2. 农业农村部(福建)蜜蜂生物学科学观测站, 福州 350002
2. Honeybee Biology Observation Station, Ministry of Agriculture and Rural Affairs (Fujian), Fuzhou 350002, China
蜜蜂(Apis)是农业生产最重要的授粉昆虫，全球大约35%的粮食产量依赖于蜜蜂等授粉昆虫[1]。随着现代农业的发展，单一作物大规模种植是常见模式，更突显了蜜蜂等社会性昆虫授粉的优越性和重要性。然而，生存环境的碎片化和污染的日益加剧，各种疾病的侵袭流行[2]，使蜜蜂等授粉昆虫的生存面临诸多挑战[3]。尤其在过去十几年里，世界范围内出现大量的蜂群损失[4]警示人们，东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae等造成的流行性病害对全球蜂产业影响严重[5]，深入研究病原与寄主的互作机制是创新有效防控措施和保障蜜蜂健康的必要路径。
近期研究建议将东方蜜蜂微孢子虫N. ceranae由Nosema属转移到Vairimorpha(变形孢虫属)，故以下称V. ceranae[6]。自2005年，Huang等[7]首次在意蜂中发现N. ceranae以来，受到世界普遍关注。对以往样本的研究表明，V. ceranae在西方蜜蜂中至少存在45年以上[8]，远早于Fries等[9]1996年首次从北京的中蜂中发现的时间。从本团队此前与Fries博士通讯中了解到，他早期在非洲及欧洲的蜂群中没有发现该病原[7]。因此，综合目前研究结果推测，V. ceranae在西方蜜蜂中是近20年才大规模传播，且取代西方蜜蜂微孢子虫V. apis成为侵染蜜蜂的主要微孢子虫种类[10]。
中肠是蜜蜂食物消化吸收的主要场所，又是解毒和对病原免疫的第一道关口[11]，而V. ceranae专性寄生于蜜蜂中肠细胞，破坏肠道的消化吸收、新陈代谢、免疫等功能，缩短蜜蜂寿命[12]。寄生还破坏了肠道的菌群稳态，导致Snodgrassella、双歧杆菌等肠道核心菌群相对丰度显著变化[13-15]，肠道内酵母菌和念珠菌增加[16]，可能引发肠道功能失调，改变蜜蜂的免疫和基因的表达[17]，导致疾病易感性增加[13]。室内研究表明，V. ceranae感染幼蜂初期，defensin等抗菌肽基因表达显著下调[18]；过氧化氢酶、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等抗氧化酶活性显著升高[19]。自然感染的蜂群中，随日龄增加，感染个体比率增加，程度加重[20]；采集蜂中的免疫基因表达受显著抑制[5]。但转录组研究表明，西方蜜蜂工蜂在感染初期(5 d)受显著影响的基因数量比感染10和15 d的多；微孢子通过干扰西方蜜蜂工蜂的氨基酸代谢、抑制抗菌肽基因表达等方式抑制了寄主的免疫水平[21]；中蜂工蜂在感染孢子后，中肠的细胞免疫和体液免疫反应与意蜂并不完全相同[17]。转录组研究提供了寄主肠道基因差异表达的重要信息，但由于基因表达与蛋白的时空差异，以及基因表达后的调控，蛋白质组与转录组的一致性并不高，而蛋白质才是最后参与生理代谢过程的分子。因此，从蛋白质层面研究蜜蜂微孢子虫与寄主的相互作用更有助于揭示互作关系。Vidau等[22]通过蛋白二维电泳结合质谱分析发现，感染10 d对寄主的能量产生、先天免疫、蛋白调控生化过程有显著影响，发现工蜂肠道14种差异蛋白；无标蛋白质组学研究发现，感染4 d后显著上调的16个肠道蛋白中，胶原蛋白IV可能与肠道对抗孢子感染有关[23]。已有的蛋白质组研究主要集中在感染前期(4 d)和中期(10 d)，研究数量也很有限。在此，本研究采用串联质谱标签(tandem mass tags，TMT)定量蛋白分析系统分析西方蜜蜂工蜂在感染后期(18 d)的差异蛋白质，通过分析分子通路解析中肠的免疫应答机制，为后续研究提供参考。
1 材料与方法 1.1 东方蜜蜂微孢子虫的提取在前期检测有感染微孢子虫的蜂群巢门口抓取归巢采集蜂50~100只，装入塑封袋中，置于冰上冻晕，拉出肠道后，剪下中肠，放入1.5 mL离心管中，加入1 mL 0.1 mol·L－1磷酸缓冲液(PBS)和一颗4 mm氧化锆珠，每个离心管中放入10条中肠。将离心管放入高通量组织研磨仪(SCIENTZ-48)中以60 Hz、研磨30 s，再6 000×g离心5 min(Eppendorf 5418 R离心机)，弃上清液后，用移液器小心移除上层灰色的组织碎片层，只留管底的白色沉淀，再加入适量PBS悬浮，重复前述离心和手工清除操作至少2次至上清液清澈为止。将孢子液吹打混匀后，稀释100倍，在显微镜下(300×)用细胞计数板计算孢子数，用50%蔗糖溶液配制成浓度为104个·μL－1的孢子悬液待用。
1.2 接种用西方蜜蜂工蜂的准备西方蜜蜂蜂群来自福建省福清市花果山蜂场(119.426462°E，25.730724°N)，从3群蜂中各提出1张老熟封盖子脾，放入34 ℃温箱中，每24 h收取羽化工蜂(计为0日龄)，放入一次性自制圆形饲养盒(PE材质，480 mL)中，每盒装入60只，一共装6盒。每盒配1个由5 mL圆底离心管钻一小孔改造成的饲喂器，内装50%(V/V)的蔗糖溶液，同时另设1管供由代用花粉(四川唯蜂生物科技有限公司生产)和50%的蔗糖等量搭配均匀的蛋白饲料，每2~3 d更换1次饲料，饲喂至5日龄。
1.3 工蜂的接种与饲养5日龄时，6盒工蜂随机平分为对照组和感染组。取当天提纯并配制成含104个·μL－1孢子的50%蔗糖液饲喂3盒感染组，48 h后换成无孢子的50%灭菌糖液。对照组只饲喂50%灭菌糖液。饲养盒置于30 ℃培养箱中饲养。每日记录并清除死亡个体，每3日称饲喂器重量，以计算蔗糖消耗量。
1.4 工蜂中肠蛋白提取取1 mL离心管，加入1粒氧化锆珠，50 μL蛋白裂解液(8 mol·L-1尿素+1%SDS，1%蛋白酶抑制剂)。在工蜂感染18 d(23日龄)时，每盒工蜂取25只装袋，将工蜂冰上冻晕后解剖出中肠，1只中肠放入1个装有预冷蛋白裂解液的试管中，将试管放入事先在超低温冰箱(Haier)中预冷过的冰盒中，放置3 min后，用高通量组织研磨仪60 Hz、研磨15 s后取出放回冰盒，从每个离心管中移出2 μL研磨液，稀释100倍后用于孢子的显微计数以便统计每只工蜂的感染情况；其余溶液放入-80 ℃冰箱保存。感染情况一致(V. ceranae孢子数约在0.8×107~1.2×107范围)的中肠样本每盒挑出6只，将感染组6只×3盒，对照组6只×3盒委托上海美吉生物医药科技有限公司进行串联质谱标签定量蛋白分析。
1.5 工蜂中肠总蛋白质浓度测定及SDS-PAGE凝胶电泳用BCA法定量中肠蛋白浓度，用SDS-PAGE观察中肠蛋白分布情况。简要步骤为：中肠组织研磨液经16 000×g、4 ℃离心30 min取上清，加入5倍体积预冷的丙酮，-20 ℃沉淀过夜；12 000×g、4 ℃离心30 min，收集沉淀；沉淀加入90%预冷的丙酮清洗并风干，沉淀用适量蛋白裂解液溶解，离心取蛋白上清。然后使用BCA定量法(Thermo Scientific Pierce BCA试剂盒)测定总蛋白含量：各样品均取4 μL与16 μL水混合，再加200 μL BCA工作液，震荡混匀，37 ℃反应30 min，然后读取562 nm吸光度(SPECTRA MAX酶标仪)，再根据牛血清白蛋白制作的标准曲线计算样品的蛋白浓度，最后用SDS-PAGE凝胶电泳观察蛋白质的分布。
1.6 微孢子虫感染西方蜜蜂工蜂中肠的蛋白质组研究1.6.1 工蜂中肠蛋白的还原烷基化和酶解 取中肠蛋白样品100 μg，加入三乙基碳酸氢铵缓冲液(triethylammonium bicarbonate buffer，TEAB)，使TEAB终浓度为100 mmol·L－1。然后加入三氯乙基磷酸酯(trichloroethyl phosphate，TCEP)，使TCEP终浓度为100 mmol·L－1，在37 ℃下反应60 min。接着加入碘乙酰胺(iodoacetamide，IAM)，使IAM终浓度为40 mmol·L－1，在室温下避光反应40 min。之后每管各加入预冷的丙酮，-20 ℃沉淀4 h。10 000×g离心20 min，取沉淀。用100 μL 100 mmol·L－1 TEAB充分溶解样品。最后按照酶∶蛋白(m/m)=1∶50加入胰蛋白酶，37 ℃酶解过夜。
1.6.2 工蜂中肠酶解液的串联质谱标签标记 从-20 ℃冰箱中取出串联质谱标签(TMT)试剂(Thermo Fisher)恢复到室温，离心，加入乙腈，涡旋离心，每100 μg蛋白加入1管TMT试剂，室温孵育2 h，加入羟胺(Hydroxylamine)，室温放置30 min。
1.6.3 高pH RPLC第一维分离 用Thermo Scientific Vanquish Flex二元UHPLC系统分离。首先用UPLC上样缓冲液(氨水调至pH10的2%乙腈)复溶多肽样品，用反相C18柱ACQUITY UPLC BEH C18 Column1.7 μm，2.1 mm×150 mm(Waters，USA)进行高pH液相分离。A相为2%乙腈(氨水调至pH=10)，B相为80%乙腈(氨水调至pH=10)，紫外检测波长为214 nm，流速为200 μL·min-1，梯度为48 min。根据峰型和时间共收取20个馏分，合并成10个馏分，真空离心浓缩后，用质谱上样缓冲液(2%乙腈0.1%甲酸)溶解，进行第二维分析。
1.6.4 液相串联质谱 数据采集软件：Thermo Xcalibur 4.0(Thermo, USA)，反相柱信息：C18 column(75 μm×25 cm, Thermo, USA)，色谱仪器：Easy-1200(Thermo, USA)质谱仪器：Q_Exa ctive HF-X(Thermo, USA)，色谱分离时间：120 min，A相：2%乙腈0.1%甲酸；B相：80%乙腈0.1%甲酸，流速：300 nL·min-1，MS扫描范围(m/z)为350-1300，采集模式为DDA(数据依赖型采集模式)，选择母离子中信号最强的20个进行二级碎裂。一级质谱分辨率为70 000 aum，AGC target 3×106，最大注入时间20 ms，碎裂方式HCD(高能诱导裂解)；二级分辨率35 000 aum，AGC target 1×105，最大注入时间50 ms，fixed first mass：100 m·z-1；minimum AGC target 8×103，Intensity threshold 1.6e5，动态排除时间18 s。
1.6.5 数据库搜索 数据库选择NCBI上Apis mellifera的蛋白质数据库(Taxonomy ID: 7460)，查库使用软件版本为Proteome DiscovererTM Software 2.2。查库时将raw文件提交至Proteome Discoverer服务器(Thermo Fisher)，选择已经建立好的数据库，然后进行数据库搜索。最后利用该公司自主开发的生物信息分析平台(美吉生信云分析平台)进行分析。
1.7 数据统计方法用SPSS软件进行单因素生存分析(Kaplan Meier)，计算存活率并绘制生存曲线。蛋白浓度和糖液消耗使用Microsoft Excel计算平均值，用t Test比较组间差异显著性。
2 结果 2.1 西方蜜蜂工蜂感染后的生存曲线和食物消耗给5日龄工蜂饲喂含104个·μL-1的孢子糖液48 h后，在30 ℃恒温正常饲养18 d，存活率仅为34.81%，显著低于对照组(71.85%)(P < 0.05，图 1)，说明感染对工蜂生存造成严重损害，与相关报道吻合[20]；但感染组的每只工蜂每日消耗的蔗糖溶液量与对照组无显著差异(P>0.05，图 2)。
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图 1 西方蜜蜂工蜂接种东方蜜蜂微孢子18 d后的生存曲线 Fig. 1 Survival curve of Apis mellifera workers after 18 days of inoculation with V. ceranae |
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图 2 西方蜜蜂工蜂接种东方蜜蜂微孢子后的单只工蜂糖液平均日消耗量 Fig. 2 The average daily consumption of sucrose solution by each Apis mellifera worker after inoculation with V. ceranae |
感染组23日龄工蜂中肠的平均蛋白浓度为(1.393±0.019)μg·μL-1，显著低于对照组的(1.595±0.126)μg·μL-1(P < 0.05)。通过SDS-PAGE凝胶电泳显示感染组在35、60 ku处的蛋白条带灰度略低于对照组(图 3)，各组间条带的平行性较好，符合后续试验要求。通过胰蛋白酶酶解后，肽段长度大多分布在7~18aa之间，酶解过程比较充分且一致。一共检测到的二级图谱数为557 175，其中匹配的肽段图谱数为130 265，其中鉴定到的肽段数量为26 347，鉴定到的蛋白质数量为6 730，鉴定到的蛋白质group数量为3 840。以上调或下调的差异倍数大于1.2倍并且P < 0.05作为差异显著的标准，结果获得差异显著的蛋白565个，与对照相比，感染组显著上调的蛋白有301个，显著下调的蛋白有264个。
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图 3 对照组与微孢子虫感染组西方蜜蜂工蜂中肠蛋白SDS-PAGE图谱 Fig. 3 SDS-PAGE of mid-gut proteins of Apis mellifera worker with/without V. ceranae inoculation |
通过从生物过程(Biological processes)、细胞组成(Cellular component)、分子功能(Molecular function)3个方面对差异蛋白进行GO富集(图 4)。结果显示，工蜂在感染微孢子虫后，中肠的细胞进程(Cellular process)、代谢进程(Metabolic process)、细胞解剖形态(Cellular anatomical entity)、蛋白质复合物(Protein containing complex)、分子结合(Binding)、催化活性(Catalytic activity)等多个代谢过程出现了显著变化。
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纵坐标表示上调/下调蛋白数目，纵坐标0以上为上调蛋白的数目，0以下为下调蛋白的数目，横坐标表示富集到的二级条目 The ordinate represents the number of up-regulated/down-regulated proteins, the value above 0 represents the number of up-regulated proteins, that value below 0 represents the number of down-regulated proteins, the abscissa represents the enriched secondary entry 图 4 西方蜜蜂工蜂感染东方蜜蜂微孢子虫后中肠差异蛋白GO功能注释富集图 Fig. 4 Enrichment graph of midgut differential protein GO function annotation, of which infected with V. ceranae in Apis mellifera worker |
通过KEGG通路富集，可以观察到上调蛋白中，氨酰-tRNA生物合成(Aminoacyl-tRNA biosynthesis)、内质网中的蛋白质加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)、不同类型的N-聚糖生物合成(Various types of N-glycan biosynthesis)3个通路差异显著(图 5)。下调蛋白富集到丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(Alanine, aspartate and glutamate metabolism)、代谢通路(Metabolic pathways)、淀粉和蔗糖的代谢(Starch and sucrose metabolism)和精氨酸和脯氨酸代谢(Arginine and proline metabolism)等19个代谢通路有显著差异(图 6)，说明感染对中肠中的氨基酸、蛋白质合成、糖类代谢过程有显著影响。
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横坐标表示通路，纵坐标为富集率，P < 0.001标记为***，P < 0.01标记为**，P < 0.05标记为*。下同 The abscissa represents the pathway, the ordinate represents the enrichment rate. P < 0.001 is marked as ***, and P < 0.01 is marked as **, P < 0.05 is marked as *. The same as below 图 5 西方蜜蜂工蜂感染东方蜜蜂微孢子虫后上调的中肠差异蛋白KEGG通路富集图 Fig. 5 Enrichment graph of up-regulated differential protein KEGG pathway, of which infected with V. ceranae in Apis mellifera worker |
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图 6 西方蜜蜂工蜂感染东方蜜蜂微孢子虫后下调的中肠差异蛋白KEGG通路富集图 Fig. 6 Enrichment graph of down-regulated differential protein KEGG pathway, of which infected with V. ceranae in Apis mellifera worker |
对蛋白质组数据分析发现，微孢子虫感染导致中肠大部分重要消化酶下降，严重损害了中肠的消化功能。其中α-淀粉酶(Alpha-amylase，Uniprot accession No: Q9U8X5))显著下调3.84倍。肽酶S1(Peptidase S1)家族在西方蜜蜂中有73个同系物(肽酶数据库MEROPS，https://www.ebi.ac.uk/merops/)[23]，感染导致中肠肽酶中的A0A088AEY3，A0A088AKU3，A0A087ZN39分别显著下调3.79、2.27、1.78倍，而A0A087ZQQ2显著上调了2.5倍。Houdelet等[24]的无标蛋白质组也检测到该酶有显著变化。动物中肽酶S1家族除参与消化蛋白外，还参与止血、发育、细胞凋亡、免疫和细胞信号转导等过程[23]，推测感染中肠中该酶的显著变化与消化和免疫功能下降密切相关。
2.6 免疫和抗氧化相关蛋白差异分析KEGG中Toll和Imd通路，Toll样受体信号通路中，革兰阴性菌结合蛋白(Gram-negative bacteria-binding protein 1-2(A0A087ZV12)，GNBP1-2)显著上调4.12倍，而在感染过程中起重要免疫作用的防御素(Defensin-1(P17722))却显著下调3.47倍；但Imd信号通路无显著表达差异蛋白。分析还发现，感染中肠多个抗氧化酶显著差异，其中，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase(A0A1B1 JID1)，SOD)上调1.56倍；谷胱甘肽S转移酶1 (Glutathione-S-transferase 1(Q6IVB7)，GST1)上调1.29倍；由oxyR基因调控的、有重要抗氧化作用的烷基过氧化氢还原酶C(Alkyl hydroperoxide reductase C(A0A087ZTI1))显著上调2.04倍，该酶通过催化烷基过氧化物和NADH生成乙醇、水和NAD，解除烷基过氧化物对细胞的毒性。但过氧化物酶(peroxidase(A0A088A0S4))显著下调1.22倍；兼具营养和抗氧化等多种功能的卵黄原蛋白(Vitellogenin(G5D463))表达下调1.5倍。
3 讨论本研究探讨了西方蜜蜂工蜂在微孢子虫感染后期中肠蛋白质组的差异，结果显示，中肠的能量代谢等多个KEGG信号通路出现了显著的变化。由于KEGG是整合了所有物种的信号通路，而不同物种之间的蛋白和信号转导等方面都存在一定的差异，因此，由感染工蜂KEGG信号通路所提示的差异信息为后续深入挖掘差异蛋白在寄主与微孢子间互作中的功能提供了研究方向。
本研究表明，感染后期工蜂中肠内肽酶等蛋白相关酶类的显著下调，可能是由于严重感染导致肠道细胞蛋白代谢紊乱，进而影响氨基酸的摄取和蛋白质的合成，导致咽下腺等强烈依赖蛋白营养的器官萎缩[25-26]。早春季节，蜂群储粮消耗殆尽所带来营养压力和V. ceranae的感染会使蜜蜂抵御外界病原体和应对环境压力的能力显著降低[27]，加之其他病原和农药等环境污染物的综合作用，可能是蜂群衰竭失调综合征(CCD)的主要原因之一。
在能量代谢方面，目前研究发现被V. ceranae感染的蜜蜂表现出与行为和生理相关的能量胁迫[27]，并增加了它们的食物消耗[28]，以及4种与能量代谢相关的蛋白质MRJP1、MRJP2、MRJP3和α-葡糖苷酶III丰度下降[21]。尽管本研究未发现食物消耗有显著增加，但发现感染组工蜂中肠的α-葡萄糖苷酶、海藻糖酶、海藻糖酶转运酶、磷酸转移酶等糖代谢中关键酶类较对照组显著下调。以海藻糖酶为例，机体储存的糖原很少，运动时所需要的能量主要由消化道中的糖转化而来，海藻糖代谢不足说明蜜蜂在感染后出现了能量应激的状况，V. ceranae对蜜蜂产生了能量上的压力，这种压力可能是来自于消化酶的不足引起的吸收不足，导致海藻糖下降，这一点与以前的报道相似[29]。
在蜜蜂的体液免疫中，第一步依靠模式识别蛋白(pattern recognition protein/receptor，PRP)识别外来病原，并与病原物表面特有的模式分子(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)结合[30]，触发Toll或Imd信号通路，激活相关级联反应，最终诱导NF-κB因子合成抗菌肽等免疫效应分子来清除或杀死病原体[31]。本研究发现，感染后期，Toll信号通路的识别病原侵染的信号分子GNBP 1-2显著上调，而Imd的相关识别蛋白未见显著差异，推测中肠细胞可能主要是能过Toll通路的GNBP 1-2来识别V. ceranae；并且在此阶段防御素的表达显著下降，与感染初期的4种抗菌肽的表达显著下降的模式不同[18]。微孢子虫感染后会导致中肠细胞产生大量的自由基来抵抗感染，机体同时要产生SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、GST等多种酶参与消除过量的自由基以保护肠道。本研究与Houdelet等[24]的研究均显示感染会导致SOD的显著变化，但Dussaubat等[19]未发现SOD活性有显著变化。Vidau等[22]报道，感染工蜂中肠的GST1显著上调，本试验结果也与之类似，并且还同时发现了更多的抗氧化酶表达差异，可能暗示感染后期中肠的抗氧化作用更为强烈。
4 结论综上所述，通过东方蜜蜂微孢子虫感染西方蜜蜂工蜂中肠的差异蛋白质组分析发现了大量的显著差异蛋白，广泛涉及糖类、氨基酸代谢、免疫和抗氧化等生理过程，证明了感染导致消化吸收能力降低，造成能量供应和蛋白质合成紊乱，进一步影响器官发育和机体功能。V. ceranae对蜜蜂的免疫抑制还导致对外界其他病原或刺激物的免疫力下降。这些不良影响与病毒、农药、环境污染等负面因素的共同作用可能是蜂群衰竭失调症的重要原因[32-33]。研究所发现的差异显著蛋白为进一步验证在东方蜜蜂微孢子虫与西方蜜蜂互作中的功能指明了方向，为该病害的防控打下基础。
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(编辑 范子娟)