猪伪狂犬病(pseudorabies，PR)是由猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)引起的一种高度传染性疾病[1-2]。不同年龄段的猪均可感染，感染后妊娠母猪表现为流产、死胎，新生仔猪表现为严重的神经症状和高死亡率，极大危害着养猪业的健康发展[3-4]。
PRV为线状双链DNA病毒，长度约为150 kb，共编码100多种蛋白[5-6]。在这些蛋白中，gB和gC蛋白是高度保守的糖蛋白，gB蛋白参与病毒入侵及病毒在胞间的感染；gC蛋白主要促进病毒囊膜与宿主细胞膜融合，诱导中和抗体的产生[7-8]。而gE蛋白具有协同控制毒力的功能，同时兼具区分野毒株与疫苗株的主要毒力基因[9-10]。在很多研究中，这几个蛋白的编码基因被用来分析PRV的遗传变异。
PRV于20世纪60年代初首次在我国报道发生，并造成了严重的经济损失[11]。2012年以来，PRV变异株在我国暴发流行，毒力增强，抗原性也发生了改变，Bartha-K61株等传统疫苗不能提供完全的保护[12-13]。本研究对分离到的1株PRV变异毒株(ZJ株)的关键基因进行分析，了解其遗传变异特征及与流行毒株的亲缘关系，并开展小鼠致病性研究，为进一步探索流行毒株抗原变异机制以及开展PRV的防控奠定理论基础。
1 材料与方法 1.1 病毒分离与鉴定病料采自浙江省某规模猪场10日龄发病仔猪，将采集的猪脑组织样品经研磨、冻融以及无菌过滤后，取200 μL接种单层BHK-21细胞，37 ℃孵育1 h，弃去组织悬液，加入2 %胎牛血清的细胞维持液，培养至细胞出现病变。
1.2 病毒基因扩增及测序参考GenBank中的PRV全基因序列(KM189912.1)，针对gB、gC和gE基因设计全长扩增及鉴定引物。以第5代细胞病毒液的核酸为模板对目的片段进行扩增。扩增产物由上海生工生物工程公司测序。
1.3 病毒的遗传变异与基因特征分析使用DNAstar软件对测序结果进行拼接与分析，利用MegAlign软件对ZJ株与参考毒株的核苷酸及氨基酸序列进行多重比对及主要位点的变异分析；并通过MEGA7.0软件构建系统进化树，分析病毒的遗传进化关系。
1.4 小鼠致病性试验将上述细胞病毒液连续10倍稀释至10-6，每个稀释度为一组，分别皮下接种6周龄BALB/c小鼠，每只100 μL，观察并记录健康状况，按Reed-Muench法计算半数致死量(LD50)后，以102.0 LD50·0.1 mL-1的剂量进行小鼠致死性试验，绘制生存曲线。
无菌解剖濒死期小鼠，采集大脑、肝、脾等，4 %的多聚甲醛固定24 h后，进行组织切片免疫荧光鉴定。
2 结果 2.1 PRV-ZJ株的分离鉴定与相似性分析电镜观察，病毒粒子呈球形，直径约150 nm，病毒囊膜表面可见纤突。以第5代病毒液核酸为模板，使用PRVgE基因鉴定引物，获得了400 bp左右的特异性条带。基于gB、gC和gE基因的相似性比对与分析显示，ZJ株与国内变异株的相似性高达99.7%~100.0%，而与国外毒株的相似性仅分别为97.8%~98.3%、95.1%~95.6%和96.9%~97.3%。
2.2 遗传进化分析系统发育树分析显示，PRV毒株被分为Ⅰ型和Ⅱ型两种基因型。来自欧美等地的分离株属于Ⅰ型，国内分离株大部分为Ⅱ型，并可进一步分为经典亚型(GII-B)和2012年以后分离的变异亚型(GII-A)，ZJ株与国内变异毒株同属于GII-A亚型(图 1A、1B、1C)。
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A. gB基因；B. gC基因；C. gE基因 图 1 基于gB、gC和gE基因的遗传进化分析 Fig. 1 Phylogenetic analysis base on the gB, gC and gE gene |
gE基因氨基酸比对显示，ZJ株与国外毒株存在14个氨基酸的突变，分别为D59N、N63D、V106L、A122S、R149 M、T179 S、L215 A、A216 D、G47I R、R473 H，A502 V、S507 A、V520 A和A524 P，以及在第48位和第496位各一个天冬氨酸D的插入，是变异毒株的重要标志。此外，ZJ株出现了一个独特的变化，第510位与国外毒株以及国内经典毒株相一致，为甘氨酸G，不同于变异毒株的丝氨酸S(图 2)。
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图 2 gE基因氨基酸序列比对结果 Fig. 2 Alignment of partial amino acid sequences of gE |
感染48 h后，小鼠表现兴奋不安，精神亢奋，不断用嘴啃咬接种部位，直至死亡，LD50为102.8TCID50·mL-1。100 LD50攻毒小鼠，60 h左右开始出现死亡，5 d全部死亡(图 3A)。
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图 3 存活曲线及攻毒小鼠组织免疫荧光鉴定 Fig. 3 The survival curve and immunofluorescence identification of challenged mouse tissue |
组织切片免疫荧光观察，大脑、肝、脾等组织均出现了特异性的绿色阳性信号，脑组织的信号最强，集中在神经元周围；脾的阳性信号主要在淋巴细胞胞质中，而对照组未出现特异性荧光(图 3B)。
3 讨论本研究中，ZJ株在浙江省PR疫苗免疫猪场引起10日龄仔猪典型的临床症状。对小鼠具有高致死率，第5天死亡率达到100%，肺及脑组织中观察到典型的病理变化，IFA试验显示，在肝、脾以及脑组织中均出现了阳性信号。提示该毒株不仅导致严重的神经症状，而且呈现全身性感染。
通过对主要糖蛋白基因序列的相似性分析发现，ZJ株与国内变异株同属于GII-A亚型，相似性高达99.7%~100.0%，具有典型的PRV变异毒株的基因特征[14-15]。ZJ株gE基因出现了一个独特的变化，第510位为甘氨酸G，与经典毒株相一致，不同于变异株的丝氨酸S。由于gE基因氨基酸位点的突变可能导致抗原性发生改变，进而影响机体免疫应答的产生，这个突变是否决定了ZJ株的病毒毒力有待进一步研究，也提示人们病毒存在进一步变异的可能。
4 结论本研究成功分离到1株PRV ZJ株，通过对关键基因的分子遗传变异分析及6周龄小鼠致病性研究，表明该毒株对小鼠表现高致病力，呈现全身性感染，与我国变异毒株高度同源，且处于同一进化分支，但gE基因出现了一个独特的变化，提示存在进一步变异的可能。为进一步探索PRV毒力增强与抗原变异的机制奠定基础。
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(编辑 白永平)