2. 青岛农业大学动物医学院, 青岛 266109;
3. 东北农业大学 黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室, 哈尔滨 150030
2. College of Veterinary Medicine, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China;
3. Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Laboratory Animal and Comparative Medicine, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是由细菌感染、挫伤、休克等直接或间接非心源性因素诱导肺上皮和/或毛细血管内皮细胞损伤的一种会严重危及生命的呼吸性系统疾病，其主要病理特征为肺泡/毛细血管通透性增加、肺水肿及肺弥漫性损伤等[1-2]。若不及时治疗，ALI将进一步发展为急性呼吸窘迫征(ARDS)，诱发多器官功能障碍，并造成动物死亡[3-4]。近年来，由于畜牧场饲养条件改变、大气污染、病毒传播(尤其是肆虐全球的COVID-19会诱导ARDS的发生)，致使ALI/ARDS的发病率和死亡率不断增加。据报道，ICU中3.2%的犬和1.3%的猫患有ALI/ARDS，其中，50%的犬和80%的猫预后不良，存活率低[5]。美国农业部动物健康检测局统计结果显示，72%的牧场牛群被诊断出ALI[6]。ALI会显著降低畜群采食量、饲料转化率、胴体价值、饲养场生产性能及畜产品质量，增加畜群死亡和被淘汰的风险，给畜牧健康养殖造成重大的经济损失[7]。因此，阐明ALI潜在分子致病机制，探索开发有效的防治药物，是动物呼吸系统疾病防治领域亟待解决的难题。
脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，也是临床上诱发ALI的常见因素。当LPS刺激肺部时，机体会过度的生成活性氧(reactive oxygen species，ROS)，增加丙二醛(malondialdehyde，MDA)和H2O2含量，驱动氧化应激反应[8]。过量的ROS超出了机体抗氧化剂清除氧自由基的能力，致使细胞膜不饱和脂肪酸增多，细胞膜的流动性减小、通透性增大，引起肺扩张和肺水肿。另外，ROS会破坏DNA进而导致线粒体功能紊乱，诱导细胞凋亡[9]。研究表明，阻断促凋亡蛋白的表达可抑制LPS所致的肺泡Ⅱ型细胞凋亡，增加ALI小鼠的存活率[10]。因此，靶向遏制ROS的产生，阻止细胞凋亡的发生，探明清除肺部氧化应激产物的分子机制是当前防治ALI的主要任务。
辅酶Q10(coenzyme Q10，CoQ10)是一种内源性合成、耐受性俱佳的脂溶性化合物，无明显毒副作用。外源性补充的CoQ10不仅具有强大的抗氧化、抗凋亡、抗炎和缓解线粒体损伤等效能，还能改善肺损伤。研究表明，外源性补充CoQ10可抑制支气管哮喘患者肺氧化应激而减缓哮喘症状[11]。早期给予CoQ10可使大鼠血浆MDA含量显著减少，肺组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性显著升高，从而减缓由钝性创伤所致的肺损伤[12]。此外，CoQ10可通过遏止细胞色素c(cytochrome c，Cyt-c)的释放，抑制Caspase-9激活，进而阻断星形胶质细胞发生凋亡[13]。Nrf2是机体内重要的抗氧化信号通路。丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶1(mitogen activated protein kinase phosphatase 1，MKP-1)通过与Nrf2中的Neh2结构域相互作用而上调Nrf2的活性，进而抑制氧化应激反应[14-15]。Li等[16]研究发现，CoQ10可以通过激活Nrf2活性进而增强细胞抗氧化防御能力。然而，CoQ10对LPS诱导的ALI是否具有保护作用，以及其保护作用机制是否与激活MKP-1/Nrf2信号通路有关尚有待深入探究。
1 材料与方法 1.1 实验动物72只8周龄雄性C57BL/6小鼠，体重22 g±2 g，均由辽宁长生生物技术股份有限公司提供。所有小鼠被随机分笼(每笼6只)并于温度(22 ℃±2 ℃) 和湿度(55%±5%)均适中的环境中饲养1周，所有小鼠均可自由采食和饮水。本研究中所有动物试验均已获得了东北农业大学实验动物研究伦理委员会(SRM-11)的批准。
1.2 主要药品与试剂CoQ10标准品(B20401，≥98%)购自上海源叶生物科技有限公司，LPS(O111:B4，L4391)购自德国Sigma公司，玉米油(C116025)购自上海阿拉丁有限公司，MDA(A003-1)、ROS(E004)、SOD(A001-3)和GSH(A006-2)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，TUNEL试剂盒(G1501)购自武汉塞维尔生物科技有限公司，BCA蛋白定量/浓度测定试剂盒(MA0082-2)购自大连美仑生物技术有限公司，苏木素伊红(HE)染色试剂盒(C0105S)购自上海碧云天生物技术有限公司，MKP-1抗体(sc-373841)购自Santa公司，β-actin抗体(bs-0061R)购自Bioss公司。Nrf2抗体(GTX103322)购自GeneTex公司，Lamin B抗体(WL01775)购自沈阳万类生物科技有限公司。
1.3 实验动物分组与处理随机将72只雄性C57BL/6小鼠分为6组：空白对照组(CON组)、CoQ10干预组(CHQ组)、模型组(LPS组)、低剂量CoQ10处理组(LDQ组)、中剂量CoQ10处理组(LMQ组)和高剂量CoQ10处理组(LHQ组)，每组12只小鼠。CON组小鼠每天被灌胃100 μL玉米油，连续14 d。CHQ组小鼠每天被灌胃50 mg·kg-1 CoQ10，连续14 d。LPS组、LDQ组、LMQ组和LHQ组小鼠每天分别被灌胃100 μL玉米油、2 mg·kg-1 CoQ10、10 mg·kg-1 CoQ10和50 mg·kg-1 CoQ10，连续14 d，第15天通过滴鼻方式给予各组小鼠50 μL 1 mg·mL-1 LPS溶液。
1.4 小鼠肺组织湿干质量比的检测ALI模型成功建立24 h后，处死各组小鼠，分离左肺，擦拭其表面血渍和渗出液，称量湿质量(wet weight，W)，然后置于60 ℃恒温箱72 h将其烘干，称量肺组织干质量(dry weight，D)，并计算肺组织W/D的值。
1.5 小鼠肺泡灌洗液(BALF)蛋白浓度的检测将小鼠的头部和四肢固定在低温操作台上，用剪刀剪开颈部皮肤，暴露气管并用酒精棉拭去血渍。于环状软骨上方剪一个“V”型切口，缓慢插入22 G留置针，固定针管并去掉针芯。抽取0.5 mL 0.9%的生理盐水缓慢注入气管再缓慢抽出，重复3次，最后将收集的BALF用无菌纱布过滤并汇集到提前预冷的2 mL EP管内。然后将其置于低温高速离心机内离心(4 ℃，1 200 r·min-1，10 min)，收集上清液。按照BCA蛋白定量/浓度测定试剂盒说明书检测各组小鼠BALF的蛋白浓度。
1.6 小鼠肺组织形态学的观察将在4%甲醛溶液中固定好的右肺下叶组织浸入石蜡液中进行包埋、制备石蜡切片、梯度酒精脱水、HE染色。然后由两位不清楚本试验分组的研究人员观察所有切片，并根据半定量评分原则评估各组小鼠肺组织损伤程度[17-18]。每张切片均在光学显微镜200倍镜下被任意抓拍6个非连续视野，并将每个视野均分为100个网格，分别统计炎性细胞浸润和出血肺泡所占视野内网格百分比来计算炎性细胞浸润率和肺出血率。肺泡间隔的厚度为肺泡间隔最厚处的垂直距离与200的比值。肺损伤评分即为炎性细胞浸润、肺出血、肺泡壁增厚评分的平均值之和，具体评分细则见表 1。
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表 1 肺组织损伤评分表 Table 1 Lung tissue injury scale |
准确称取一定量的肺组织，分别根据MDA、SOD和GSH试剂盒制备10%的肺组织匀浆液及所需试剂，严格按照各说明书的步骤检测各组小鼠肺组织中MDA含量、SOD活性和GSH含量。按照ROS测定试剂盒中酶消化法步骤制备各组小鼠肺组织单细胞悬液，取10 μL于血球计数板边缘缓慢滴入并计数，当细胞总数≥106时，加入荧光探针(DCFH-DA，10 μmol)，并将其置于37 ℃恒温箱中孵育1 h。然后低温高速离心(4 ℃，1 000 g·min-1，10 min)弃上清。用PBS清洗(2次)并重悬沉淀细胞，使用荧光酶标仪检测525 nm波长下各组肺组织细胞ROS的荧光强度。
1.8 小鼠肺组织细胞凋亡率的检测根据TUNEL试剂盒说明书，将制作好的肺组织石蜡切片脱蜡至水、修复、破膜、染色、复染、封片。然后，置于荧光显微镜下观察并拍照记录。最后，应用Image-Pro Plus 6.0软件分析TUNEL阳性细胞率。
1.9 小鼠肺组织细胞凋亡途径相关基因表达的检测根据总RNA提取试剂盒说明书提取各组小鼠肺组织总RNA，并用微量核酸蛋白浓度测定仪检测其浓度，记录A260 nm/A280 nm、A260 nm/A230 nm值，确定无污染后，按照反转录试剂盒说明书步骤采用20 μL反应体系将总RNA反转录合成cDNA。然后通过NCBI Gene Primer-BLAST寻找GenBank中已收录的特定的小鼠线粒体凋亡途径关键分子PCR的引物(表 2)，并由上海生工生物工程股份有限公司合成。接着，根据10 μL反应体系配比将引物、cDNA、荧光染料和DEPC水混合，并置于高通量实时荧光定量PCR仪中进行检测。最后，采用2-ΔΔCt法计算各基因的相对表达量。
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表 2 引物序列 Table 2 Primer sequence |
将100 mg小鼠肺组织剪碎并浸入强的RIPA裂解液与PMSF(100∶1)的混合液中，低温研磨、离心(4 ℃，12 000 g，5 min)并收集上清液。再按照细胞核和细胞质蛋白提取试剂盒说明书分离肺组织细胞核蛋白和细胞质蛋白。然后，应用BCA蛋白定量/浓度测定试剂盒检测肺组织蛋白浓度，计算所需5×上样缓冲液和稀释液的体积，并将其与200 μL肺组织蛋白液混合、煮沸(10 min)、冷却、分装。接着按照Chen等[19]的方法制备分离胶和浓缩胶、加样、电泳、转膜、封闭、一抗孵育(Nrf2，1∶2 000；MKP-1，1∶200；LaminB，1∶500；β-actin，1∶10 000) 过夜、TBST洗涤、二抗孵育(山羊抗兔，1∶6 000；山羊抗鼠，1∶10 000)2 h、TBST洗涤、曝光。最后使用ImageJ软件分析各条带的灰度值，计算目的蛋白的相对表达量。
1.11 数据统计与分析所有数据均表示为“平均值±标准误(x±sx)”，柱状图均用GraphPad Prism 5制作，TUNEL阳性细胞率用Image-Pro Plus分析，蛋白条带的灰度值用Image分析。所有数据的统计学显著性分析均采用SPSS 23.0中的one-way ANOVA和Tukey’s Post hoc检测法进行。P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 CoQ10对ALI小鼠肺组织W/D和BALF蛋白浓度的影响肺组织W/D和BALF蛋白浓度检测结果(图 1) 显示，与CON组相比，LPS组、LDQ组小鼠肺组织W/D值和BALF蛋白浓度均极显著升高(P < 0.01)，LMQ组显著增加(P < 0.05)，LHQ组无显著差异。与LPS组相比，LDQ组小鼠肺组织W/D虽有所下降，但无统计学差异，BALF蛋白浓度显著降低(P < 0.05)；LMQ组小鼠肺组织W/D显著降低(P < 0.05)，BALF蛋白浓度极显著降低(P < 0.01)；LHQ组小鼠肺组织W/D和BALF蛋白浓度均极显著降低(P < 0.01)。与LDQ组相比，LMQ组小鼠肺组织W/D虽有降低趋势，但无统计学差异，BALF蛋白浓度则显著降低(P < 0.05)。与LMQ组相比，LHQ组小鼠肺组织W/D和BALF蛋白浓度均显著降低(P < 0.05)。
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CON. 空白对照组；CHQ. CoQ10干预组；LPS.模型组；LDQ. 低剂量CoQ10处理组；LMQ. 中剂量CoQ10处理组；LHQ. 高剂量CoQ10处理组。*和**分别代表与CON组相比差异显著和极显著，#和##分别代表与LPS组相比差异显著和极显著，+和++分别代表与LDQ组相比较差异显著和极显著，э代表与LMQ组相比差异显著(*, #, +, э.P < 0.05, **, ##, ++, ээ.P < 0.01)。下同 CON. Control group; CHQ. CoQ10 intervention group; LPS. Model group; LDQ. Low-dose CoQ10 treatment group; LMQ. Medium-dose CoQ10 treatment group; LHQ. high-dose CoQ10 treatment group. * and ** respectively represent significant and extremely significant differences compared with CON group, # and ## respectively represent significant and extremely significant differences compared with LPS group, + and ++ respectively represent significant and extremely significant differences compared with LDQ group, э represent significant differences compared with LMQ group (*, #, +, э.P < 0.05, **, ##, ++, ээ.P < 0.01). The same as below 图 1 小鼠肺组织W/D和BALF蛋白浓度 Fig. 1 W/D and BALF protein concentrations in mouse lung tissue |
小鼠肺组织形态学观察结果(图 2A)显示，CON组和CHQ组小鼠肺组织未见异常。LPS组小鼠肺组织存在大量炎性细胞浸润和出血的现象，肺泡壁增厚、肺泡腔狭窄。LDQ组、LMQ组和LHQ组小鼠上述现象均明显减少，其中LHQ组小鼠上述现象改善的更加显著。肺损伤评分结果(图 2B)显示，LPS组、LDQ组和LMQ组肺损伤评分均极显著地高于CON组(P < 0.01)，LHQ组、CHQ组则分别与CON组无统计学差异。LDQ组、LMQ组和LHQ组肺损伤评分均极显著地低于LPS组(P < 0.01)。LMQ组和LHQ组肺损伤评分均极显著地低于LDQ组(P < 0.01)。LHQ组肺损伤评分极显著地低于LMQ组(P < 0.01)。
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A.组织学观察，红色箭头指出血，黑色箭头指肺泡壁增厚，蓝色箭头指炎性细胞浸润；B.肺损伤评分 A. Morphological observation, red arrows indicate hemorrhage, black arrows indicate alveolar wall thickening, and blue arrows indicate inflammatory cell infiltration; B. Lung injury scores 图 2 小鼠肺组织形态学观察结果(200×) Fig. 2 Morphological observation of lung tissue in mice (200×) |
氧化应激指标检测结果如图 3所示：与CON组相比，LPS组小鼠肺组织MDA和ROS含量极显著升高(P < 0.01)，SOD活性和GSH含量极显著降低(P < 0.01)；LDQ组小鼠MDA和ROS含量极显著升高(P < 0.01)，SOD活性显著降低(P < 0.05)，GSH含量无显著性差异；LMQ组小鼠MDA和ROS含量显著升高(P < 0.05)，SOD活性和GSH含量无显著性差异；LHQ组、CHQ组的上述指标均无显著性差异。与LPS组相比，LDQ组、LMQ组和LHQ组小鼠肺组织MDA和ROS含量极显著减少(P < 0.01)，SOD活性和GSH含量均显著升高(P < 0.05，P < 0.01)。与LDQ组相比，LMQ组MDA含量极显著降低(P < 0.01)，ROS水平显著降低(P < 0.05)，SOD活性和GSH含量无显著性差异；LHQ组小鼠MDA含量和ROS水平均极显著降低(P < 0.01)，SOD活性和GSH含量极显著升高(P < 0.01)。与LMQ组相比，LHQ组MDA和ROS含量显著降低(P < 0.05)，SOD活性极显著升高(P < 0.01)，GSH含量显著升高(P < 0.05)。
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图 3 小鼠肺组织氧化应激指标检测结果 Fig. 3 Detection results of oxidative stress indicators in mouse lung tissue |
TUNEL检测结果显示(图 4)，LPS组、LDQ组、LMQ组小鼠TUNEL阳性细胞明显多于CON组。LDQ组、LMQ组和LHQ组TUNEL阳性细胞明显少于LPS组。小鼠肺组织细胞凋亡率即TUNEL阳性细胞率结果(图 5)显示，与CON组相比，LPS组、LDQ组、LMQ组小鼠肺组织TUNEL阳性细胞率均极显著升高(P < 0.01)。与LPS组相比，LDQ组、LMQ组和LHQ组细胞凋亡率均极显著降低(P < 0.01)。与LDQ组相比，LMQ组和LHQ组TUNEL阳性细胞率均极显著降低(P < 0.01)。与LMQ组相比，LHQ组TUNEL阳性细胞率极显著降低(P < 0.01)。LHQ组、CHQ组与CON组均无显著性差异。
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图 4 小鼠肺组织TUNEL检测结果(400×) Fig. 4 TUNEL test results of mouse lung tissue (400×) |
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图 5 小鼠肺组织细胞凋亡率 Fig. 5 Apoptosis rate of mouse lung tissue |
小鼠肺组织线粒体细胞凋亡高置信基因表达检测结果见图 6。与CON组相比，LPS组小鼠肺组织中线粒体细胞凋亡高置信基因Bax、Cyt-c、Caspase-9和Caspase-3 mRNA表达量均明显增加，Bcl-2 mRNA表达明显减少。与LPS组相比，LDQ、LMQ、LHQ组小鼠Bax、Cyt-c、Caspase-9和Caspase-3 mRNA表达量均明显减少，Bcl-2表达明显增加。与LDQ组相比，LMQ组、LHQ组Bax、Cyt-c和Caspase-3 mRNA表达量均明显减少。与LMQ组相比，LHQ组小鼠Bax、Cyt-c、Caspase-9和Caspase-3 mRNA表达量均明显减少，Bcl-2 mRNA表达明显增加。
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数值为颜色标尺，颜色越红，指示基因表达量越高；颜色越蓝，指示基因表达量越低 The value is the color scale, the redder the color, the higher the indicator gene expression; The bluer the color, the lower the indicator gene expression 图 6 小鼠肺组织线粒体细胞凋亡高置信基因表达结果 Fig. 6 High-confidence gene expression results of mitochondrial apoptosis in mouse lung tissue |
MKP-1/Nrf2信号通路关键蛋白表达结果(图 7)显示，与CON组相比，LPS组小鼠Nucleus Nrf2、Total Nrf2和MKP-1蛋白表达量均极显著减少(P < 0.01)；LDQ组小鼠Nucleus Nrf2和Total Nrf2蛋白表达量显著减少(P < 0.05)，MKP-1无显著性差异；CHQ组、LMQ组、LHQ组上述指标均与CON组无显著性差异。与LPS组相比，LDQ组Nucleus Nrf2蛋白表达量显著升高(P < 0.05)，Total Nrf2无显著差异，MKP-1蛋白表达量极显著升高(P < 0.01)；LMQ组Nucleus Nrf2和MKP-1蛋白表达量极显著升高(P < 0.01)，Total Nrf2表达量显著升高(P < 0.05)；LHQ组Nucleus Nrf2、Total Nrf2、MKP-1的蛋白表达量均极显著升高(P < 0.01)。与LDQ组相比，LMQ组Nucleus Nrf2蛋白表达量显著升高(P < 0.05)，MKP-1、Total Nrf2的蛋白表达量均无显著性差异；LHQ组Nucleus Nrf2蛋白表达量极显著升高(P < 0.01)，Total Nrf2、MKP-1蛋白表达量显著升高(P < 0.05)。与LMQ组相比，LHQ组Nucleus Nrf2、Total Nrf2蛋白表达量虽升高，但无显著差异，MKP-1蛋白表达量显著升高(P < 0.05)。
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图 7 小鼠肺组织MKP-1/Nrf2信号通路相关蛋白表达结果 Fig. 7 Expression of MKP-1/Nrf2 signaling pathway related proteins in mouse lung |
CoQ10作为一种内源性合成、安全且耐受性俱佳的脂溶性化合物，具有多种重要的生物活性和细胞调节功能。近年来，外源性补充CoQ10对动物机体器官损伤的改善作用引起了世界范围内兽医学和医学研究领域科研工作者研究的热潮。通过荟萃分析发现，CoQ10的脏器保护剂量和给药时间没有统一标准。外源性补充0.2和1.2 mg·kg-1的CoQ10均可减弱氧化应激，遏制小鼠肺肿瘤的侵袭和转移[20]。连续3 d补充50 mg·(kg·d)-1CoQ10，可改善七氟醚诱导的脑细胞线粒体功能损伤，缓解小鼠认知障碍[21]。每天给予小鼠100 mg·kg-1 CoQ10，应用14 d，可减弱脓毒症所诱导的小鼠肝损伤[22]。然而本课题组预试验发现，小鼠连续口服100 mg·kg-1 CoQ10 14 d，肺组织会出现轻度损伤现象。此外，外源性补充的CoQ10被外周组织吸收后再重新分布到血浆中至少需要2周时间[23]。因此，综合考虑CoQ10的抗氧化作用、线粒体保护效能及体内分布时间，最终本研究选用2、10、50 mg·kg-1 CoQ10，连续给药14 d，来探究CoQ10对LPS致小鼠ALI的作用及机制。结果发现，CoQ10呈剂量依赖性地降低了ALI小鼠肺组织W/D值和BALF蛋白浓度，改善了肺泡壁增厚、肺泡腔狭窄、炎性细胞浸润和肺出血等肺组织病理学损伤，降低了肺损伤评分，表明CoQ10对LPS诱导的ALI小鼠具有保护作用。
持续大量产生ROS会使小鼠体内抗氧化防御系统能力超负荷，DNA、脂质和蛋白质被破坏，驱动氧化应激反应。氧化应激是ALI发病过程中非常重要的机制。当肺部ROS持续大量产生时，肺上皮和内皮屏障结构会被破坏，细胞膜通透性明显增加，肺水肿现象加重，肺组织损伤程度被放大。MDA作为一种氧化损伤特异性生物标志物，能够反应出动物体内受氧自由基攻击后细胞组织损伤的严重程度。酶促SOD和非酶促GSH是机体抗氧化防御系统的主要成分，可通过清除氧自由基来减缓组织细胞氧化应激损伤，其水平越低表示机体抗氧化能力越弱[24]。Han等[8]研究表明，LPS通过降低小鼠肺组织SOD活性，增加MDA、H2O2含量，诱导氧化应激，造成肺损伤。与Han等[8]研究结果一致，本试验中LPS极显著地增加了MDA和ROS水平，减少了SOD活性和GSH含量，表明LPS能削弱ALI小鼠肺组织的抗氧化能力。研究发现，外源性补充CoQ10可明显改善线粒体功能，遏止ROS和脂质过氧化物的生成，减少脂滴的累积[25]。与前人研究结果一致，本研究发现2、10和50 mg·kg-1 CoQ10均可不同程度显著地降低MDA和ROS含量、增加SOD活性及GSH水平，表明CoQ10可增强ALI小鼠肺抗氧化防御系统能力，清除氧自由基，改善氧化损伤。
细胞凋亡是机体细胞自主有序的一种程序性死亡过程，具有极其重要的生物学意义。然而，过度的细胞凋亡则会造成心、肝、肺等多种脏器组织损伤[26]。大量研究已经阐明，细胞凋亡参与了ALI的病理过程[27]。本试验也表明，鼻内滴入LPS可使小鼠肺组织中的凋亡细胞及TUNEL凋亡率均极显著地升高，且凋亡细胞主要位于肺泡。研究揭示，遏抑氧化应激和线粒体内源性细胞凋亡，改善线粒体功能障碍，可缓解LPS所致的大鼠ALI[28]。Bcl-2(抗凋亡蛋白)和Bax(促凋亡蛋白)是线粒体内源性细胞凋亡途径中关键的调节因子。当细胞受刺激时，Bax便从细胞质中被募集到线粒体外膜形成Bax寡聚体，并与Bcl-2结合，打开线粒体通透性转换孔，释放Cyt-c，激活Caspase-9和Caspase-3，引发细胞凋亡[29]。本试验中，LPS极显著地下调了Bcl-2 mRNA的表达，提高了Bax、Cyt-c、Caspase-9和Caspase-3 mRNA的表达，表明LPS能触发ALI小鼠肺组织细胞凋亡。Naderi等[30]研究发现，外源性补充CoQ10能遏抑Bax向线粒体外膜募集，关闭通透性转换孔，阻断促凋亡因子的释放。CoQ10也可以扼制Caspase级联反应，进而阻断线粒体细胞凋亡途径的激活[13, 31]。与前人研究结果一致，本研究中，2、10和50 mg·kg-1 CoQ10均不同程度的下调了ALI小鼠肺组织Bax、Cyt-c、Caspase-9和Caspase-3 mRNA的表达，上调了Bcl-2 mRNA的表达，其中，50 mg·kg-1 CoQ10效果更佳，综上，CoQ10可显著遏止ALI小鼠肺组织线粒体内源性细胞凋亡，从而减缓小鼠ALI。
MKP-1是一种丝裂原激活蛋白激酶磷酸酶，广泛分布于哺乳动物的内脏中，其中，肺、心和肝中含量最高[32]。激活的MKP-1通过与Nrf2中的Neh2结构域相互作用而上调Nrf2活性，促使其在细胞核中稳定积累，并驱使抗氧化反应元件介导的相关基因的转录，上调抗氧化因子的表达。Luo等[14]研究发现，敲除MKP-1会抑制Nrf2信号通路的激活，加重毒素诱导的小鼠肝损伤。上调MKP-1基因的表达会缓解慢性缺氧引发的小鼠肺动脉高压[33]。Hou等[34]研究揭示，激活Nrf2信号通路可阻止LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡和屏障结构破坏，减轻ALI。本研究发现，LPS极显著降低了Nucleus Nrf2、Total Nrf2和MKP-1的蛋白表达，提示LPS诱导小鼠ALI与其抑制MKP-1/Nrf2信号通路激活有关。2、10和50 mg·kg-1 CoQ10不同程度地提高了Nucleus Nrf2、Total Nrf2和MKP-1的蛋白表达量，且50 mg·kg-1 CoQ10效果更佳，结果表明，CoQ10对ALI小鼠的保护作用可能与其激活MKP-1/Nrf2通路有关。
4 结论CoQ10可通过激活MKP-1/Nrf2信号通路，增强小鼠抗氧化应激能力，减少ROS产生，抑制线粒体内源性细胞凋亡，从而改善LPS诱导的小鼠ALI。
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(编辑 白永平)