2. 西北农林科技大学动物医学院, 杨凌 712100
2. College of Veterinary Medicine, Northwest A & F University, Yangling 712100, China
皮肤癣菌病可引起严重的兽医公共卫生问题，据统计，全球约25%人口患有皮肤癣，我国畜牧业生产中兔、牛皮肤癣发病率分别为30.8%和15.35%，宠物猫狗皮肤癣发病率为34%，其中，60%由红色毛癣菌(Trichophyton rubrum，T. rubrum)引起[1-5]。该病常导致动物瘙痒难忍、食欲降低和皮肤受损，严重危害动物福利和畜牧生产[6-7]，同时，皮肤癣在人畜间传播迅速，威胁畜牧从业人员健康[8-9]。化学合成类抗真菌药防治该病效果好，然而，由于抗真菌药物靶点局限和药物种类少，导致耐药菌株频现、临床治疗难度增加和复发频繁[10]。基于此，近年来，从民族药中分离鉴定，抗皮肤癣菌活性好、结构明确、机制新颖的活性单体或先导分子成为抗皮肤癣菌新药研发热点[11]。
当前，研究发现部分民族药含有可破坏T. rubrum膜完整性的活性成分，例如，Trifan等[12]发现厚朴酚和木兰酚能够抑制T. rubrum麦角甾醇合成，从而干扰细胞膜功能和孢子生长；Luo等[13]发现木兰花碱通过抑制角鲨烯环氧酶和CYP51酶活性、降低菌体中麦角甾醇含量，从而破坏T. rubrum细胞膜；Li等[14]发现地锦草主要活性成分鞣花酸可破坏T. rubrum细胞膜完整性发挥抗真菌作用。本实验室选定《苗族医学》[15]收录，治疗皮肤癣效果确切的侧柏叶为研究对象，通过活性追踪方法找到其抗T. rubrum的活性成分，采用GC-MS、透射电镜和qRT-PCR等技术，找到该活性成分抗T. rubrum分子靶点，以期为抗皮肤癣新药研发提供帮助。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 试验菌株 红色毛癣菌(Trichophyton rubrum，ATCC 28188)购自美国菌种保藏中心。
1.1.2 试验药物 侧柏叶由贵州中医药大学附属第一医院初级药师辛加敏惠赠，样品粉碎，过40~60目筛，备用；酮康唑(ketoconazole，纯度≥98%)购自湖北恒硕化工有限公司；α-蒎烯(α-pinene，纯度97%)、β-石竹烯(β-caryophyllene，纯度90%)、3-蒈烯(3-carene，纯度90%)购自北京百灵威科技有限公司。
1.1.3 主要试剂 无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷购自重庆万盛川东化工有限公司；二甲基亚砜(DMSO)购自源叶生物；正庚烷购自阿拉丁公司；以上试剂均为化学分析纯。碘化丙啶(PI)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(Sabouraud Dextrose Agar，SDA)、沙氏葡萄糖肉汤培养基(Sabouraud Dextrose Broth，SDB)购自北京索莱宝科技有限公司。
1.1.4 主要仪器 旋转蒸发仪购自上海亚荣生化仪器厂，恒温培养箱购自上海贺德公司，超净工作台购自上海博讯公司，超声波清洗机购自苏州创惠电子有限公司，Trace ISQ气相色谱四级杆质谱联用仪购自美国赛默飞世尔科技公司，Agilent 5975型气质联用仪购自安捷伦科技有限公司，紫外分光光度计购自上海天美科学仪器有限公司、BD AccuriTM C6 Plus流式细胞仪购自美国BD医疗器械有限公司；Hitachi S-4800S扫描电镜、Hitachi(JEOL-1230)透射电镜购自日本日立电子株式会社。
1.2 方法1.2.1 侧柏叶抗T. rubrum最佳活性部位筛选试验 将100 g侧柏叶粉末浸泡于1 000 mL无水乙醇12 h，超声波振荡提取3次，滤液减压浓缩得到浸膏，随后用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷萃取，所得萃取液再减压浓缩得到各提取部位，溶于DMSO中，配制药物终浓度为50 mg·mL-1，于4 ℃冰箱保存备用。
通过微量肉汤稀释法检测侧柏叶各提取部位对T. rubrum的最低抑菌浓度(MIC)，以气相色谱-质谱联用仪(gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS)检测分析抗菌活性最强提取部位，随后选取该部位3种主要成分进行抑菌试验，MIC最低者即为侧柏叶抗T. rubrum的主要活性成分。
气相色谱条件[16]：Equity-5毛细管色谱柱(20 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度260 ℃，载气为氦气(99.99%)，流速为1 mL·min-1，分流比20∶1，进样量2 μL，升温程序：初始柱温60 ℃保持3 min，以10 ℃·min-1升温到280 ℃，保持20 min。
质谱条件[16]：电子轰击离子源(EI)，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，传输线温度280 ℃，扫描范围：35~600 amu。
1.2.2 T. rubrum孢子萌发试验 采用Liu等[17]的方法，以SDB配制T. rubrum孢子悬液(1.5×104 CFU·mL-1)，加入α-蒎烯至2 MIC和1 MIC为药物测试组，同时设置阳性药物对照(1 MIC酮康唑)和阴性对照(无药物处理)组，随后，在28 ℃，湿度65%下培养24 h，取10 μL菌液置于血球计数板，普通光学显微镜下观察计数各组孢子萌发率。孢子萌发率=各组孢子萌发数/阴性对照组孢子萌发×100%，每组设立3个重复。
1.2.3 电镜观测1.2.3.1 扫描电镜(SEM) 将100 μL T. rubrum孢子悬液(1.5×104 CFU·mL-1)均匀涂布于SDA平板上，在28 ℃，湿度65%下培养5 d后，取5 mm直径菌块移至含有1 MIC α-蒎烯的SDA平板中心作为药物测试组，含有1 MIC酮康唑作为阳性药物对照组，以无药物处理作为阴性对照组，随后，在相同条件下继续培养5 d，参考Da等[18]的SEM样品制备方案处理，最后，使用Hitachi-4800S显微镜(10 kV)观察。
1.2.3.2 透射电镜(TEM) 以10 mL含有T. rubrum(1.5×104 CFU·mL-1)、0.001%吐温80和1 MIC α-蒎烯的SDB为药物测试组，含有1 MIC酮康唑为阳性药物对照组，以无药物处理为阴性对照组；随后，置于28 ℃，湿度65%恒温培养箱中培养5 d；培养完毕后，离心(3 000 r·min-1)5 min收集孢子，并用1×PBS(pH 7.0)洗涤3次，将沉淀的孢子倒入55 ℃琼脂水溶液(15%)中，在室温下冷却，制备为1 mm3立方体，并在4%戊二醛中固定12 h。最后，参考Nishiyama等[19]TEM样品制备方案处理立方体，并使用Hitachi(JEOL-1230)显微镜在75 kV下观察。
1.2.4 T. rubrum细胞内容物流出率试验 采用Liang等[20]的方法，以SDB配制T. rubrum孢子悬液(1.5×104 CFU·mL-1)，加入α-蒎烯至2和1 MIC为药物测试组，同时设置阳性药物对照(1 MIC酮康唑)和阴性对照(无药物处理)组，以25%氢氧化钾-乙醇溶液处理为阳性对照组；随后，置于28 ℃，湿度65%恒温培养箱中培养；于8和24 h，离心(3 000 r·min-1)5 min，取上清液并检测260 nm处紫外吸光值。细胞内容物流出率=各组吸光值/阳性对照组吸光值×100%，每组设立3个重复。
1.2.5 T. rubrum细胞膜完整性试验 采用Lee等[21]方法，以SDB配制T. rubrum孢子悬液(1.5×104 CFU·mL-1)，加入α-蒎烯至1 MIC为药物测试组，同时设置阳性药物对照(1 MIC酮康唑)和阴性对照(无药物处理)组，放于28 ℃，湿度65%恒温培养箱中培养；于8和24 h，离心(3 000 r·min-1) 5 min收集孢子并悬浮于1×PBS(pH 7)，加入碘化丙啶(PI)至1 μg·mL-1，在35 ℃水浴孵育1 h，孵育结束，流式细胞仪分析细胞膜完整性。
1.2.6 T. rubrum麦角甾醇和24(28)脱氢麦角甾醇定性分析试验 采用Arthington-Skaggs等[22]的方法，以SDB配制T. rubrum孢子悬液(1.5×104 CFU·mL-1)，加入α-蒎烯至2和1 MIC为药物测试组，同时设置阳性药物对照(1 MIC酮康唑)和阴性对照(无药物处理)组，随后，置于28 ℃，湿度65%恒温培养箱中培养，于5 d后，过滤培养液收集菌丝，并用无菌蒸馏水清洗，置于60 ℃烘箱中烘干；准确称取0.1 g干燥菌丝置于5 mL 25%氢氧化钾-乙醇溶液，85 ℃水浴1 h；然后向上述液体中加入5 mL水-正庚烷溶液(1∶3)，混匀5 min，待溶液分层后收集正庚烷层液体，于-20 ℃放置24 h；最后，利用紫外分光光度计在240~300 nm检测麦角甾醇和甾醇中间产物24(28)脱氢麦角甾醇含量变化趋势。
1.2.7 T. rubrum麦角甾醇质谱分析试验 采用Müller等[23]的方法，以SDB配制T. rubrum孢子悬液(1.5×104 CFU·mL-1)，加入α-蒎烯至1 MIC为药物测试组，同时设置阳性药物对照(1 MIC酮康唑)和阴性对照(无药物处理)组；T. rubrum麦角甾醇提取方法同“1.2.6”，随后，使用GC-MS分析T. rubrum甾醇型(sterols pattern)。
气相色谱条件：Varian VF-5 ms毛细管色谱柱(20 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度300 ℃，载气为氦气(99.99%)，流速为1.3 mL·min-1，进样量1 μL，升温程序：初始柱温150 ℃保持3 min，以15 ℃·min-1升温到250 ℃，保持20 min，接着以4 ℃·min-1升温到310 ℃，保持5 min。
质谱条件：电子轰击离子源(EI)，电子能量70 eV，气质接口部分温度为270 ℃，离子源温度200 ℃，传输线温度270 ℃，采用Scan模式，扫描范围：m/z 50~600。
1.2.8 实时荧光RT-PCR分析 以SDB配制T. rubrum孢子悬液(1.5×104 CFU·mL-1)，加入α-蒎烯至1/2、1和2 MIC为药物测试组，同时设置阴性对照(无药物处理)组，在28 ℃，湿度65%下培养5 d后，离心(3 000 r·min-1)5 min收集孢子；随后，按照RNA提取试剂盒(武汉塞维尔生物科技有限公司)说明书提取T. rubrum总RNA，并应用紫外分光光度计测定RNA纯度和含量；按照试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司)说明书将RNA逆转录为cDNA进行实时荧光定量PCR。qRT-PCR的基因引物序列见表 1。
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表 1 用于qRT-PCR的基因引物序列 Table 1 Gene primer sequences for qRT-PCR |
数据以“x±s”和“百分数”表示。使用SPSS 22.0统计软件进行卡方检验、最小显著差异分析、Duncan检验和独立t检验分析，P < 0.05表示具有统计显著性，P < 0.01表示具有统计极显著性。
2 结果 2.1 侧柏叶抗T. rubrum最佳提取部位筛选通过微量肉汤稀释法检测出侧柏叶各提取部位对T. rubrum的MIC分别为石油醚段MIC为125 μg·mL-1，乙酸乙酯段为250 μg·mL-1，正丁醇与二氯甲烷段均无抑菌活性；因此对抗T. rubrum活性最强的侧柏叶石油醚段进行GC-MS分析(图 1，表 2)，选取其中3种含量最高单体(α-蒎烯、β-石竹烯和3-蒈烯)，随后检测3种单体对T. rubrum的MIC(表 3)，发现α-蒎烯的MIC低于其他单体，因此，α-蒎烯将作为后续研究对象。
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图 1 侧柏叶石油醚段活性成分总离子流图 Fig. 1 Total ion chromatogram of Cacumen Platycladi petroleum ether segment extract |
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表 2 侧柏叶石油醚段活性成分GC-MS分析 Table 2 GC-MS analysis of components in Cacumen Platycladi petroleum ether segment extract |
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表 3 侧柏叶石油醚段3种主要单体对T. rubrum最低抑菌浓度 Table 3 MICs of 3 main monomers from Cacumen Platycladi petroleum ether fraction against T. rubrum |
将1和2 MIC浓度的α-蒎烯与T. rubrum孢子共同培养24 h，与阴性对照组相比，测试药物组T. rubrum孢子萌发率均极显著降低(P < 0.01)(图 2)，证明α-蒎烯具有抑制T. rubrum孢子萌发的能力，并且该作用呈现剂量依赖性。
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不同小写或大写字母表示显著或极显著差异(P < 0.05或P < 0.01) Different lowercase or uppercase letters indicate significant or highly significant differences (P < 0.05 or P < 0.01) 图 2 药物处理24 h的T. rubrum孢子萌发率 Fig. 2 The spore germination rates of T. rubrum at 24 h post-treatment |
扫描电镜结果显示，对照组菌丝体饱满，表面光滑、厚度均匀(图 3A)；而药物测试组菌丝体萎缩，表面粗糙、褶皱、厚度不一、扭曲干瘪(图 3B、C)。
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A.空白对照；B.1 MIC α-蒎烯；C.1 MIC酮康唑。a.粗糙菌丝体；b.菌丝体出现凹痕；c.扭曲干瘪的菌丝体 A. Control; B. 1 MIC α-pinene; C. 1 MIC ketoconazole. a. Rough mycelium; b. Mycelium appears pitted; c. Twisted shriveled mycelium 图 3 药物处理T. rubrum菌丝5 d后扫描电镜图 Fig. 3 SEM images of T. rubrum myceliums treated with drug for 5 days |
透射电镜结果显示，对照组孢子细胞壁，细胞膜完整，内部结构清晰，可见线粒体和液泡(图 4A)。药物测试组孢子细胞膜破损严重，菌体呈现解体趋势，内部结构发生明显变化，液泡增大，细胞结构无法清晰辨明，大量内容物流出(图 4B、C)。
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A.空白对照；B.1 MIC α-蒎烯；C.1 MIC酮康唑。a.细胞膜；b.细胞壁；c.液泡；d.线粒体；e.细胞质；f.细胞膜受损；g.细胞内容物；h.肿胀的液泡 A. Control; B. 1 MIC α-pinene; C. 2 MIC ketoconazole. a. Cell membrane; b. Cell wall; c. Vacuoles; d. Mitochondria; e. Cytoplasm; f. Damaged cell membrane; g. Cellular contents; h. Swollen vacuoles 图 4 药物处理T. rubrum孢子5 d后透射电镜图 Fig. 4 TEM images of T. rubrum spores treated with drug for 5 days |
将1和2 MIC的α-蒎烯与T. rubrum共同培养8和24 h，经紫外分光光度计检测，结果如图 5所示。发现各浓度α-蒎烯均能极显著增强T. rubrum细胞膜渗透性(P < 0.01)，促进细胞内容物流出，并且该作用与α-蒎烯浓度和处理时间成正相关性。
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图 5 药物处理8和24 h的T. rubrum细胞内容物流出率 Fig. 5 The efflux rates of T. rubrum cells at 8 and 24 h post-treatment |
采用流式细胞仪检测摄入PI的T. rubrum孢子数量(图 6，表 4)，发现药物测试组摄入PI的T. rubrum孢子明显多于阴性对照组，且随着时间的延长，T. rubrum细胞孢子摄入PI的比例在逐渐增大，这表明α-蒎烯能够破坏T. rubrum细胞膜的完整性。
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A、D.空白对照；B、E. 1 MIC α-蒎烯；C、F. 1 MIC酮康唑。左上象限细胞群代表膜受损的细胞，左下象限细胞群代表膜结构完整的细胞 A, D. Control; B, E. 1 MIC α-pinene; C, F. 1 MIC ketoconazole. Cells in the upper left quadrant represent cells with damaged membranes, and cells in the lower left quadrant indicate cells with intact membrane structures 图 6 药物处理8(A~C)和24(D~F)h的T. rubrum孢子PI荧光值 Fig. 6 PI fluorescence values of T. rubrum spores at 8 (A-C) and 24 (D-F) h post-treatment |
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表 4 药物处理8和24 h的T. rubrum膜破损孢子占比 Table 4 The percentages of T. rubrum membrane damaged spores at 8 and 24 h post-treatment |
进行了T. rubrum菌丝体麦角甾醇和24(28)脱氢麦角甾醇含量定性检测(图 7)，结果表明T. rubrum麦角甾醇和24(28)脱氢麦角甾醇含量为阴性对照组>1 MIC α-蒎烯组>2 MIC α-蒎烯组，说明α-蒎烯能够抑制T. rubrum麦角甾醇和24(28)脱氢麦角甾醇的合成，并且该作用呈现剂量依赖性。
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A.空白组；B.1 MIC α-蒎烯；C.2 MIC α-蒎烯; D.1 MIC酮康唑 A. Blank control; B. 1 MIC α-pinene; C. 2 MIC α-pinene; D. 1 MIC ketoconazole 图 7 药物处理5 d的T. rubrum麦角甾醇和24(28)脱氢麦角甾醇含量变化趋势 Fig. 7 Changes in ergosterol and 24(28)dehydroergosterol content of T. rubrum at 5 d post-treatment |
使用GC-MS分析处理5 d后不同处理组T. rubrum的甾醇型气相色谱图，共鉴定出15个甾醇(图 8和表 5)，其中，空白组检出12个，1 MIC α-蒎烯组15个，1 MIC酮康唑组10个。在T. rubrum麦角甾醇合成通路中，ERG3蛋白酶负责将表甾醇转换为5-脱氢表甾醇[25]，结合表 5，作者发现1 MIC α-蒎烯组相较于空白组，5-脱氢表甾醇含量下降但表甾醇的含量上升，这是因为α-蒎烯能够抑制ERG3(sterol C-5 desaturase)的表达，从而阻断表甾醇向5-脱氢表甾醇的转换，同时，只有在1 MIC α-蒎烯组中鉴定出麦角甾烷-7, 24-二烯-3β-醇和胆甾烷-7, 24-二烯-3β-醇，其中，麦角甾烷-7, 24-二烯-3β-醇是ERG3被抑制时的标志甾醇[23]。
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A.空白对照；B.1 MIC α-蒎烯；C.1 MIC酮康唑。1.角鲨烯；2.胆甾烷(内标)；3.角鲨烯环氧化物；4.胆甾醇(内标)；5.酵母甾醇；6.麦角甾醇；7.脱氢麦角甾醇；8.粪甾醇；9.5-脱氢表甾醇；10.表甾醇；11.羊毛甾醇；12.4-甲基雌甾醇；13.4, 4-二甲基胆甾烷-8, 24-二烯-3β-醇(T-MAS)；14.4, 4-二甲基胆甾烷-8, 14, 24-三烯-3β-醇(FF-MAS)；15. 麦角甾烷-7, 24-二烯-3β-醇；16. 胆甾烷-7, 24-二烯-3β-醇 A. Blank control; B. 1 MIC α-pinene; C. 1 MIC Ketoconazole. 1. Squalene; 2. Cholestane (internal standard); 3. Squalene epoxide; 4. Cholesterol (internal standard); 5. Zymosterol; 6. Ergosterol; 7. Dehydroergosterol; 8. Fecosterol; 9. 5-Dehydroepisterol; 10. Episterol; 11. Lanosterol; 12. 4-Methylfecosterol; 13. 4, 4-Dimethylcholesta-8, 24-dien-3β-ol(T-MAS); 14. 4, 4-Dimethylcholesta-8, 14, 24-trien-3β-ol (FF-MAS); 15. Ergosta-7, 22-dien-3β-ol; 16. Cholesta-7, 24-dien-3β-ol 图 8 药物处理5 d的T. rubrum甾醇谱的气相色谱图 Fig. 8 GC-MS of T. rubrum sterol spectrum at 5 d post-treatment |
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表 5 药物处理5 d的T. rubrum麦角甾醇合成途径的甾醇成分变化 Table 5 Sterols pattern changes of ergosterol biosynthesis pathway in T. rubrum spores at 5 d post-treatment |
根据麦角甾醇质谱分析，作者推测α-蒎烯可能抑制了ERG3的表达，为了进一步证实这一猜测，采用qRT-PCR进行检测，结果显示，药物测试组ERG3酶mRNA表达水平低于对照组(P < 0.01，图 9)，并且该作用呈现剂量依赖性。
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不同小写或大写字母表示显著或极显著差异(P < 0.05或P < 0.01) Different lowercase or uppercase letters indicate significant or highly significant differences (P < 0.05 or P < 0.01) 图 9 α-蒎烯对T. rubrum ERG3相对表达量 Fig. 9 Relative expression of α-pinene to T. rubrum ERG3 |
T. rubrum是引起皮肤癣的主要病原体，症状呈瘙痒、皮肤损伤和食欲减退，而治疗周期长、制剂低效和耐药性等问题，导致该病治疗困难[26]，严重危害动物福利和畜牧生产；另外，传统化学抗真菌药物存在种类有限、副作用和耐药性等局限，因此，极需开发抗菌靶点新颖、效果确切的新型抗真菌药。选定治疗皮肤癣效果确切的中药民族药，应用现代研究手段确定其中抗T. rubrum活性物质，是寻找疗效好、抗真菌谱广、毒副作用低和不易致耐药的新型抗真菌药的重要方法[11]。
中草药活性单体是新药研发、药品制备的重要来源，在创新药物开发中发挥着重要的作用，通过GC-MS发现侧柏叶石油醚段浸膏中含量最高的3种活性单体分别为α-蒎烯、β-石竹烯和3-蒈烯，并发现α-蒎烯抗T. rubrum活性最强，MIC为32 μg·mL-1，与Cavaleiro等[27]和Fahed等[28]研究结果相似，随后，作者使用孢子萌发试验进一步验证α-蒎烯的抗T. rubrum活性，发现其1 MIC和2 MIC均能显著或极显著抑制孢子萌发，表明α-蒎烯是侧柏叶中主要的抗T. rubrum活性单体。为了初步探索α-蒎烯抗T. rubrum潜在靶点位置，作者采用了扫描电镜和透射电镜观察技术，扫描电镜观察到药物测试组T. rubrum菌丝体萎缩、表面粗糙、扭曲干瘪，并伴有多处凹陷；透射电镜结果显示，细胞膜发生严重破损、细胞内部结构无法清晰辨明和细胞膜内容物明显流出，这可能因为细胞膜内麦角甾醇合成受阻导致的细胞膜合成受阻[29]；胞内液泡增大，可能是菌体的一种解毒反应，即将药物收集于液泡内，隔离于其他细胞器[30]，这些现象表明，α-蒎烯抗T. rubrum的靶点可能存在于细胞膜，并且可能位于麦角甾醇合成通路。
为了验证α-蒎烯抗T. rubrum的靶点是否位于细胞膜和麦角甾醇通路，作者开展了细胞内容物流出率测定、流式细胞和麦角甾醇定性分析试验，发现随着α-蒎烯浓度的提升，T. rubrum细胞膜发生明显损伤和内容物流出、通透性极显著增加(P < 0.01)和24 h内细胞膜中麦角甾醇和24(28)脱氢麦角甾醇含量显著下降(P < 0.05)，表明α-蒎烯的作用靶点位于麦角甾醇合成路径。为了明确靶点，作者应用GC-MS技术分析α-蒎烯对T. rubrum甾醇型的影响，发现甾醇型中ERG3抑制相关的标志物“麦角甾烷-7, 24-二烯-3β-醇”色谱峰出现，这可能因为ERG3活性降低、含量降低，或者ERG3表达量降低；由于麦角甾醇合成通路的中间体结构异常相似，且ERG3与内质网膜紧密结合，导致蛋白分离困难、分离后不稳定，导致无法直接测定酶活性[31-32]，并且尚无商品化抗体，酶表达量无法通过试验获得，因此，仅对α-蒎烯是否影响ERG3表达量进行了qRT-PCR分析，发现ERG3基因的表达被极显著抑制(P < 0.01)，这一结果与甾醇型结果相符，另外，Martins等[33]、Hirayama等[34]和Ouyang等[35]有相似报道，即ERG3是多种霉菌和白色念珠菌的毒力因子或必须基因，常作为重要新药研发靶点，并且，ERG3不同于当前临床抗真菌药物的主要靶点，即ERG11、ERG1和ERG2[36]，提示α-蒎烯的抗T. rubrum靶点是新发现。
4 结论本研究证实α-蒎烯是侧柏叶中抗T. rubrum的主要活性成分，其能够通过降低麦角甾醇合成路径相关基因ERG3表达，引起T. rubrum细胞膜破坏，从而发挥抗T. rubrum作用，但其是否对ERG3量或活性产生影响，仍有待进一步研究。
| [1] |
TARTOR Y H, EL-NESHWY W M, MERWAD A M A, et al. Ringworm in calves: risk factors, improved molecular diagnosis, and therapeutic efficacy of an Aloe vera gel extract[J]. BMC Vet Res, 2020, 16(1): 421. DOI:10.1186/s12917-020-02616-9 |
| [2] |
LI D J, ZHOU Y F, LIU J B, et al. Prevalence investigation of dermatophytes in rabbits in Qingdao region, China[J]. J Anim Vet Adv, 2012, 11(7): 883-885. DOI:10.3923/javaa.2012.883.885 |
| [3] |
GUO Y N, GE S, LUO H F, et al. Occurrence of Trichophyton verrucosum in cattle in the Ningxia Hui Autonomous region, China[J]. BMC Vet Res, 2020, 16(1): 187. DOI:10.1186/s12917-020-02403-6 |
| [4] |
MORIELLO K A, COYNER K, PATERSON S, et al. Diagnosis and treatment of dermatophytosis in dogs and cats. clinical consensus guidelines of the world association for veterinary dermatology[J]. Vet Dermatol, 2017, 28(3): 266-e68. DOI:10.1111/vde.12440 |
| [5] |
MONOD M, FEUERMANN M, SALAMIN K, et al. Trichophyton rubrum azole resistance mediated by a new ABC transporter, TruMDR3[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2019, 63(11): e00863-19. |
| [6] |
李代军, 周玉法, 刘敬博, 等. 微卫星引物PCR快速鉴定兔皮肤病原真菌方法的建立及应用[J]. 畜牧兽医学报, 2012, 43(5): 779-784. LI D J, ZHOU Y F, LIU J B, et al. Development and application of microsatellite-primered PCR for rapidly identifying dermatophytes from rabbits[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2012, 43(5): 779-784. (in Chinese) |
| [7] |
AGNETTI F, RIGHI C, SCOCCIA E, et al. Trichophyton verrucosum infection in cattle farms of Umbria (Central Italy) and transmission to humans[J]. Mycoses, 2014, 57(7): 400-405. DOI:10.1111/myc.12174 |
| [8] |
侯志军, 张智杰, 刘伟石, 等. 毛皮动物饲养场饲养员感染貉源真菌病一例[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2010(20): 61. HOU Z J, ZHANG Z J, LIU W S, et al. The case of a keeper in fur animal breeding farm infect with raccoon dog dermatophytes[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine, 2010(20): 61. DOI:10.13881/j.cnki.hljxmsy.2010.20.052 (in Chinese) |
| [9] |
夏修蛟, 刘泽虎, 沈宏, 等. 64组家庭人畜共患皮肤癣菌病分析[J]. 中华皮肤科杂志, 2015, 48(3): 154-157. XIA X J, LIU Z H, SHEN H, et al. Analysis of zoonotic dermatophytoses in 64 family-based groups[J]. Chinese Journal of Dermatology, 2015, 48(3): 154-157. (in Chinese) |
| [10] |
ATANASOV A G, ZOTCHEV S B, DIRSCH V M, et al. Natural products in drug discovery: advances and opportunities[J]. Nat Rev Drug Discov, 2021, 20(3): 200-216. DOI:10.1038/s41573-020-00114-z |
| [11] |
LOPES A I, TAVARIA F K, PINTADO M E. Conventional and natural compounds for the treatment of dermatophytosis[J]. Med Mycol, 2020, 58(6): 707-720. DOI:10.1093/mmy/myz116 |
| [12] |
TRIFAN A, BOSTǍNARU A C, LUCA S V, et al. Honokiol and magnolol: insights into their antidermatophytic effects[J]. Plants (Basel), 2021, 10(11): 2522. |
| [13] |
LUO N X, JIN L, YANG C Q, et al. Antifungal activity and potential mechanism of magnoflorine against Trichophyton rubrum[J]. J Antibiot (Tokyo), 2021, 74(3): 206-214. DOI:10.1038/s41429-020-00380-4 |
| [14] |
LI Z J, ABULA A, ABULIZI A, et al. Ellagic acid inhibits Trichophyton rubrum growth via affecting ergosterol biosynthesis and apoptotic induction[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2020, 2020: 7305818. |
| [15] |
陆科闵, 王福荣. 苗族医学[M]. 贵阳: 贵州科技出版社, 2006. LU K M, WANG F R. Miao medicine[M]. Guiyang: Guizhou Science and Technology Publishing House, 2006. (in Chinese) |
| [16] |
HASHEMI S M, SAFAVI S A. Fumigant toxicity of essential oils of leaves and fruits of Platycladus orientalis to Lasioderma serricorne (F.)[J]. Biharean Biol, 2012, 6(1): 65-69. |
| [17] |
LIU W, SUN B Z, YANG M M, et al. Antifungal activity of crude extract from the rhizome and root of Smilacina japonica A. gray[J]. Evid-Based Complement Alternat Med, 2019, 2019: 5320203. |
| [18] |
DA X, NISHIYAMA Y, TIE D, et al. Antifungal activity and mechanism of action of Ou-gon (Scutellaria root extract) components against pathogenic fungi[J]. Sci Rep, 2019, 9(1): 1683. DOI:10.1038/s41598-019-38916-w |
| [19] |
NISHIYAMA Y, HASUMI Y, UEDA K, et al. Effects of micafungin on the morphology of Aspergillus fumigatus[J]. J Electron Microsc (Tokyo), 2005, 54(1): 67-77. DOI:10.1093/jmicro/dfh100 |
| [20] |
LIANG Y K, DUAN H B, ZHANG P, et al. Extraction and isolation of the active ingredients of dandelion and its antifungal activity against Candida albicans[J]. Mol Med Rep, 2020, 21(1): 229-239. |
| [21] |
LEE W, LEE D G. An antifungal mechanism of curcumin lies in membrane-targeted action within Candida albicans[J]. IUBMB Life, 2014, 66(11): 780-785. DOI:10.1002/iub.1326 |
| [22] |
ARTHINGTON-SKAGGS B A, JRADI H, DESAI T, et al. Quantitation of ergosterol content: novel method for determination of fluconazole susceptibility of Candida albicans[J]. J Clin Microbiol, 1999, 37(10): 3332-3337. DOI:10.1128/JCM.37.10.3332-3337.1999 |
| [23] |
MVLLER C, BINDER U, BRACHER F, et al. Antifungal drug testing by combining minimal inhibitory concentration testing with target identification by gas chromatography-mass spectrometry[J]. Nat Protoc, 2017, 12(5): 947-963. DOI:10.1038/nprot.2017.005 |
| [24] |
YU L, ZHANG W L, WANG L L, et al. Transcriptional profiles of the response to ketoconazole and amphotericin B in Trichophyton rubrum[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(1): 144-153. DOI:10.1128/AAC.00755-06 |
| [25] |
JORDÁ T, PUIG S. Regulation of ergosterol biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae[J]. Genes (Basel), 2020, 11(7): 795. DOI:10.3390/genes11070795 |
| [26] |
CHERMETTE R, FERREIRO L, GUILLOT J. Dermatophytoses in animals[J]. Mycopathologia, 2008, 166(5-6): 385-405. DOI:10.1007/s11046-008-9102-7 |
| [27] |
CAVALEIRO C, SALGUEIRO L, GONÇALVES M J, et al. Antifungal activity of the essential oil of Angelica major against Candida, Cryptococcus, Aspergillus and dermatophyte species[J]. J Nat Med, 2015, 69(2): 241-248. DOI:10.1007/s11418-014-0884-2 |
| [28] |
FAHED L, BEYROUTHY M E, OUAINI N, et al. Antimicrobial activity and synergy investigation of Hypericum scabrum essential oil with antifungal drugs[J]. Molecules, 2021, 26(21): 6545. DOI:10.3390/molecules26216545 |
| [29] |
BHATTACHARYA S, SAE-TIA S, FRIES B C. Candidiasis and mechanisms of antifungal resistance[J]. Antibiotics (Basel), 2020, 9(6): 312. |
| [30] |
WURMSER A E, GARY J D, EMR S D. Phosphoinositide 3-kinases and their FYVE domain-containing effectors as regulators of vacuolar/lysosomal membrane trafficking pathways[J]. J Biol Chem, 1999, 274(14): 9129-9132. |
| [31] |
KRISTAN K, RIŽNER T L. Steroid-transforming enzymes in fungi[J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 2012, 129(1-2): 79-91. |
| [32] |
MVLLER C, BINDER U, MAURER E, et al. Fungal sterol C22-desaturase is not an antimycotic target as shown by selective inhibitors and testing on clinical isolates[J]. Steroids, 2015, 101: 1-6. |
| [33] |
MARTINS M P, ROSSI A, SANCHES P R, et al. Comprehensive analysis of the dermatophyte Trichophyton rubrum transcriptional profile reveals dynamic metabolic modulation[J]. Biochem J, 2020, 477(5): 873-885. |
| [34] |
HIRAYAMA T, MIYAZAKI T, SUMIYOSHI M, et al. ERG3-encoding sterol C5, 6-DESATURASE in Candida albicans is required for virulence in an enterically infected invasive Candidiasis mouse model[J]. Pathogens, 2020, 10(1): 23. |
| [35] |
OUYANG Q L, LIU Y M, OKETCH O R, et al. Citronellal exerts its antifungal activity by targeting ergosterol biosynthesis in Penicillium digitatum[J]. J Fungi (Basel), 2021, 7(6): 432. |
| [36] |
RODRIGUES M L. The multifunctional fungal ergosterol[J]. mBio, 2018, 9(5): e01755-18. |
(编辑 白永平)