肥胖是许多慢性病的主要危险因素，包括糖尿病、心血管疾病、异位脂肪沉积、胰岛素抵抗、血脂异常、非酒精性脂肪肝及慢性肾病等[1-4]。肥胖和高脂血症是慢性肾病最普遍的独立危险因素，提示肾中脂质蓄积对肾功能不利[5]。肥胖相关肾病的主要病理表现为肾小球肥大、系膜基质扩张和肾小球硬化，另一个显著特征为肾小管上皮细胞中空泡积聚[6]，这表明异常的脂质代谢可能是导致肾功能不全的原因之一[7]。当能量摄入逐渐超过机体在脂肪组织中储存脂肪的能力时，各种来源的循环脂质溢出到非脂肪组织，如肌肉、胰腺、肝和肾等，这种现象称为脂肪异位沉积[8]。在以往的研究中发现，当脂肪异位沉积发生在肾时，对肾组织造成明显的损伤[9]，因此减少肾脂质蓄积可能是改善肥胖引起肾损伤的有效途径[10]。
AMP活化蛋白激酶(AMPK)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在调节细胞能量平衡中起主要作用[11]。在哺乳动物等真核生物中，AMPK是一个关键开关，通过直接磷酸化蛋白质或调节特定组织(脂肪和肌肉等)中的基因转录来调节脂质代谢[12]，AMPK可能是改善脂肪沉积的有效靶点。
柠檬苦素(Limonin，LM)是一种广泛存在于柑橘类植物果实中的三萜类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌、调节血脂和保肝等药理作用[13-15]，也有研究表明其具有抗肥胖、降血糖的功效[16]，但在LM对高脂诱导肾损伤的影响方面鲜有报道。在畜禽养殖集约化大潮下，饲料成分配比不均导致畜禽消化代谢紊乱生产性能下降[17-19]，降低了养殖的经济效益。因此，本研究以C57BL/6雄性小鼠为模型，对其进行高脂饲料干预，以探究在高脂日粮饲喂下LM降脂作用及对肾损伤的改善作用。
1 材料与方法 1.1 试验材料LM(含量≥98%)购于上海源叶生物科技有限公司(S31594)；试验中小鼠饲料购于小黍有泰(北京)生物科技有限公司(D12450B、D12492)；总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所(A111-1-1、A110-1-1)；苏木素伊红(HE)染液、糖原(PAS)染色试剂盒及DAB染液购于碧云天生物科技限公司(C0105S、C0142S、P0203)；BCA蛋白定量/浓度测定试剂盒购于大连美仑生物技术有限公司(MA0082-2)；AMPK(1∶1 000，WL02254)、磷酸化的AMPK(P-AMPK、1∶1 000，WL05103)、脂肪酸合成酶(FAS，1∶1 000，WL03376)、甾醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1，1∶1 000，WL02093)、激素敏感性脂肪酶(HSL，1∶1 000，WL02643)、β-tubulin(1∶1 000，WL01931)购于万类生物科技有限公司；脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL，1∶1 000，DF7756)购于艾菲生物有限公司；肾损伤分子1(Kim1，1∶500，A2831)购于武汉爱博泰克生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记羊抗兔lgG(H+L)(1∶10 000，bs-0295G)购于北京博奥森生物技术有限公司。
1.2 试验方法1.2.1 试验动物分组及处理 25只体重21~23 g SPF级雄性C57BL/6小鼠购自辽宁长生生物技术股份有限公司，预饲1周后开始试验。在试验期间所有小鼠处于相同的环境。小鼠随机平均分成5组(n=5)，分别为对照组、LM组、高脂组、高脂+低剂量LM组(60 mg·(kg·d)-1)和高脂+高剂量LM组(120 mg·(kg·d)-1)。LM溶于0.5%羧甲基纤维素钠，LM给药剂量及方式参照已有文献进行选择[20-21]。对照组给予普通饲料(脂肪含量10%、碳水化合物含量70%、蛋白质含量20%)、LM组给予普通饲料的同时灌胃给药LM 120 mg·(kg·d)-1、高脂饲料组给予高脂饲料(脂肪含量60%、碳水化合物含量20%、蛋白质含量20%)、高脂+低剂量LM组和高脂+高剂量LM组给予高脂饲料的同时分别灌胃给药LM 60 mg·(kg·d)-1、120 mg·(kg·d)-1。
各组在相应条件下饲喂12周，试验结束时将小鼠称重、采血后腹腔注射3%戊巴比妥钠(60 mg·kg-1) 对小鼠进行麻醉后脱颈处死，解剖后取肾组织。血液进行生化指标检测，肾组织部分放入4%多聚甲醛中固定用于苏木精伊红染色、糖原染色及免疫组织化学(IHC)试验，部分肾组织液氮速冻后置于－80 ℃冰箱储存用于后续试剂盒及蛋白免疫印迹(Western blot)试验。
1.2.2 肾组织、血清生化指标测定 肾组织中TC和TG按照试剂盒说明书要求进行测定。
将血液于4 ℃、3 000 r·min－1离心10 min后抽取上清，使用自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)检测TC、TG、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)。
1.2.3 肾组织病理学观察 肾组织在4%多聚甲醛中固定后，放入石蜡中包埋制成石蜡切块，用切片机将石蜡切块修至平整，切成4~5 μm的薄片，分别进行HE和PAS染色。
HE染色：将切片脱蜡脱水，分别用苏木素、伊红进行染色，切片脱水、透明、封固。制备好的切片在光镜下观察并拍照。
PAS染色：将切片脱蜡脱水，分别用过碘酸溶液氧化、Schiff试剂及苏木素染色，盐酸乙醇分化液分化，自来水返蓝。切片脱水、透明、封固。制备好的切片在光镜下观察并拍照。
1.2.4 肾组织免疫组织化学分析 将切片脱蜡脱水，抗原修复，H2O2阻断内源性过氧化物酶，血清封闭，一抗二抗孵育，DAB显色，苏木素复染细胞核。切片脱水、透明、封固。制备好的切片在光镜下观察并拍照。Image j软件对阳性区域进行量化。
1.2.5 肾蛋白提取及蛋白免疫印迹分析 用蛋白免疫印迹法检测小鼠肾组织中AMPK、P-AMPK、FAS、SREBP-1、HSL、ATGL和KIM1的蛋白表达量，以β-tubulin作为内参。
称取肾组织加入RIPA裂解液，组织研磨仪充分研磨，研磨液冰上裂解，离心后取上清液根据BCA试剂盒说明书操作测定蛋白浓度，将蛋白样品终浓度调整至3 μg·μL－1，变性煮沸冷却后分装置于－80 ℃冰箱保存。采用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳分离目的蛋白，将目的蛋白转膜到NC膜上，封闭，一抗、二抗分别孵育。ECL发光液显影，使用曝光机(Tanon5200，上海)得到相应的蛋白条带。Image j软件对蛋白条带进行量化。
1.2.6 分子对接验证 利用PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载LM、AMPK激活剂阿卡地新(AICA Riboside，AICAR)、多索吗啡(Dorsomorphin，Compound C)的三维结构、利用PDB蛋白数据库(http://www.rcsb.org/)下载AMPK蛋白的三维结构，使用AutoDockTools-1.5.6对二者进行处理后使用AutoDockVina-1.1.2分子对接软件，根据蛋白配体的位置，确定蛋白活性位点的坐标，选取对接结合能量最低的构象用于分子对接结合模式分析，获取分子对接结合自由能，并使用PyMol进行作图。
1.3 数据处理使用GraphPad Prism 8.0进行数据差异性分析，数据采用单因素分析Tukey检验，均以“平均值±标准差(Mean±SD)”表示，P < 0.05认为有统计学差异。
2 结果 2.1 LM对高脂饲喂小鼠的体重、肾和血液脂质水平的影响由图 1可知，与对照组相比，高脂组小鼠体重显著升高(P < 0.01，图 1A、1D)，肾组织TC、TG含量显著升高(P < 0.01，图 1B、C)，血清TC、TG、LDL含量显著升高(P < 0.05，图 1F、1G和1I)，血清HDL含量显著降低(P < 0.05，图 1H)。与高脂组比较，高剂量LM组体重显著降低(P < 0.05，图 1A)，低剂量LM组和高剂量LM组肾和血清TG含量、血清LDL含量显著降低(P < 0.05，图 1C、1F和1I)，血清HDL含量显著升高(P < 0.01，图 1H)。以上结果说明LM改善了高脂饲喂诱导的小鼠体重和脂质水平异常。
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A. 小鼠体重；B. 肾总胆固醇；C. 肾甘油三酯；D. 小鼠外观；E. 肾组织眼观；F. 血清甘油三酯；G. 血清总胆固醇；H. 血清高密度脂蛋白；I. 血清低密度脂蛋白。*. P < 0.05，**. P < 0.01，****. P < 0.0001，下同 A. Mice body weight; B. Kidney TC; C. Kidney TG; D. Mice appearance; E. Kidney eye view; F. Serum TG; G. Serum TC; H. Serum HDL; I. Serum LDL. *. P < 0.05, **. P < 0.01, ****. P < 0.0001, the same as below 图 1 柠檬苦素对高脂饲喂小鼠的体重、肾和血液脂质的影响 Fig. 1 Effects of Limonin on body weight, lipids of kidney and blood in mice fed with high-fat diet |
由图 2可知，高脂组小鼠肾小球肿大、肾小管上皮细胞出现空泡变性并有部分肾小管上皮细胞脱落；低剂量LM组、高剂量LM组肾小球轻微肿胀，肾小管上皮空泡变性减轻、上皮细胞脱落减少(图 2A、2B)。与对照组相比，高脂组血清Cr、BUN含量显著升高(P < 0.01，图 2C、2F)，肾KIM1相对蛋白表达量显著升高(P < 0.001，图 2D、2E)。与高脂组相比，低剂量LM组、高剂量LM组血清Cr、BUN显著降低(P < 0.05，图 2C、2F)，高剂量LM组KIM1蛋白表达量显著降低(P < 0.001，图 2D、2E)。以上结果通过病理组织学观察和肾功指标两方面说明LM对高脂饲料诱导的小鼠肾损伤有明显的改善作用。
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A. HE染色(400×)；B. PAS染色(400×)；C. 血清Cr；D. KIM1蛋白免疫印迹条带；E. KIM1蛋白相对表达量；F. 血清BUN。***. P < 0.001，下同 A. HE staining (400×); B. PAS staining (400×); C. Serum Cr; D. Immunoblot of KIM1;E. The protein expression of KIM1;F. Serum BUN.***. P < 0.001, the same as below 图 2 柠檬苦素对高脂饲料诱导的小鼠肾功能影响 Fig. 2 Effects of Limonin on kidney function in mice fed with high-fat diet |
由图 3可知，与对照组相比，高脂组P-AMPK/AMPK、ATGL、HSL蛋白表达量显著降低(P < 0.001，(图 3A、3B、3E、3F)，FAS、SREBP1蛋白表达量显著升高(P < 0.001，图 3C、3D)，FAS、SREBP1平均光密度显著升高(P < 0.01，图 3G、3H、3I)，ATGL、HSL平均光密度显著降低(P < 0.001，图 3J、3K、3L)。与高脂组相比，低剂量LM组、高剂量LM组P-AMPK/AMPK、ATGL、HSL蛋白表达量显著升高(P < 0.01，图 3A、3B、3E、3F)，FAS、SREBP1蛋白表达量显著降低(P < 0.05，图 3C、3D)，SREBP1平均光密度显著降低(P < 0.05，图 3G、3I)，ATGL、HSL平均光密度显著升高(P < 0.01，图 3 J、3K、3L)，高剂量LM组FAS平均光密度显著降低(P < 0.01，图 3G、3H)。以上结果说明LM促进AMPK磷酸化进而调控了其下游脂肪合成和分解相关蛋白的表达。
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A. AMPK、P-AMPK、FAS、SREBP1、ATGL、HSL蛋白免疫印迹条带；B. P-AMPK/AMPK相对蛋白表达量；C. FAS蛋白相对表达量；D. SREBP1蛋白相对表达量；E. ATGL蛋白相对表达量；F. HSL蛋白相对表达量；G. FAS、SREBP1免疫组织化学染色(400×)；H. FAS平均光密度；I. SREBP1平均光密度；J. ATGL、HSL免疫组织化学染色(400×)；K. ATGL平均光密度；L. HSL平均光密度 A. Immunoblot of AMPK, P-AMPK, FAS, SREBP1, ATGL, HSL; B. The protein expression of P-AMPK/AMPK; C. The protein expression of FAS; D. The protein expression of SREBP1; E. The protein expression of ATGL; F. The protein expression of HSL; G. IHC staining of FAS, SREBP1(400×); H. The average optical density of FAS; I. The average optical density of SREBP1; J. IHC staining of ATGL, HS(400×)L; K. The average optical density of ATGL; L. The average optical density of HSL 图 3 柠檬苦素对AMPK及其下游蛋白的影响 Fig. 3 Effect of Limonin on AMPK and its downstream proteins |
由图 4可知，LM与AMPK最佳构象结合自由能为-8.8 kcal·mol-1、AICAR与AMPK最佳构象结合自由能为-6.6 kcal·mol-1、Compound C与AMPK最佳构象结合自由能为-8.2 kcal·mol-1，它们均具有较低的结合自由能并与AMPK紧密结合。其中LM和AICAR都与AMPK的氨基酸残基HIS133、ARG132、TYR129、PRO281、ARG331、SER282、ASP284、ASP289、VAL287、GLU291、ASP290结合，并且LM显示出更强的结合能力，而Compound C和AMPK对接与LM和AMPK对接无相同的氨基酸残基。以上结果说明LM能与AMPK紧密结合并可能具有和AICAR类似的作用。
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A. LM与AMPK结合最佳构象及相应结合自由能；B. AICAR与AMPK结合最佳构象及相应结合自由能；C. Compound C与AMPK最佳结合构象及相应结合自由能 A. Optimal conformation of LM bound to AMPK and corresponded binding free energy; B. Optimal conformation of AICAR bound to AMPK and corresponded binding free energy; C. Optimal conformation of Compound C bound to AMPK and corresponded binding free energy 图 4 柠檬苦素、阿卡地新、多索吗啡与AMPK对接的最佳构象相互作用示意图 Fig. 4 Schematic diagram of the optimal conformational interaction of Limonin, AICA, Riboside docked to AMPK |
有研究报道LM可以激活AMPK抑制高脂饲料喂养小鼠的肝脂质积累[22]。AMPK是一种普遍存在的异构酶，它在肾中大量表达[23]。本研究首次发现了LM通过激活AMPK减轻高脂饲料诱导的肾损伤。有研究发现，通过激活AMPK可以改善高脂诱导的肾损伤[24-26]。三萜类化合物可以改善高脂诱导的多种器官的脂肪沉积，如肝、肾、心等[27]。LM作为一种典型三萜类化合物，猜测其可能通过激活AMPK改善高脂诱导的肾脂肪沉积。
为验证上述猜想，本研究通过饲喂小鼠脂肪含量60%的高脂饲料建立肾损伤模型，评价LM干预对其产生的影响及其机制。有研究显示，用脂肪含量60%的饲料喂养C57BL/6小鼠12周可出现明显肾损伤[28]，与本试验结果一致，小鼠表现出血脂水平及肾功能的明显异常，肾出现异常的脂肪沉积。肾组织脂肪的异常沉积导致脂毒性为肾损伤的形成奠定了基础[29]。本研究发现，长期的高脂饲喂导致肾脂肪沉积并出现病理性损伤，而LM干预对改善血脂水平、减少肾脂肪异位沉积减轻肾损伤有很好的效果。
肾是体内的重要器官，它通过过滤和清除体内代谢产物及废物、毒物，并重吸收水分及其他有用物质来维持机体的稳态，Cr、BUN水平以及KIM1蛋白作为肾功能指标及肾损伤标志物能够反应肾功能情况[30-31]。多项研究表明，高脂饲喂可导致小鼠血清TG、TC、LDL升高，HDL降低，这些是脂质代谢的关键指标，它们的变化反映了脂质代谢异常，从而引起肾结构及功能异常[32-34]，与本研究造模结果显示一致，且本试验发现，LM干预可以逆转高脂饲料诱导的脂质蓄积及肾损伤情况。
为探索LM在减轻脂质蓄积作用中的机制，本试验检测了与脂肪合成和分解相关的指标。试验观察到LM促进了AMPK磷酸化，上调了ATGL、HSL蛋白的表达，下调了FAS、SREBP1蛋白的表达。肾中脂肪沉积主要表现在TG的含量的升高[35]。ATGL启动脂肪分解，催化TG分解为二酰甘油和一分子脂肪酸，随后HSL催化二酰甘油分解为单酰甘油和脂肪酸[36]，它们在分解肾中TG的过程中起关键作用。SREBP1是脂肪生成的转录因子，是AMPK直接调节的靶蛋白之一，它参与诱导FAS的表达从而促进了脂肪酸的合成[37]。ATGL、HSL、FAS、SREBP1都是AMPK的下游分子，LM可能是通过激活了AMPK调节它们的表达进而减少了脂肪合成，与研究报道一致[37-39]。
为了验证LM与AMPK存在结合位点，本研究继续进行了分子对接试验。分子对接是研究小分子配体与靶蛋白大分子之间相互结合作用及性能的手段之一，结合自由能可评价受体和配体之间的结合能力，结合自由能小于0时，认为配体和受体可以自由结合，且结合自由能越低，二者结合能力越强[40]。对接结果发现LM与AMPK能够紧密结合。此外，本试验试图用此方法验证LM对AMPK存在激活作用，结果发现，LM和AMPK靶蛋白特异性激活剂AICAR[41-42]与AMPK在11个相同位点(HIS133、ARG132、TYR129、PRO281、ARG331、SER282、ASP284、ASP289、VAL287、GLU291、ASP290)结合，LM与AMPK结合效果甚至更好，而AMPK靶蛋白特异性抑制剂Compound C[43]却没有与LM相同的结合位点。因此预测，LM可能与AICAR类似，有激活AMPK的效果。同时结合LM促进了AMPK磷酸化的蛋白免疫印迹结果进一步验证了笔者的猜想，LM能与AMPK形成稳定的复合物并紧密结合，且能够激活AMPK发挥作用。
综上所述，本研究表明，LM通过促进AMPK磷酸化，上调ATGL、HSL蛋白的表达促进脂肪分解途径，下调SREBP1、FAS蛋白的表达抑制脂肪合成途径，从而降低了血脂、减少了肾脂肪沉积，减轻了高脂饲粮诱导的小鼠肾损伤。
4 结论LM通过激活AMPK减轻高脂饲料诱导的小鼠肾脂质蓄积从而减轻肾损伤。
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(编辑 范子娟)