分析发现,部分合川黑猪之间的亲缘关系较近,说明这些个体之间存在较大的近交风险。在之后的实际生产中,要尽量减少亲缘关系系数较高的个体间进行配种。此外,合川黑猪保种群个体平均IBS遗传距离低于王晨等[11]报道的蓝塘猪(0.332 6±0.033 9)、刘彬等[22]报道的青裕猪(0.260 4±0.025 2)及蔡春波等[24]报道的马身猪保种群体(0.284 2±0.064 5),表明当前的合川黑猪保种群体内个体之间的亲缘关系较其它中国地方猪品种更近。刘彬等[22]和蔡春波等[24]研究认为,在实际育种中,种公猪IBS遗传距离会略高于整个保种群体的平均遗传距离。但本研究发现,合川黑猪种公猪的IBS遗传距离略低于群体的平均IBS遗传距离,表明各种公猪间的亲缘关系相对较近,因此在后期的选种选配中应控制好亲缘关系系数。
本研究基于ROH的近交系数分析发现,合川黑猪保种群的平均近交系数为0.175,高于已报到的青裕猪(0.055)[22]保种群和恩施黑猪(0.069)[14]等群体,低于已报道的马身猪(0.237)[24]群体。当前合川黑猪保种群中仅有31.03%的个体近交系数≤0.062 5,表明合川黑猪保种群个体间的亲缘关系普遍较近,容易引起近交衰退,在后续的保种过程中,应高度重视近交系数增长过快的问题,适当引入外血,科学选种选配。此外,现有群体内各家系间公猪个体数量差异较大,部分家系中的母猪存在交叉现象,家系结构不平衡。因此,在后续的保种工作中,可结合每个家系的具体情况,在保护区内筛选目的猪只,将其引入保种场内进行配种,以平衡家系结构。
本研究发现,两种选择信号分析方法检测到的重叠基因较少,主要原因可能是两种方法对不同类型的选择信号具有不同的检测灵敏度。Tajima’s D方法主要对一些人工选择信号特别敏感,而iHS方法主要对正向选择信号以及近期发生的信号选择敏感[3]。从内在机制来看,性状受选择在基因组上往往体现为功能基因受到选择。在合川黑猪中,受到选择的代表性基因有HVCN1、TRAF3IP1和PER2。HVCN1基因是电压门控氢离子通道1基因,研究发现阻断HVCN1基因会导致精子活力、精子运动改变,线粒体膜电位降低,同时还可能导致精子头部膜脂质的紊乱以及精子头部Ca2+浓度的降低,因此,HVCN1基因在调节精子运动和运动学以及Ca2+进入精子头部中起着至关重要的作用[18]。此外,Delgado-Bermúdez等[19]研究证实,在哺乳动物精子冷冻保存过程中,阻断HVCN1通道会降低精子的耐受性,揭示了HVCN1基因在精子冷冻保存中的重要作用。TRAF3IP1基因编码TRAF3(TNF受体相关因子3)互作蛋白1,研究发现其在脂肪细胞的免疫代谢功能中发挥着重要作用[20],此外,对哺乳动物的纤毛形成、胚胎发育以及细胞形态大小也具有重要作用[26]。PER2基因编码昼夜调节因子2,除了具有调节昼夜节律的功能外[27-28],还可以调控脾脏的免疫功能[29]、乳腺发育[30]、成肌细胞分化和肌肉再生[31]以及雄性小鼠的生育能力[32]。这些候选基因的发现对合川黑猪繁殖和免疫等经济性能的遗传改良具有指导意义。
4 结论本研究基于猪SNP芯片分析了合川黑猪保种群的遗传多样性、亲缘关系、近交系数、家系结构和选择信号,发现合川黑猪保种群体的遗传多样性较丰富,但部分个体间存在较大的近交风险,各家系内个体数量差异明显,个别家系内公猪个体数量极少,存在血统流失风险。此外,在适应性进化过程中,合川黑猪繁殖和免疫性状相关基因受到了一定程度的选择作用。
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(编辑 郭云雁)