犬乳腺肿瘤是全世界范围内严重威胁雌性犬健康的第二大恶性肿瘤，仅次于皮肤肿瘤，发病率和死亡率逐年上升^[1]。复发和转移是造成肿瘤患犬死亡的主要原因。手术切除是目前治疗犬乳腺肿瘤的常用方法，辅助放疗及化疗，因此，迫切需要探索犬乳腺肿瘤细胞转移的生物学机制，开发靶向治疗犬乳腺肿瘤的方法。

Zeste基因增强子同源物2 (enhancer of Zeste homolog 2，EZH2) 是多梳蛋白抑制复合物2 (polycomb repressive complex 2，PRC2) 的催化亚基，是一种关键的组蛋白甲基转移酶和EMT诱导因子，在胚胎发育、细胞增殖及细胞周期调节中起重要作用，可通过其SET结构域催化核小体组蛋白H3的第27位赖氨酸(H3K27) 发生三甲基化修饰，甲基化后的H3K27 me3可将PRC2复合物募集到特定的基因位点，进而抑制靶基因的转录，促进肿瘤细胞的EMT进程和肿瘤的转移^[2]。前期课题组研究发现，EZH2在犬乳腺肿瘤中的表达升高，且与淋巴结转移及分级相关^[3]。EZH2基因和蛋白在人浸润性乳腺癌和转移癌中的表达显著高于正常和良性乳腺肿瘤，高表达的EZH2与高组织学分级(Ⅲ级)、淋巴结转移、临床分期、肿瘤大小、阴性激素受体状态呈正相关，过表达EZH2可促进永生化人乳腺上皮细胞系的生长和细胞侵袭^[4-6]。EZH2与肿瘤进展密切相关，在乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌、肝癌、犬乳腺肿瘤等多种恶性肿瘤中异常高表达，促进肿瘤细胞增殖、迁移和分化、EMT和肿瘤转移中发挥着关键作用，被认为是恶性肿瘤靶向治疗的重要候选蛋白^{[3, 7-10]}。

EZH2抑制剂已被报道在治疗癌症时发挥有效的抗肿瘤活性，其中，GSK126被认为是一种高选择性EZH2抑制剂，也是一种新合成的s-腺苷蛋氨酸竞争性抑制剂，可以抑制野生型和突变型的EZH2^[11]，通过小分子抑制剂靶向EZH2可显著降低癌细胞活力、侵袭、血管生成并增加细胞凋亡，这表明靶向EZH2是治疗多种恶性肿瘤的潜在治疗靶标^[12-13]。目前，犬乳腺肿瘤细胞中关于EZH2靶向治疗的研究尚未报道，因此，本研究旨在探究GSK126抑制剂对犬乳腺肿瘤细胞增殖、迁移、凋亡及上皮-间质转化的影响，为犬乳腺肿瘤的治疗提供新思路。

1 材料与方法 1.1 细胞系与试剂

犬乳腺肿瘤系CHMm由日本东京大学外科实验室馈赠，GSK126抑制剂购自美国Selleck公司，Annexin-FITC/PI凋亡检测试剂盒、Western及IP细胞裂解液、BCA检测试剂盒购自上海碧云天生物技术公司，噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)及双抗(青霉素、链霉素)购自美国Sigma公司，胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培养基购自美国Hyclone公司，EZH2、E-cadherin、N-cadhein、Vimentin购自北京博奥森Bioss公司，GAPDH、Bcl-2、Bax购自沈阳万类生物公司，β-actin、山羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体(horseradish peroxidase，HRP-IGg)和山羊抗鼠HRP-Igg酶标抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，Trizol试剂购自Invitrogen公司；逆转录试剂盒、Real-time PCR试剂购自TaKaRa公司，引物设计和合成由上海生工生物工程有限公司完成，Transwell小室、细胞培养瓶和细胞培养板购自美国Corning Incorporated公司，Applied Biosystems 7500荧光定量PCR仪器购自美国ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 　　将犬乳腺肿瘤细胞系CHMm置于含10%胎牛血清、100 μmol·mL^-1青霉素、100 mg·L^-1链霉素的DMEM培养基中，在37 ℃、5%CO₂及饱和湿度下的细胞培养箱中常规培养，细胞呈贴壁生长状态，待细胞达80%~90%融合经0.25%的胰蛋白酶消化后，传代培养。

1.2.2 MTT法检测细胞的增殖情况 　　取对数生长期CHMm细胞，用胰蛋白酶消化、制备成单细胞悬液，调整浓度至1×10³·mL^-1，接种于96孔培养板，待贴壁生长后，去除培养基，加入不同终浓度的EZH2抑制剂GSK126(0、10、20、40 μmol·L^-1)，继续培养48 h，向每孔加入10 μL MTT(5 mg·mL^-1) 工作液，37 ℃继续培养4 h后，加入DMSO溶液终止培养，利用酶标仪检测490 nm下的吸光值(A)，根据公式计算抑制剂GSK126处理组相对于对照组的细胞存活率：细胞存活率(%)=A_处理组/A_对照组× 100%。

1.2.3 细胞克隆形成率的检测 　　取对数生长期的CHMm细胞，接种于6孔板中，每孔500个细胞，待细胞贴壁后，加入不同浓度的GSK126，置于37 ℃、5%CO₂培养箱内连续培养12 d后，每3 d更换一次培养液，观察细胞的生长情况，PBS液清洗3次，每孔用4%多聚甲醛固定30 min。用0.1%吉姆萨(Giemsa)溶液500 μL染色20 min，PBS清洗3次，室温下干燥，倒置拍照，将平皿置于一张带网格的胶片上，用肉眼直接计细胞集落数。

1.2.4 Transwell法检测细胞迁移能力 　　取经不同浓度抑制剂GSK126干预48 h的CHMm细胞，用胰蛋白酶消化，用无血清的DMEM培养基重悬，使细胞密度为5.0×10⁵·mL^-1，小室上层加入试验组和处理组细胞悬液2.0×10⁵·mL^-1，下层加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于24孔板，继续培养48 h，用10%的多聚甲醛固定30 min，无菌医用棉签擦除滤膜上层细胞，0.1%的结晶紫染色，将小室置于倒置显微镜拍照(100×)。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 　　根据Annexin-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明进行操作，收集经不同浓度GSK126处理的CHMm细胞1×10⁶个，经预冷的PBS缓冲液冲洗后，加入195 μL Annexin-FITC结合液后轻轻吹散细胞，加入5 μL Annexin-FITC和10 μL PI，轻轻混匀，室温避光反应15 min后，采用BD FACS Canto Ⅱ流式细胞仪检测细胞凋亡情况。细胞凋亡率=(早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数)/总细胞数×100%

1.2.6 实时荧光定量PCR (real-time PCR)检测 　　收集各组GSK126干预48 h的CHMm细胞，采用Trizol法提取各组细胞的总RNA后，1%琼脂糖凝胶电泳测定RNA完整性，用紫外分光光度仪(Eppendorf)测定总RNA浓度及纯度后，用PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒将提取的RNA反转录为cDNA，-80 ℃保存。根据TB Green Prime Ex Taq^TM Ⅱ试剂盒说明书配制20 μL反应体系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10.0 μL、10 μmol·L^-1上下游引物各0.8 μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，cDNA 2.0 μL，ddH₂O 6 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s；PCR反应95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环。以GAPDH和β-actin为内参对照，引物序列见表 1。用2^-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。-ΔΔCt=(Ct_目的基因-Ct_内参基因)_处理组-(Ct_目的基因-Ct_内参基因)_对照组。

1.2.7 蛋白免疫印迹试验(Western blot)检测细胞凋亡相关蛋白、EMT相关蛋白表达 　　收集经抑制剂GSK126处理的各组CHMm细胞，用Western及IP细胞裂解液置于冰上裂解细胞30 min，12 000 r·min^-1离心20 min后，取上清液于EP管，BCA试剂盒测定上清液中总蛋白浓度，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamideg elelectrophoresis，SDS-PAGE)后切取目的蛋白胶进行转膜，5%脱脂牛奶室温孵育蛋白膜条带室温封闭2 h，一抗Anti-β-actin 1∶3 000、Anti -GAPDH 1∶2 000、Anti-Bcl-2 1∶1 000、Anti-Bax 1∶1 000、Anti-E-cadherin 1∶750、Anti-N-cadherin 1∶750、Anti-EZH2 1∶750、Anti-Vimentin 1∶750一抗4 ℃孵育过夜，随后使用TBST摇床洗涤3次，15 min·次^-1，加入相应的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗孵育2 h后，使用TBST再洗涤3次，加上超强型化学发光试剂显影，凝胶成像系统拍照。以β-actin和GAPDH作为内参，采用Image J分析软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法

数据分析采用GraphPad Prism8.0统计软件。计量资料以“x±s”表示，多组间样本比较采用单因素方差分析(one way ANOVA)。*.P < 0. 05表示差异显著，**.P < 0. 01表示差异极显著。

2 结果 2.1 EZH2抑制剂GSK126对CHMm细胞增殖的影响

MTT结果显示，与对照组比较，随着EZH2抑制剂GSK126药物浓度的升高，CHMm细胞存活率不断降低，差异具有统计学意义(P < 0. 05，图 1A)，GSK126抑制CHMm细胞的增殖呈明显的剂量依赖性。细胞克隆形成试验结果显示，GSK126处理组细胞集落形成显著低于对照组的细胞，且随着GSK126浓度的增加，CHMm细胞集落形成逐渐减少(图 1B和1C)。以上结果提示，EZH2抑制剂GSK126具有明显抑制犬乳腺肿瘤CHMm细胞的增殖能力。

2.2 EZH2抑制剂GSK126对CHMm细胞迁移能力的影响

Transwell试验结果显示，与对照组比较，不同浓度的GSK126处理组中CHMm细胞穿膜细胞数逐渐降低，且随GSK126量升高而降低，呈浓度依赖性，在高浓度作用下抑制作用尤为明显(图 2)，提示GSK126能有效抑制犬乳腺肿瘤细胞的迁移能力。

2.3 EZH2抑制剂GSK126对CHMm细胞凋亡及凋亡相关因子表达的影响

流式细胞仪检测结果显示，如图 3所示，不同浓度的GSK126作用CHMm细胞48 h后，与对照组相比，细胞凋亡率随着GSK126浓度的升高而逐渐升高(P < 0.05)(图 3A、3B)，此外，GSK处理后CHMm细胞中Bcl-2 mRNA和蛋白的表达随着药物浓度的增加逐渐降低(图 3C、3E和3F)(P < 0.05或P < 0.01)，Bax mRNA和蛋白表达明显升高(P < 0.05或P < 0.01)(图 3D、3E和3G)，呈明显的浓度依赖性，提示GSK126诱导犬乳腺肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。

2.4 EZH2抑制剂GSK126对CHMm中EMT相关基因和蛋白的影响

RT-PCR和Western blot结果如图 4所示，与对照组相比，不同浓度的GSK126处理48 h后CHMm细胞中的E-cadherin mRNA(图 4A)和蛋白表达(图 4E和4F)明显升高(P < 0.05或P < 0.01)，N-cadherin(图 4B、4E和4G)、Vimentin(图 4C、4E和4H)、EZH2(图 4D、4E和4K) mRNA和蛋白表达逐渐降低(P < 0.05或P < 0.01)，呈浓度依赖性，提示EZH2抑制剂GSK126参与调节上皮-间质转化。

3 讨论

EZH2是一个关键的基因表达表观遗传学调控因子，在染色质结构形成、基因表达调控和DNA损伤等多种机制中发挥核心作用，影响核糖体DNA的稳定性，参与控制转录记忆和基因沉默，在多种类型恶性肿瘤中呈过表达，已被证明发挥致癌作用，细胞转录机制的失调可能导致细胞类型的丧失和肿瘤转化，并作为某些恶性肿瘤的预后因素^[14]，因此，过表达的EZH2对犬乳腺肿瘤的发生与发展有至关重要的作用。

GSK126是一种新型的EZH2抑制剂，已被证明在各种类型的癌症中影响肿瘤细胞功能，且EZH2抑制剂GSK126可以显著抑制多种肿瘤细胞增殖、侵袭和转移及诱导细胞凋亡，而不影响正常细胞，被认为是一种新型的抗肿瘤药物，正在进行中的GSK126治疗复发/难治性淋巴瘤和实体瘤的Ⅰ期临床试验的初步结果令人鼓舞^[11]。其他研究发现，GSK126通过Rho/ROCK信号通路介导的EMT靶向EZH2抑制胃癌细胞增殖、诱导细胞凋亡^[15]。GSK126能有效降低多发性骨髓瘤细胞中甲基化组蛋白3 (H3K27 me3)水平^[16]，此外，GSK126可抑制肺腺癌细胞侵袭、迁移和血管生成^[13]。EZH2过表达与子宫内膜癌患者的无病生存期和总生存期不良显著相关；EZH2沉默导致细胞活力和侵袭能力下降，凋亡增加，此外，EZH2沉默可增强紫杉醇和顺铂对子宫内膜癌细胞的敏感性^[17]。EZH2抑制剂GSK126抑制EZH2活性导致骨髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)数量的增加和参与抗肿瘤免疫的CD4⁺、IFN⁺CD₈⁺T细胞的减少；加入中和抗体对抗骨髓分化抗原GR-1或吉西他滨/5-氟尿嘧啶缺失的MDSCs可缓解MDSC介导的免疫抑制，增加CD4⁺和CD8⁺T细胞肿瘤浸润和GSK126疗效，提示EZH2抑制可诱导原始造血祖细胞向髓系分化，通过调节肿瘤免疫微环境可以提高EZH2抑制剂的疗效^[18]。与研究结果一致，本研究结果显示，EZH2抑制剂GSK126作用于犬乳腺肿瘤CHMm细胞后，利用MTT检测细胞增殖情况，处理48 h能明显抑制细胞的生长增殖与迁移能力，且增殖抑制率受抑制剂药物浓度的影响，EZH2抑制GSK126处理后细胞转移能力明显降低，表明EZH2抑制剂GSK126具有抑制CHMm细胞增殖与转移能力，EZH2与犬乳腺肿瘤细胞活性密切相关。

诱导细胞凋亡是抑制肿瘤恶性转化的基本方式之一，Bcl-2家族与细胞凋亡发生发展密切^[19]。在多发性骨髓瘤细胞中，GSK126处理可诱导caspase-3活化且Bcl-2家族中抑制凋亡的MCL-1表达水平下调，促凋亡的Bim和Bax的显著上调，触发线粒体凋亡通路^[16]。GSK126抑制舌鳞状细胞癌细胞的增殖及诱导细胞凋亡，降低细胞内p-ERK、Bcl-2的表达水平，增加Bax、Cleaved caspase-9的表达水平^[20]。GSK126可能通过降低p-AKT和Bcl-2表达抑制细胞增殖，升高Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表达，诱导肺腺癌细胞凋亡^[21]。本研究证实，与对照组相比，随着GSK126浓度的升高，细胞凋亡率逐渐增加，降低抗凋亡基因Bcl-2表达，促进促凋亡基因Bax的表达，提示GSK126诱导CHMm细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。

EMT的发生，可促使肿瘤发生早期的浸润和转移，其中，E-cadherin蛋白的降低是促使细胞发生EMT的一个关键步骤。EZH2的过表达在大部分癌细胞中促进了EMT的发生，但是在少数研究中发现，EZH2表现出了抑制肿瘤发生发展的特性^[22]，如siRNA EZH2/GSK126诱导卵巢癌细胞发生EMT样变化，上调ZEB2表达，TGF-β处理降低了EZH2和H3K27 me3与ZEB2启动子的结合，提示EZH2抑制了EMT^[23]，因此，有必要研究抑制EZH2后癌细胞侵袭迁移和EMT相关基因的表达变化。GSK126能显著抑制前列腺癌PC-3和DU145细胞的迁移和侵袭，上调E-cadherin mRNA和蛋白表达、下调N-cadherin、Vimentin mRNA表达^[24]。敲除EZH2可抑制多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)细胞的增殖和迁移，同时增加替莫唑胺(temozolomide，TMZ)的敏感性。此外，敲除EZH2或其特异性抑制剂GSK126可降低Twist的表达，而过表达Twist可逆转si-EZH2抑制的GBM细胞恶性肿瘤^[25]。GSK126抑制膀胱癌T24细胞增殖、侵袭和迁移及显著下调Vimentin、β-catenin及EZH2 mRNA和蛋白相对表达量，显著上调E-cadherin mRNA和蛋白相对表达量^[26]。本试验结果提示，EZH2抑制剂GSK126处理犬乳腺肿瘤CHMm细胞48 h后，E-cadherin基因和蛋白的相对表达量较对照组明显升高，而N-cadherin、Vimentin、EZH2基因和蛋白的相对表达明显降低，且具有明显的剂量依赖性，进一步证实EZH2抑制剂可以抑制CHMm细胞的EMT过程。提示EZH2抑制剂抑制CHMm细胞增殖和转移能力的机制之一为抑制犬乳腺肿瘤CHMm细胞的EMT过程，有可能成为有效抑制犬乳腺肿瘤细胞生长的靶向治疗的新靶点。

4 结论

EZH2抑制剂GSK126能有效抑制体外培养犬乳腺肿瘤CHMm细胞增殖、诱导细胞凋亡和抑制EMT过程，提示EZH2抑制剂GSK126是一种潜在有价值的治疗犬乳腺肿瘤的方法，EZH2作为治疗犬乳腺肿瘤的一种有价值的肿瘤治疗靶点。