2. 西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室, 银川 750021
2. Key Laboratory of the Ministry of Education for the Conservation and Utilization of Special Biological Resources of Western China, Yinchuan 750021, China
念珠菌是一种人畜共患的条件性致病真菌，在免疫功能低下或菌群紊乱失衡的个体中，念珠菌极易造成机体感染，菌体由酵母相细胞转变成菌丝相细胞[1]，大量繁殖引起浅层真菌感染，分泌水解酶使其进一步入侵细胞造成深度真菌感染[2-3]。由于免疫抑制疗法、侵入性外科手术、广谱抗生素的广泛使用，导致念珠菌引起的感染率和死亡率不断上升[4-5]，与此同时，由于抗真菌药物的长期不规范使用，导致真菌的耐药现象越来越严重[6]，严重影响了人类的身体健康和畜牧业的发展。最近研究报道，真菌性奶牛乳房炎中克柔念珠菌等非白色念珠菌的检出率明显上升[7]，目前，克柔念珠菌(Candida krusei)的研究主要集中于其生物学特性、治疗药物的开发和逆转耐药性方面[8]，对于克柔念珠菌与宿主细胞相互作用的特征和机制研究较少。有研究表明，除直接侵入机体损伤组织细胞，细菌、原生动物、真菌还可以通过分泌细胞外囊泡释放毒力蛋白或其他因子与宿主细胞相互作用[9-13]。细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)是一种细胞分泌的膜性囊泡，在细胞生命进程的许多方面起重要作用，包括细胞间的通讯、发病机制和癌症进展[14-15]，根据产生机制和粒径大小分为3类：微囊泡、凋亡小体和外泌体[16]。3种类型的囊泡中，对外泌体的研究最为广泛。近几十年来，随着研究的深入，对外泌体的认识逐渐清晰，外泌体内容物包括核酸、蛋白质和脂质，其分泌在细菌、病毒和真菌感染的病理病变过程中较为普遍[10]，表明外泌体在各种生理与病理机制中均有十分重要的作用。在病原体感染中，外泌体能传播感染性蛋白质和病毒RNA，并改变未感染细胞的功能，这表明，外泌体可以影响引起感染性疾病的病原体与宿主细胞的相互作用关系[9, 11-12]。
14-3-3蛋白在所有真核细胞中广泛表达，通过不同的分子作用机制在众多细胞进程中起非常关键的作用，包括细胞生长与增殖、细胞分化、信号转导、细胞凋亡和转录调控等[17]。在真菌中，大多数真菌的14-3-3蛋白具有两种亚型，在酿酒酵母中，编码14-3-3蛋白家族只有2个成员，即Bmh1和Bmh2，二者绝大部分功能重叠且参与了细胞生长分化和转录调控[18-20]，特别是在假菌丝诱导和芽孢生长过程中起关键作用[21]。截至目前，真菌14-3-3蛋白与宿主细胞互作的研究尚未见报道，相关报道仅见于寄生虫，李珊等[22]研发现新孢子虫胞外囊泡rNc14-3-3蛋白能激活小鼠腹腔巨噬细胞MAPK、NF-κB/p65信号通路，促进炎性因子IL-12p40、IL-6和TNF-α的分泌。乳腺上皮细胞是病原感染乳腺的前沿，在对病原的免疫防御中起重要作用，利用奶牛乳腺上皮细胞可评价病原的感染机制，并为防制奶牛乳腺炎提供依据[23]。课题组前期研究发现，在克柔念珠菌外泌体中可溶性同源/异源二聚体14-3-3蛋白显著上调[24]，推测其在克柔念珠菌感染宿主细胞时可能发挥重要作用，但其对宿主细胞的损伤特征及机制尚未明晰。本试验通过明确rCK14-3-3作用MAC-T后炎症反应的分子机制，以确证rCK14-3-3是否为引起MAC-T炎症的重要因子，为深入研究克柔念珠菌损伤奶牛乳腺上皮细胞的机制提供依据。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 菌株、质粒和细胞 克柔念珠菌(Candida krusei)ATCC6258购自美国ATCC菌种保藏中心；大肠杆菌BL21表达宿主菌、pET21a表达载体均购自TaKaRa公司；奶牛乳腺上皮细胞系MAC-T由宁夏大学王东老师惠赠。
1.1.2 试剂 沙氏琼脂培养基和YPD培养基购自青岛海博生物公司；酵母基因组DNA提取试剂盒(DP307)、DNA纯化回收试剂盒(DP214)、质粒小提试剂盒(DP103)均购自天根生化科技(北京)有限公司；dNTP Mixture、T4 DNA连接酶、限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ、鼠源抗His抗体、HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体购自TaKaRa公司；蛋白纯化试剂盒His.Band Purification Kit购自Novagen公司；Cell Counting Kit-8试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；DMEM-F12和胎牛血清(FBS)购自Gibico公司，BCA蛋白含量检测试剂盒购自南京凯基生物公司；DNA Marker(SM033)、蛋白Marker(26616)购自Thermo公司；10×蛋白电泳缓冲液、转膜液购自上海雅酶生物科技有限公司；PVDF膜购自Millipore公司；TLR4 (bs-20594R)、TLR2 (bs-1019R)、ERK1/2 (bs-0022R)、p-ERK1/2 (bs-1522R)、JNK (bs-2592R)、p-JNK(bs-1640R)、p-IκB-α (bs-5517R)、p65(bs-23217R)一抗均购自北京博奥森生物科技有限公司，MyD88(NB100-56698)购自NOVUSBIO，p38(ab31828)、IκB-α (ab230901)一抗、HRP标记的山羊抗鼠二抗(ab205719)购自Abcam公司，p-p38一抗(MA5-15182)购自ThermoFisher公司，p-p65(#3033)、β-actin(4970S)一抗购自CST公司，HRP标记的山羊抗兔二抗(中山金桥，ZB-2301)。超敏ECL化学发光试剂盒购自PerkinElmer公司。牛源IL-1β(KT95638)、IL-6(KT56124)、IL-12(KT22403)、IL-18(KT55126)、TNF-α(KT56125)、IFN-γ(KT36476) ELISA检测试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司。
1.2 方法1.2.1 BMH1基因的克隆与原核表达载体的构建 按照天根酵母基因组DNA提取试剂盒说明书的步骤提取克柔念珠菌ATCC6258的基因组DNA，PCR扩增BMH1基因，引物见表 1(引物由上海生工生物工程公司合成)。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环，72 ℃ 7 min，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。目的基因与酶切载体pET21a 4 ℃过夜连接，然后转化入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，经含有氨苄青霉素的培养基筛选阳性菌落，抽提质粒后进行NdeⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定及基因测序。
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表 1 BMH1基因PCR扩增反应引物 Table 1 The primers of BMH1 for PCR |
1.2.2 rCK14-3-3蛋白的诱导条件筛选 挑取经过鉴定的阳性单克隆菌落接种于含有50 μg·mL-1氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃培养至OD值=0.6时，添加诱导剂IPTG至终浓度为0.5 mmol·L-1，分别如下操作：于20 ℃诱导过夜，或37 ℃诱导6 h，以不添加IPTG的为阴性对照，4 ℃ 4 000 r·min-1离心10 min收集菌体，PBS缓冲液重新悬浮收集到的菌体，超声破碎，离心收集上清和沉淀，沉淀使用500 μL包涵体溶解液溶解，分别取上清和沉淀蛋白40 μL与10 μL5×Protein loading buffer混匀，沸水浴10 min，然后进行SDS-PAGE检测。
1.2.3 rCK14-3-3蛋白的诱导表达及纯化 将菌液按照1∶100比例接种于1 L含50 μg·mL-1氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃培养至OD值=0.6时，添加终浓度为0.5 mmol·L-1 IPTG，20 ℃诱导过夜，离心收集细菌菌体，将收集的细菌菌体用破碎Buffer(50 mmol·L-1 Tris, 300 mmol·L-1 NaCl, 0.1% Triton X-100, 0.2 mmol·L-1 PMSF, 0.2%Triton X-114, pH 8.0)溶解、冰浴中超声破碎，离心(12 000 r·min-1，4 ℃，20 min)收集上清，按照蛋白纯化试剂盒His.Band Purification Kit操作说明纯化表达产物，并进行SDS-PAGE检测。
1.2.4 rCK14-3-3蛋白浓度检测 将纯化后的rCK14-3-3重组蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，270 mA、110 min湿转至PVDF膜，37 ℃封闭2 h后，以鼠源抗His单克隆抗体为一抗(1∶1 000稀释)过夜孵育，以HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体为二抗(1∶10 000稀释)，37 ℃缓慢振荡1 h后，进行ECL化学发光检测。Western blot鉴定后，用BCA法确定重组蛋白的浓度，具体操作按照BCA蛋白含量检测试剂盒说明书进行。
内毒素检测：按照内毒素检测试剂盒使用说明，在波长λ=545 nm下检测，最终纯化蛋白的内毒素水平在1 EU·μg-1以内。
1.2.5 MAC-T培养 将冻存的MAC-T于37 ℃水浴融化后收集至10 mL离心管中，1 000 r·min-1离心10 min，弃上清，用含有10%胎牛血清的DMEM-F12细胞培养液重悬细胞，传代2~3代至细胞活力达到95%以上时，将细胞按照试验所需的使用量接种至培养皿，置于37 ℃、5%恒温细胞培养箱中培养。
1.2.6 CCK-8法检测rCK14-3-3蛋白对MAC-T活性的影响 将MAC-T培养至对数生长期后用0.25%胰酶消化并收集细胞，用无双抗无血清的培养液DMEM-F12培养液重悬细胞并计数，按1.0×104·孔-1接种于96孔板，过夜贴壁后，弃上清，PBS洗3次后，分别使用3.125、6.25、12.5、25、50 μg·mL-1的rCK14-3-3处理细胞，同时设置空白对照组，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养细胞0、1、3、6、12、24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培养箱中孵育4 h，用酶标仪检测各孔OD450 nm值，每组6个平行，根据公式计算细胞活力，公式：细胞活力%=[(Ab试验孔-Ab空白孔)/(Ab对照孔-Ab空白孔)]×100 %。
1.2.7 MAC-T的Toll样受体及炎症信号通路相关蛋白表达检测 按照全蛋白提取试剂盒提取rCK14-3-3各处理组MAC-T的全蛋白，按BCA蛋白定量检测试剂盒说明书对其进行定量，然后进行SDS-PAGE电泳，湿转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入特异性一抗(TLR2、TLR4、MyD88、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、p38、p-p38、IκBα、p-IκBα、p65、p-p65)，4 ℃过夜孵育，后用PBST漂洗3次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的相应二抗，室温孵育1 h，用PBST漂洗3次，每次10 min，用ECL底物显色，蛋白成像系统曝光。
1.2.8 ELISA法检测MAC-T细胞因子的分泌量 MAC-T细胞经过50 μg·mL-1的rCK14-3-3处理1、3、6 h后，收集细胞上清液，3 000 r·min-1离心10 min，取上清为待测样品。按照ELISA试剂盒说明书详细操作步骤进行测定，计算IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、TNF-α、IFN-γ的相对表达量。
1.2.9 统计学分析 数据用Graphpad Prism5.0软件中One-Way ANOVA进行统计分析，所有数据用“平均数±标准差(x±s)”表示，最终应用GraphPad Prism 5.0软件作图。以P＜0.05表示差异有统计学意义，且P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。
2 结果 2.1 BMH1基因的克隆与原核表达载体的构建根据设计的BMH1基因的引物对克柔念珠菌ATCC6258进行PCR扩增获得预期大小(762 bp)的片段，结果如图 1A所示。重组的pET-21a-BMH1质粒分别经NdeⅠ、XhoⅠ双酶切后，凝胶电泳显示出两条条带，其中较小的条带与目的基因大小相符，结果如图 1B，表明BMH1基因已成功连接到pET-21a表达载体。构建的pET-21a-BMH1表达载体经序列全自动分析测序，与GenBank收录的克柔念珠菌BMH1序列高度同源。
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A.BMH1基因PCR产物电泳；B.重组表达载体pET-21a-BMH1的双酶切产物电泳图。M. DNA相对分子质量标准；1.BMH1基因PCR产物；2.pET-21a-BMH1的NdeⅠ、XhoⅠ双酶切 A. Electrophoresis of PCR products of BMH1; B. Electrophoresis of recombinant expression vector pET-21a-BMH1 digested by double enzymes. M. DNA marker; 1. PCR product of BMH1; 2. pET-21a-BMH1 digested by NdeⅠ and XhoⅠ 图 1 BMH1基因克隆与原核表达载体构建的鉴定 Fig. 1 Clone of BMH1 and construction of recombinant expression vector |
将含有重组质粒的细菌经IPTG诱导表达制备蛋白样品后，SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色检测蛋白表达情况，20 ℃诱导过夜表达后，发现上清中可见清晰的蛋白条带，表明其为可溶性蛋白，结果如图 2A所示。纯化结果如图 2B所示，融合蛋白经过Ni-NTA纯化，在30 ku处出现与预期相符的表达条带，成功获得纯度较好的蛋白样品；将SDS-PAGE凝胶放置在凝胶成像系统中进行灰度扫描分析，结果显示纯度在90%以上。
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A. pET-21a-BMH1表达产物SDS-PAGE分析(M. 蛋白质相对分子质量标准；1.诱导前总蛋白；2. 20 ℃上清；3. 20 ℃沉淀；4. 37 ℃上清；5. 37 ℃沉淀)；B. 融合蛋白镍琼脂糖亲和层析纯化SDS-PAGE分析(M.蛋白质相对分子质量标准；1. 上样；2. 流出；3~5. 20、50、500 mmol·L-1 imidazole洗脱组分) A. Confirmation of pET-21a-BMH1 expression with SDS-PAGE (M. Protein marker; 1. Total protein before induction; 2. 20 ℃'s supernatant; 3. 20 ℃'s precipitation; 4. 37 ℃'s supernatant; 5. 37 ℃'s precipitation); B. SDS-PAGE analysis plot of fusion protein nickel-agarose affinity chromatography (M. Protein marker; 1. Upper sample; 2. Efflux fluid; 3-5. 20, 50, 500 mmol·L-1 imidazole elution components) 图 2 目的蛋白的诱导表达与纯化 Fig. 2 Expression and purification of pET-21a-BMH1 |
对rCK14-3-3蛋白进行鉴定，结果如图 3A所示，在预期位置有特异性条带，显示重组蛋白的分子量在30 ku左右。如图 3B所示，带His标签的重组蛋白经Western blot验证与预期相符。BCA蛋白定量检测rCK14-3-3的浓度为0.2 mg·mL-1。
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M. 蛋白质相对分子质量标准；1. 纯化的重组蛋白rCK14-3-3 M. Protein marker; 1. Purified recombinant protein14-3-3 图 3 纯化重组14-3-3蛋白的SDS-PAGE(A)和Western-blot(B)分析图 Fig. 3 SDS-PAGE (A) and Western-blot (B) analysis purified recombinant protein 14-3-3 |
通过CCK-8法测定了不同浓度的蛋白及不同作用时间对MAC-T活力的影响。结果如图 4所示，与各时间点的空白对照比较，在作用6 h时，rCK14-3-3浓度低于50 μg·mL-1时不影响细胞活力，在50 μg·mL-1时细胞存活率极显著低于未处理组(P < 0.01)。因此，rCK14-3-3作用于MAC-T的浓度选择50 μg·mL-1，作用时间选择1、3、6 h。
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*.P < 0.05, **.P < 0.01 图 4 rCK14-3-3对MAC-T毒性的影响 Fig. 4 The toxicity of rCK14-3-3 to MAC-T |
通过Western blot测定TLR2、TLR4、MyD88蛋白的表达水平及活性。结果如图 5所示，与对照组相比，rCK14-3-3作用MAC-T 1、3 h时，TLR2、TLR4、MyD88表达量极显著升高(P < 0.01)，作用MAC-T 6 h时，TLR4表达量显著降低(P < 0.05)，TLR2、MyD88表达量无显著变化(P>0.05)。
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*. P < 0.05, **.P < 0.01 图 5 rCK14-3-3对MAC-T Toll样受体相关蛋白表达 Fig. 5 Effects of rCK14-3-3 protein on the expression of key molecules in TLR signaling pathway in MAC-T |
通过Western blot测定MAPK信号通路相关蛋白的表达量及活性。结果如图 6所示，与对照组相比，rCK14-3-3作用MAC-T后，1 h时p-JNK的表达量无显著变化(P>0.05)，3、6 h时极显著降低(P < 0.01)；1、3、6 h时p-ERK的表达量显著或极显著(P < 0.05, P < 0.01)升高，1 h时p-p38的表达水平极显著降低(P < 0.01)，3、6 h时极显著升高(P < 0.01)。
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*.P < 0.05, **. P < 0.01 图 6 rCK14-3-3对MAC-T MAPK信号通路相关蛋白表达 Fig. 6 Effects of rCK14-3-3 protein on the expression of key molecules in MAPK signaling pathway in MAC-T |
通过Western blot测定NF-κB信号通路相关蛋白的表达量及活性。结果如图 7所示，与对照组相比，rCK14-3-3作用MAC-T后，1、3、6 h时p-IκBα、p-p65的表达量均极显著升高(P < 0.01)。
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*. P < 0.05, **. P < 0.01 图 7 NF-κB信号通路相关蛋白表达 Fig. 7 Effects of rCK14-3-3 protein on the expression of key molecules in NF-κB signaling pathway in MAC-T |
本试验采用ELISA试剂盒检测rCK14-3-3蛋白对MAC-T分泌炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、IL-18、TNF-α、IFN-γ的影响，结果如图 8所示。与对照组相比，rCK14-3-3处理组中IFN-γ、IL-18、TNF-α和IL-1β在作用1、3、6 h时均呈现出显著或极显著的上调趋势(P < 0.05或P < 0.01)；IL-6在作用1、3 h时极显著上升(P < 0.01)，6 h时显著降低(P < 0.05)；IL-12作用1 h时极显著上升(P < 0.01)，3、6 h时极显著降低(P < 0.01)。
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A.IFN-γ；B. IL-18；C. TNF-α；D. IL-1β；E. IL-6；F. IL-12；*.P < 0.05, **. P < 0.01 图 8 rCK14-3-3蛋白对MAC-T中细胞炎性因子的影响 Fig. 8 Effects of rCK14-3-3 protein on inflammatory cytokines in MAC-T |
克柔念珠菌是一种致病性和毒力均低于白色念珠菌的条件致病菌，但其细胞表面疏水性较强，可寄居无生命物质表面，通过黏附与入侵引起侵袭性感染，常常引起人类和动物的真菌性疾病。由于克柔念珠菌对氟康唑天然耐药，导致其研究主要集中于治疗药物开发和逆转其耐药性方面，对于克柔念珠菌与宿主细胞相互作用特征及机制研究较少，克柔念珠菌中的主要致病因子或蛋白尚未明晰。
外泌体是具有生物学活性的细胞外囊泡，包含蛋白质、核酸、脂质和miRNA等特定的生物活性物质[25]，多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。外泌体可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类和miRNA等成分来调节受体细胞的生物学活性，介导宿主的炎症、免疫反应[26]。在抗原刺激下，巨噬细胞和树突状细胞会分泌含有IL-1β、caspase-1和炎症小体的EVs[27]；巨噬细胞EVs中的磷脂作为生物活性成分激活其他暴露的巨噬细胞上的TLR4，进而促进炎性反应[28]。近年来，对于外泌体中特定生物活性物质的功能和机制研究逐渐深入，其中，14-3-3蛋白与宿主细胞互作的探索也已开启。巨型吸虫的14-3-3蛋白刺激山羊PBMCs，导致IL-10、TGF-β的表达水平均显著升高，IL-4、IFN-γ的表达水平均显著降低[29]。李珊[30]研究发现新孢子虫能分泌胞外囊泡(NEVs)，进一步研究发现，NEVs中14-3-3蛋白高表达，通过原核表达及纯化获得具有生物学活性的rNC14-3-3蛋白，用50 μg·mL-1的rNC14-3-3蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞24 h后可触发炎性反应。本试验采用原核表达的方法同样可获得具有生物学活性rCK14-3-3蛋白，用50 μg·mL-1 rCK14-3-3蛋白作用1 h后即可触发MAC-T细胞的炎性反应。上述结果表明，原核表达是获得真菌与寄生虫重组14-3-3蛋白的一种有效方法，获得的重组14-3-3蛋白均具有生物学活性，且可诱发宿主细胞的炎性反应。
乳腺上皮组织是抵御病原菌入侵后的第一道防线，MAC-T通过Toll等模式识别受体可识别病原体相关模式分子(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)，调节一系列炎性因子的分泌，主动参与免疫应答[31]。Toll样受体(TLRs)是宿主细胞上的关键模式识别受体(PRRs)，是先天免疫应答的重要组成部分[32]。已有研究表明，上皮细胞可以通过TLR或CLR识别念珠菌病原相关分子模式(PAMPs)，其中，主要通过TLR2和TLR4来进行识别，通过激活NF-κB信号通路的p65/p50转录因子，JNK和ERK1/2信号通路的c-Jun转录因子和PI3K信号通路的AKT(蛋白激酶B)和mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)，进一步激活NF-κB、MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT信号通路，诱导细胞活化，产生TNF-α、IL-lβ、IL-6、IL-8、IL-12等炎性细胞因子[33]，从而调控上皮细胞的炎性反应和凋亡[34-35]。Nguyen等[36]研究发现，克柔念珠菌细胞表面的甘露聚糖能够通过TLR-2/MyD88依赖的信号通路引起树突状细胞凋亡，并通过IL-6、IL-12来调控Th1/Th17的适应性免疫应答。李珊[30]研究发现，新孢子虫rNC14-3-3可以诱导小鼠腹腔巨噬细胞p38、ERK、JNK、p65和IκBα发生磷酸化，并且这种磷酸化不需要TLR2的参与，表明新孢子虫14-3-3蛋白可通过激活MAPK和NF-κB信号通路调节小鼠腹腔巨噬细胞的免疫应答。本研究用50 μg·mL-1 rCK14-3-3蛋白作用MAC-T，可以激活TLR2和TLR4，MAPK和NF-κB信号通路中p38、ERK、p65和IκBα发生磷酸化，而JNK磷酸化表达量未显著升高甚至降低，推测rCK14-3-3蛋白能激活MAC-T细胞NF-κB、p38和ERK信号通路，但不能激活JNK信号通路。MAPK通路中p38和JNK都与细胞的炎症、凋亡有关，但在本试验中结果却不一致，为保证试验数据的准确性，下一步将开展p38、ERK、JNK特异性抑制剂的验证试验；前期实验室研究证实，克柔念珠菌感染MAC-T后，TLR2/ERK/NF-κB信号通路参与了细胞炎症反应的调控[24]，至于本试验中p38、ERK和NF-κB信号通路的激活是否依赖TLR2和TLR4，有待后续试验进一步分析确定。在14-3-3蛋白引起细胞炎性反应的相关文献中，用连续浓度的rFg14-3-3e蛋白刺激山羊PBMCs，IL-10、TGF-β的表达水平均显著升高，IL-4、IFN-γ的表达水平均显著降低[29]；用50 μg·mL-1 rNC14-3-3蛋白刺激24 h后能明显激活小鼠腹腔巨噬细胞IL-12p40、IL-6和TNF-α的产生[30]；在外源性14-3-3ζ的存在下，PBMC IFN-γ和IL-17表达水平显著升高[37]；用重组的14-3-3e刺激来自THP1细胞系的人巨噬细胞24 h后，可诱导IL-6和TNF-α的表达显著升高[38]。本试验用50 μg·mL-1 rCK14-3-3蛋白作用MAC-T后，IL-1β、IFN-γ、IL-18、TNF-α表达水平均显著升高，而IL-6、IL-12表达水平先显著升高，然后显著降低。以上研究表明，不同物种的重组14-3-3作用于不同的宿主细胞导致分泌的细胞因子的种类、水平存在差别[39]。目前，对于念珠菌感染，国内外仍然缺乏安全有效的预防或治疗措施。本文对念珠菌14-3-3蛋白的特性和免疫调节作用进行研究，结合后续开展的动物念珠菌性乳房炎模型数据分析，深入了解念珠菌与宿主细胞之间的免疫应答机制，为进一步发掘潜在的疫苗靶点及控制念珠菌感染的有效方法提供理论依据。
4 结论通过原核表达获得了具有生物学活性的rCK14-3-3蛋白，rCK14-3-3蛋白可以通过激活TLR2/4-MAPK/NF-κB信号通路来诱导奶牛乳腺上皮细胞进行有效的免疫应答，引起炎症反应，导致促炎细胞因子的表达水平升高。
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(编辑 白永平)