2. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室, 哈尔滨 150069
2. State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute, CAAS, Harbin 150069, China
猫疱疹病毒1型(feline herpesvirus type-1, FHV-1)和猫杯状病毒(feline calicivirus, FCV)是引发猫上呼吸道感染的主要病原[1]。FHV-1属于疱疹病毒科，α-疱疹病毒亚科成员[2]，是有囊膜的双股DNA病毒，只有一个血清型。FHV-1引起的猫科动物上呼吸道急性高度接触性传染病也被称作猫传染性鼻气管炎[3]，该病发病率极高，成年猫和幼猫均易感，尤其是幼猫，感染后可引起死亡。临床上以喷嚏、角膜结膜炎、嗜睡及精神沉郁等为主要特征。FCV为杯状病毒科，水疱疹病毒属成员[4]。FCV在猫群中广泛分布，多感染幼龄猫，感染后引起的临床症状为口腔溃疡、急性呼吸道疾病、鼻炎、跛行、肺炎等。由于FHV-1、FCV感染引起的临床症状相似，故很难通过临床诊断确诊，通常需要实验室分子生物学方法进行鉴别诊断。
同时, FHV-1常与FCV混合感染[5]，因两种病毒增殖速度差异巨大，给病原的分离鉴定带来极大的困难。本研究曾尝试多种方法从FHV-1和FCV混合感染的临床病料中分离两种病毒均以失败告终后，最终采用血清中和方法成功分离出FHV-1，并对其生物学特性进行鉴定。目前国内外尚未见从FHV-1和FCV混合感染的临床病料中分离两种病毒的报道，因此本研究为FHV-1流行株的分离、鉴定提供了有效方案，丰富了FHV-1的流行病学及病原学数据，为猫上呼吸道疾病的诊断、治疗和防控提供必要的技术支撑。
1 材料与方法 1.1 病料与细胞眼、鼻拭子取自哈尔滨某猫舍患上呼吸道感染的病猫，临床表现为喷嚏、食欲不振、眼鼻分泌物多、严重结膜炎；猫肾细胞(CRFK)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所自然疫源性人兽共患病创新团队保存；昆明鼠购自辽宁长生生物技术有限公司。
1.2 主要试剂和仪器病毒核酸(DNA/RNA)提取试剂盒购自AXYGEN公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)购自TaKaRa公司；1640培养基、胎牛血清(FBS)、0.25%Trypsin-EDTA购自Gibco公司；2×Taq Plus Master Mix Ⅱ(Dye Plus)购自Vazyme公司；DNA Marker DL2000购自TaKaRa公司；NaRed Ⅱ核酸染料购自北京派拓科技有限公司；QuickAntibody-Mouse5 W佐剂购自北京博奥龙免疫技术有限公司；FITC标记羊抗鼠IgG购自Sigma公司；FITC标记的山羊抗猫IgG购自Jackson ImmunoResearch公司；胶回收试剂盒购自Omega生物公司；FHV-1 HR-1株及其猫源阳性血清由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所自然疫源性人兽共患病创新团队保存；PCR仪购自博日科技有限公司；DYY-6D电泳仪电源购自北京六一生物科技有限公司；倒置荧光显微镜购自Nikon公司。
1.3 病料PCR/RT-PCR检测利用AxyPrep病毒核酸提取试剂盒提取病料拭子核酸，分别用FHV-1[6]、FCV[7]、猫衣原体[8](chlamydophila felis, C felis)的特异性鉴定引物进行检测，引物序列见表 1，由库美生物科技有限公司合成。FCV的反转录体系及程序参照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒说明书。FHV-1、FCV和C felis的PCR扩增体系为：2×Taq Plus Master Mix Ⅱ(Dye Plus)10 μL，ddH2O 6 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，共20 μL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32个循环；72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
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表 1 引物序列信息 Table 1 Information of primer sequences |
将采集的病猫的眼、鼻拭子置于1 mL含有青霉素(1 000 U·mL-1)和链霉素(1 000 U·mL-1)的灭菌PBS中，4 ℃过夜后取800 μL上清接种于单层CRFK细胞，每天观察细胞病变(cytopathic effect, CPE)，约90%细胞出现病变时，收集培养基上清并分装。取每一代上清1 mL接种细胞进行连续3次传代，每一代进行PCR/RT-PCR检测。
1.5 鼠抗FCV多克隆抗体的制备将传至第三代获得的单纯FCV病毒培养物，利用20%蔗糖进行超速离心，去除杂蛋白。纯化后的病毒(1×107PFU·mL-1)用3‰甲醛于4 ℃灭活24 h，与佐剂体积比1∶1混合。每只小鼠接种100 μL混合物，共接种10只小鼠。免疫完成后，利用血清中和试验检测抗体中和活性及效价，细胞感染FHV-1及FCV后利用间接免疫荧光试验(IFA)检测血清的特异性。
1.6 混合病毒中FHV-1的分离取40 μL混合感染病料拭子细胞培养第一代产物，1∶1加入1640培养基进行稀释，共80 μL，充分混匀后，将其分装为35、25、10、5 μL共4只离心管，再分别向每只离心管中加入80 μL鼠抗FCV多克隆抗体，37 ℃孵育1 h，每管补加1640培养基至200 μL后接入长满单层CRFK细胞的24孔板中，37 ℃孵育1 h，更换为每孔500 μL含2% FCV血清的1 640培养基，约90%细胞出现病变时，收集培养基上清，连续传三代，每一代进行PCR/RT-PCR检测。
1.7 FHV-1的增殖与鉴定1.7.1 FHV-1分离株的增殖 将单纯FHV-1病毒液接入单层CRFK细胞，使用含2% FBS的1640培养基维持。观察CPE，待90%细胞出现病变时，冻融离心收集上清，－80 ℃保存备用。
1.7.2 FHV-1分离株病毒形态鉴定 分离的FHV-1传至第四代，1 500 r·min-1离心10 min去除细胞碎片，收集15 mL细胞病变上清，将上清10 000 r·min-1离心90 min，弃上清，沉淀用500 μL PBS重悬，送至中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中心电镜室进行病毒粒子形态的透射电镜观察。
1.7.3 FHV-1分离株IFA鉴定 将FHV-1分离株接种于6孔板单层CRFK细胞，同时设阴性对照。培养24 h出现明显CPE时，弃上清，依次进行－20 ℃预冷甲醇固定、封闭，加入FHV-1阳性血清为一抗、FITC标记的山羊抗猫IgG二抗，于荧光倒置显微镜下观察结果。
1.7.4 FHV-1分离株生长动力学试验 以感染复数(MOI)为0.01感染CRFK细胞，吸附1 h后，更换为含2%FBS的1640培养基，37 ℃培养。分别在12、24、36、48、60、72、84 h收集培养上清，重复3份，分别测定每个时间点培养上清中的病毒含量[9]。
1.8 FHV-1分离株基因序列分析提取病毒DNA，按参考文献[10]所述方法对FHV-1 gD基因ORF序列进行扩增(引物序列见表 1)。反应体系及程序参照LA Taq试剂盒说明书。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后按照胶回收试剂盒方法进行回收，回收产物与pMD18-T载体连接后转化至DH5α感受态细胞，提取质粒并鉴定，阳性重组质粒送至库美生物科技有限公司进行测序。对测序结果和GenBank上已发表的FHV-1 gD基因核酸序列进行同源性比对分析，并构建FHV-1 gD基因系统遗传进化树。
2 结果 2.1 病料PCR/RT-PCR检测采集的猫眼鼻拭子PCR结果显示，FHV-1阳性、FCV阳性、C felis阴性。判定为FHV-1、FCV混合感染。
2.2 病毒分离培养病料拭子接种CRFK细胞，连续传代三次，第一、二代培养上清PCR/RT-PCR检测结果为FHV-1(625 bp)、FCV(174 bp)阳性，且FHV-1第二代培养物条带亮度降低；第三代只检测到FCV(图 1)。传代过程中发现，FCV与FHV-1相比，病变速度极快，具有明显的生长优势，由此分离出FCV。
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M. DL2000 DNA Marker；1.FHV-1阳性对照；2~4.病料拭子1~3代培养物FHV-1检测结果；5.FHV-1阴性对照；6.FCV阳性对照；7~9.病料拭子1~3代培养物FCV检测结果；10.FCV阴性对照 M. DL2000 DNA Marker; 1. FHV-1 positive control; 2-4. FHV-1 test results of 1-3 generations of culture from swab; 5. FHV-1 negative control; 6. FCV positive control; 7-9. FCV test results of 1-3 generations of culture from swab; 10. FCV negative control 图 1 病料拭子分离培养三代产物PCR/RT-PCR检测结果 Fig. 1 PCR/RT-PCR detection results of three generations of products isolated from swab samples |
FCV分离株经超离纯化后，病毒滴度为1.3×108PFU·mL-1，免疫小鼠制得的多克隆抗体，针对亲本株FCV的中和效价>1 280。IFA鉴定特异性结果显示，此多抗只与FCV结合产生较明亮的特异性绿色荧光，与FHV-1的反应结果和空白对照细胞相当(图 2)，无明显荧光，说明鼠抗FCV多克隆抗体特异性较高，可用于中和混合病毒里的FCV粒子。
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A.感染FCV的CRFK细胞；B.感染FHV-1的CRFK细胞；C.正常CRFK细胞 A. CRFK cells infected with FCV; B. CRFK cells infected with FHV-1; C. Normal CRFK cells 图 2 FCV抗体特异性检测结果(200×) Fig. 2 FCV antibody specificity test results (200×) |
35 μL(A组)、25 μL(B组)、10 μL(C组)、5 μL(D组)的第一代细胞培养物与80 μL鼠抗FCV多克隆抗体混合后接种细胞，连续进行传代培养，命名为混合1代、2代和3代。结果显示，A、B组的混合1代~3代均观察到CPE：其中混合1代PCR/RT-PCR检测FHV-1(625 bp)、FCV(174 bp)均阳性，混合2代、3代PCR/RT-PCR检测FHV-1阴性、FCV阳性；C组混合1、2代未观察到CPE，PCR/RT-PCR检测结果FHV-1、FCV均阴性，第3代观察到CPE，PCR/RT-PCR检测结果FHV-1阳性、FCV阴性；D组三代均未观察到CPE，且PCR/RT-PCR检测结果FHV-1、FCV均阴性(图 3)。C组完全中和混合病毒中的FCV，成功分离出FHV-1，命名为HRB2019株。
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A~D.分别对应A~D组。泳道：M.DL2000 DNA Marker；1.FHV-1阳性对照；2~4.病料拭子1~3代培养物FHV-1检测结果；5.FHV-1阴性对照；6.FCV阳性对照；7~9.病料拭子1~3代培养物FCV检测结果；10.FCV阴性对照 A-D.Represent A-D groups corespondingly. Lane: M. DL2000 DNA Marker; 1. FHV-1 positive control; 2-4. FHV-1 test results of 1-3 generations of culture from swab; 5. FHV-1 negative control; 6. FCV positive control; 7-9. FCV test results of 1-3 generations of culture from swab; 10. FCV negative control 图 3 利用FCV血清中和试验分离混合病毒中的FHV-1 Fig. 3 Isolation of FHV-1 from mixed viruses using FCV serum neutralization assay |
CRFK细胞在接种HRB2019株后的24 h开始出现细胞圆缩、聚集、空斑等的疱疹病毒感染导致的典型细胞病变，测得HRB2019株的病毒滴度为1×108.43 TCID50·mL-1。电镜观察CRFK细胞感染HRB2019株的超离后产物，可见明显的疱疹病毒典型形态的病毒粒子，成球形、有囊膜、直径约为200 nm；以FHV-1猫源阳性血清为一抗，FITC标记的山羊抗猫IgG为二抗，对分离病毒株进行IFA鉴定，结果显示，感染HRB2019株的CRFK出现特异性绿色荧光，对照组正常CRFK细胞无荧光；以MOI为0.01的HRB2019株感染CRFK细胞，每隔12 h取细胞上清进行病毒含量检测，绘制的生长曲线显示，病毒接种细胞后12 h开始复制，12~36 h快速增殖，48~72 h进入增殖平台期且滴度达到高峰，84 h病毒滴度开始下降(图 4)。
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A.HRB2019分离株电镜观察结果。B. HRB2019分离株的IFA鉴定结果(200×): a.感染HRB2019株的CRFK细胞；b.正常CRFK细胞。C. HRB2019分离株生长动力曲线 A. Electron microscope observation results of HRB2019 strain. B. IFA identification results of HRB2019 strain (200×): a. CRFK cells infected with HRB2019 isolate; b. Normal CRFK cells. C. Growth dynamic curve of HRB2019 strain 图 4 HRB2019株鉴定结果 Fig. 4 Identification results of HRB2019 strain |
将HRB2019株与国内外流行的FHV-1毒株gD基因核酸序列进行核苷酸同源性及遗传进化分析，结果显示，HRB2019株(▲表示)与GenBank收录的国内外猫源FHV-1流行株核苷酸同源性100%，但与一株虎源的广东分离株亲缘关系较远(KJ466150)，核苷酸同源性为99.8%，说明FHV-1的宿主特异性较高(图 5)。
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图 5 HRB2019分离株gD基因系统进化树 Fig. 5 Phylogenetic tree of gD gene of HRB2019 strain |
目前，我国是仅次于美国的宠物犬、猫饲养大国，犬、猫数量位居全球第二。引起猫上呼吸道感染综合征的主要病原微生物包括FHV-1、FCV、衣原体、支气管败血性博代氏杆菌、支原体、呼肠孤病毒等。其中，由FHV-1、FCV引起的病毒性感染占上呼吸道综合征总发病率的85%以上[11]，FHV-1和FCV混合感染也十分常见。牛昊岩等[12]对2018—2019年南京市2 249例宠物猫病例的调查统计显示，传染病占总病例数的14.32%，最常见的为上呼吸道感染，其中，FHV-1和FCV的混合感染占总数的8.33%；李丽景[13]在2020—2021年对西南部分地区FHV-1和FCV的感染情况进行了分子流行病学调查，183份发病猫拭子样本中FHV-1、FCV混合感染率为10.14%。由此可见，FHV-1和FCV的混合感染在猫上呼吸道病中的比例极高，加之宠物医院所使用的诊断试剂在准确性、敏感性等存在不足，常常造成漏诊的现象，给猫上呼吸道病的诊断和防治带来巨大的挑战。
本研究发现，FCV与FHV-1相比，存在明显的生长优势，有FCV存在时，细胞病变速度快、病毒滴度高，会抑制FHV-1在细胞上的复制与增殖，且FCV病毒滴度远高于FHV-1。研究中笔者尝试用鸡胚尿囊膜途径接种病毒、siRNA体外干扰、噬斑纯化、红细胞凝集特性、差异化细胞培养等方法分离FCV与FHV-1，均以失败告终。FCV病毒本身具有高变异的特性，抗血清对非亲本毒株不能表现完全中和活性[14]。故本研究先利用FCV的生长优势分离出FCV，并制备其特异性抗血清，通过血清中和试验摸索能完全中和FCV且FHV-1能病变的血清中和条件。结果发现，在病毒稀释倍数较低的A、B组，FCV抗血清不能完全中和FCV，依然表现为FCV和FHV共存，且FCV具有压倒性生长优势而不能分离出FHV-1；而D组在病毒高稀释倍数条件下，FCV和FHV-1含量过低，其中的FCV被其抗血清完全中和，而FHV-1的含量不足以感染足够数量的细胞发生肉眼可见的病变。最终摸索出最佳血清中和条件为C组，即FCV抗血清与混合毒体积比为8∶1，从而成功中和FCV并分离出FHV-1。在已有的猫呼吸道病原分离鉴定的研究报道中，部分研究者习惯于将病料先接种细胞增殖培养后再进行病原鉴定，这很容易造成无生长优势的病原在培养过程中丢失。按照本研究的病毒分离方法可以很大程度避免在分离混合感染病料时对FHV-1的漏检，提高了FHV-1的分离率，为了解FHV-1的真实感染情况提供了理论依据，为众多动物疫病混合感染的研究提供了技术支撑。
当前国内使用的猫鼻气管炎、杯状病毒、泛白细胞减少症的三联疫苗仍为上世纪80年代研制的进口疫苗，国产猫疫苗还处于研发阶段，因此对猫群中主要传染性病原的分离与研究是重中之重。本文建立的FHV-1、FCV混合感染病毒的分离方法，为FHV-1及FCV的分离提供了新思路，对加快FHV-1病原学、疫苗学、分子生物学研究的步伐起到重要作用，为我国猫疫苗的开发的研究奠定了基础。
4 结论本研究利用血清中和试验从FCV、FHV-1混合感染的病猫拭子中分离出1株FHV-1，经形态学观察、体外培养特性鉴定及gD基因的遗传进化分析，确认该毒株为FHV-1，并命名为HRB2019株。
| [1] |
吴振华, 宋立刚, 刘殿波. 猫上呼吸道感染的诊断与治疗[J]. 山东畜牧兽医, 2017, 38(2): 26-27. WU Z H, SONG L G, LIU D B. Diagnosis and treatment of upper respiratory tract infection in cats[J]. Shandong Journal of Animal Science and Veterinary Medicine, 2017, 38(2): 26-27. DOI:10.3969/j.issn.1007-1733.2017.02.014 (in Chinese) |
| [2] |
扈荣良. 现代动物病毒学[M]. 北京: 中国农业出版社, 2014. HU R L. Modern animal virology[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2014. (in Chinese) |
| [3] |
DAVISON A J, EBERLE R, EHLERS B, et al. The order herpesvirales[J]. Arch Virol, 2009, 154(1): 171-177. DOI:10.1007/s00705-008-0278-4 |
| [4] |
王洁, 廖均乐, 钱鹏, 等. 猫杯状病毒的进化与致病性研究进展[J]. 中国兽医杂志, 2021, 57(2): 62-65. WANG J, LIAO J L, QIAN P, et al. Advances in the evolution and pathogenicity of feline calicivirus[J]. Chinese Journal of Veterinary Medicine, 2021, 57(2): 62-65. (in Chinese) |
| [5] |
RUCH-GALLIE R A, VEIR J K, HAWLEY J R, et al. Results of molecular diagnostic assays targeting feline herpesvirus-1 and feline calicivirus in adult cats administered modified live vaccines[J]. J Feline Med Surg, 2011, 13(8): 541-545. DOI:10.1016/j.jfms.2010.12.010 |
| [6] |
萧晟, 熊冉, 苑文涛, 等. 3种猫疱疹病毒Ⅰ型检测方法的比较[J]. 安徽农业大学学报, 2019, 46(3): 394-400. XIAO S, XIONG R, YUAN W T, et al. Comparison of detection on feline herpesvirus-1 by three methods[J]. Journal of Anhui Agricultural University, 2019, 46(3): 394-400. (in Chinese) |
| [7] |
刘迪, 郑亚婷, 许鑫燕, 等. 检测猫杯状病毒RT-qPCR方法的优化与应用[J]. 中国兽医学报, 2022, 42(1): 53-60. LIU D, ZHENG Y T, XU X Y, et al. Optimization and application of RT-qPCR assay for detection of feline calicivirus[J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 2022, 42(1): 53-60. (in Chinese) |
| [8] |
SYKES J E, ALLEN J L, STUDDERT V P, et al. Detection of feline calicivirus, feline herpesvirus 1 and Chlamydia psittaci mucosal swabs by multiplex RT-PCR/PCR[J]. Vet Microbiol, 2001, 81(2): 95-108. DOI:10.1016/S0378-1135(01)00340-6 |
| [9] |
TAI S H S, NⅡKURA M, CHENG H H, et al. Complete genomic sequence and an infectious BAC clone of feline herpesvirus-1 (FHV-1)[J]. Virology, 2010, 401(2): 215-227. DOI:10.1016/j.virol.2010.02.021 |
| [10] |
孙春艳, 钱鹏, 王洁, 等. 猫疱疹病毒1型的分离鉴定及gD基因序列分析[J]. 动物医学进展, 2020, 41(3): 30-35. SUN C Y, QIAN P, WANG J, et al. Isolation and identification of cat herpesvirus type 1 and sequence analysis of gD gene[J]. Progress in Veterinary Medicine, 2020, 41(3): 30-35. (in Chinese) |
| [11] |
于志海. 猫上呼吸道感染综合征防治[J]. 山东畜牧兽医, 2016, 37(2): 64. YU Z H. Prevention and treatment of upper respiratory tract infection syndrome in cats[J]. Shandong Journal of Animal Science and Veterinary Medicine, 2016, 37(2): 64. (in Chinese) |
| [12] |
牛昊岩, 张曦予, 马庆博, 等. 2018—2019年南京某宠物医院2249例宠物猫疾病调查与统计分析[J]. 畜牧与兽医, 2021, 53(3): 115-120. NIU H Y, ZHANG X Y, MA Q B, et al. Investigation and statistical analysis of 2249 cases of feline diseases in a pet hospital in Nanjing from 2018 to 2019[J]. Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2021, 53(3): 115-120. (in Chinese) |
| [13] |
李丽景. 西南部分地区猫疱疹病毒Ⅰ型和猫杯状病毒感染的分子流行病学调查[D]. 成都: 西南民族大学, 2021. LI L J. Molecular epidemiological investigation of feline herpesvirus type Ⅰ and feline calicivirus infection in parts of southwest China[D]. Chengdu: Southwest Minzu University, 2021. (in Chinese) |
| [14] |
RADFORD A D, DAWSON S, COYNE K P, et al. The challenge for the next generation of feline calicivirus vaccines[J]. Vet Microbiol, 2006, 117(1): 14-18. |
(编辑 范子娟)